振动强耦合对葡萄糖氧化酶在电化学催化反应中的调控研究

Research on the Regulation of Glucose Oxidase in Electrochemical Catalysis under Vibrational Strong Coupling

摘要: 振动强耦合(Vibrational Strong Coupling, VSC)通过光–物质相互作用可以改变分子能级和反应势垒，以此调控多种生化反应。电化学对电极表面的电子转移过程具有较高的灵敏度，但将VSC与电化学结合以调控生物催化反应的相关研究仍然有限。本研究以葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase, GOD)在法布里珀罗(FP)腔内催化葡萄糖的氧化反应为模型，构建了电化学-FP腔体系，系统研究了FP腔与水的O-H伸缩振动(3409 cm⁻¹)耦合对该反应的影响。结果表明，通过调谐FP腔与水分子的耦合强度，GOD的催化率最高被抑制至原来的37% (抑制率达63%)，且在不同耦合强度下，GOD的催化率与水的O-H伸缩振动带密切相关。这项工作不仅揭示了VSC对生物电化学反应的调控作用，也表明电化学可用于实时监测FP腔内的反应过程，为VSC在生物电化学体系中的应用提供了新的实验证据。

Abstract: Vibrational Strong Coupling (VSC) can modulate molecular energy levels and reaction barriers through light-matter interactions, thereby regulating biochemical reactions. Although electrochemistry is highly sensitive to electron transfer at electrode interfaces, studies combining VSC with electrochemistry to control biocatalytic reactions remain limited. Here, glucose oxidation catalyzed by Glucose Oxidase (GOD) within a Fabry-Pérot (FP) cavity was used as a model system, and an electrochemical FP-cavity platform was established to investigate the effect of coupling between the FP cavity and the O-H stretching vibration of water (3409 cm⁻¹). By tuning the coupling strength, GOD catalytic activity was suppressed to as low as 37% of its original rate (maximum inhibition of 63%), and the catalytic rate showed a clear correlation with the water O-H stretching band under different coupling conditions. These findings reveal the regulatory effect of VSC on bioelectrochemical reactions and demonstrate that electrochemistry can be used for real-time monitoring of reactions within the FP cavity, providing new experimental evidence for the application of VSC in bioelectrochemical systems.

1. 引言

振动强耦合(Vibrational Strong Coupling, VSC)是一种基于量子电动力学的物理调控手段。通过将分子振动模式与光学微腔(如法布里–珀罗腔)中的光子模式进行强耦合，可形成混合光–物质态(极化激元)，在光谱上表现为出现两个极化子吸收峰，分别为P+和P− [1]。这种能级重构不仅会改变分子基态与激发态的能量分布，还可能影响反应过渡态的能垒，从而调控化学反应的速率与选择性。近年来，VSC已被广泛应用于酶催化、ATP水解、DNA自组装及其他生物化学过程中[2]-[4]，展现出在调控反应动力学、选择性以及能量传递效率方面的巨大潜力。

电化学作为研究电子转移过程的重要工具，通过在外加电场作用下诱导氧化还原反应，可实时监测反应过程中的电子传递行为，具有高灵敏度、高时间和空间分辨率及良好的可控性[5]。在电化学界面中，电子转移不仅是许多生物能量过程(如呼吸链和ATP合成)的核心，也在生物传感、抗氧化活性检测及催化反应中扮演关键角色[6]-[8]。将电化学系统与光学微腔结合，构建电化学–光学耦合平台，为实现对生物氧化还原反应的实时监测和调控提供了新的可能，但目前此类研究报道仍相对有限。

在本研究中，我们探讨了GOD在FP腔内催化葡萄糖的氧化还原过程。并利用电化学手段原位检测VSC强度对腔内反应的调控效应。结果表明，在共振耦合条件下，加入GOD后的电流增量(ΔI)随VSC耦合强度变化明显，与非共振条件相比，GOD的催化效率最大被抑制达63%。这项工作不仅为揭示VSC调控电化学反应的微观机制提供了直接实验证据，也为开发新型光控电化学传感器、高效能量转换装置及光调控生物催化系统奠定了理论基础，同时为未来跨学科应用提供了重要参考。

2. 实验材料与方法

当分子的振动或电子跃迁频率与光学微腔的光子模式频率发生共振时，会出现光–物质杂化并形成强耦合现象，从而产生两种兼具光与物质特性的极化态——上极化激元(P+)和下极化激元(P-) (图1(a))。这两个态因真空拉比分裂而在能量上分开，其本质来源于分子振动或电子跃迁与腔光子模式之间的量子杂化。在法布里–珀罗(FP)微腔中，当分子的振动跃迁频率(${\omega }_m$ )与腔模频率(${\omega }_c$ )共振时(图1(b))，如果光子在镜面间的反射过程中被分子多次吸收，其交换速率远大于材料(γ)与腔体(κ)的损耗率，就会形成稳定的光–物质强耦合态[9][10]。

Figure 1. Schematic diagram generated by VSC. (a) Coupling of the O-H stretching vibration of water with the cavity mode; (b) Schematic diagram of the resonance coupling of O-H vibration with frequency ${\omega }_{m }$ and cavity mode with frequency ${\omega }_c$ in the FP cavity

图1. VSC产生的示意图。(a) 水的O-H伸缩振动与腔模的耦合；(b) 在FP腔中，频率为${\omega }_m$ 的O-H振动与频率为${\omega }_c$ 的腔模共振耦合示意图

法布里–珀罗(FP)腔的核心结构由两块平行的氟化钙(CaF₂)窗口片(秦皇岛固晶科技有限公司，中国)及微米级聚酯薄膜间隔片(LGC Ltd)组成[11]。上窗口片设计有两个小孔，分别作为液体注入口和出口。其制备流程如下：

首先，使用离子溅射仪(SBC-12，北京科宇真空技术有限公司)在两个窗口片的任意一面镀覆金膜，以形成高反射镜面。随后，在下窗口片的侧面镀上一条约1 cm长的金层，用于与正面金膜导通，并通过万用表测试导通情况(蜂鸣声表示导通成功)。若为酶体系，还需使用旋涂仪(KW-4T，北京赛奥特科技有限公司)在下窗口片上滴加20 μL、浓度为6 mg/mL的GOD溶液。对于上窗口片，无论是否含酶体系，都需在其镀金表面旋涂一层聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA，上海金穗生物科技有限公司)，以防止金膜在后续实验中脱落并造成干扰。之后，将处理后的两片窗口片以镀金面相对的方式对齐，中间夹入厚度为3.6 μm的Mylar间隔片，并用胶带将电线连接至下窗口片侧面镀金部分，从而组装成作为工作电极的电化学-FP微腔。上下窗片与间隔片所夹持的空间即为化学反应进行的微腔室(FP腔及组件见附录图S1、S2)。

图2所示为电化学-FP微腔的工作原理：图2(a)为上下窗片均镀金的共振耦合条件，图2(b)为仅下片镀金的非共振耦合条件。反应液通过注射器从注液口注入微腔室，并从出液孔流出至外部大溶液体系，与对电极和参比电极形成三电极系统。为防止反应液渗出至顶部镀金电线造成误差，两个CaF₂窗片之间的缝隙需用PDMS涂抹密封。实验结束后，电化学-FP腔必须拆卸清洗，并重新镀金组装，不能重复使用。

Figure 2. Working principle diagram of the FP cavity. (a) Electrochemical FP structure under resonant coupling conditions; (b) Electrochemical FP structure under non-resonant coupling

图2. FP腔的工作原理图。(a) 共振耦合条件下的电化学FP结构；(b) 非共振耦合下的电化学FP结构

电化学-FP腔组装完成后，首先将其置于傅里叶变换红外光谱仪中(扫描范围：7000~500 cm⁻¹，分辨率：2 cm⁻¹)进行透射光谱测量。通过旋紧或松开四个螺丝调整腔距，观察透射光谱是否呈现高而窄、且规律分布的峰，此时FP腔即达到较高的品质因子(Q-factor)。腔距L可通过以下两个基本公式进行计算：

$v_m=\frac{{10}^4\text{m}}{2nL}$ (1)

$L_1=\frac{{10}^4\text{m}}{2n*FSR}$ (2)

其中$L、m、n、\nu$ 分别表示腔的物理长度(μm)、腔模阶数(1, 2, 3…)、腔内介质折射率以及第m阶腔模对应的波数(cm⁻¹)。自由光谱范围(FSR)定义为相邻腔模峰之间的波数间隔，当m = 1时，由公式(1)计算得到的特定腔长$L_1$ 是实现VSC的最佳条件。

实验所用试剂及来源如下：葡萄糖氧化酶(GOD，100单位/mg，来源：黑曲霉)购自上海麦金林生化有限公司；D-(+)-葡萄糖、铁氰化钾(K₃Fe(CN)₆)及氯化钾(KCl)购自上海泰坦科技股份有限公司；PBS (1X，预混颗粒，pH = 7.4)购自亚玛迪斯生命科学公司。

实验开始前，首先配制pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)，该溶液含有1 mM的葡萄糖(C₆H₁₂O₆)、2 mM的K₃Fe(CN)₆)和0.1 M的KCl。随后，使用注射器将葡萄糖溶液从注液口注入已调制的FP腔微腔室内，直至溶液从出口流出并进入外部大溶液系统。

电化学测试使用CHI6650E电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)进行。以GOD修饰的窗口片作为工作电极，铂(Pt)电极作为对电极，银/氯化银(Ag/AgCl)电极作为参比电极，采用计时电流法(IT)原位检测腔内VSC对GOD催化作用的影响。IT测试电压设定为0.7 V，测量时间为300 s，记录稳定电流值。随后在相同腔距下，分别计算共振条件与非共振条件下加入酶后的电流增量(ΔI)。

需要说明的是，非共振条件仅通过腔距变化实现，用于对比和评估共振条件对GOD催化活性的影响。每个腔距的实验均重复三次，并在25℃恒温水浴中完成，以降低实验误差。

3. 实验结果与分析

本实验选择了水的O-H伸缩振动跃迁与5阶(m = 5)腔模式耦合，以实现共振强耦合策略，并重点研究了3409 cm⁻¹处的O-H振动(红外透射光谱见附录图S3)。根据公式(1)和(2)可知，为最大程度增强水分子与光腔的耦合强度，FSR应调控至909 cm⁻¹，对应的腔距约为5.5 μm，即振动强耦合点。在该腔距下，空腔的红外透射光谱如图3(a)所示，表现出较高的品质因子。当注入反应液后，水分子与腔模式发生耦合，光谱出现两个极化子态(P+和P−)，其真空拉比分裂值达到720 cm⁻¹ (图3(b))，超过了O-H振动模式的线宽(439 cm⁻¹，半高宽)，表明基于O-H拉伸振动的VSC已成功建立[12]。

(a) (b)

Figure 3. Rabi splitting under VSC. (a) IR transmission spectrum of the cavity at a cavity distance of 5.5 μm; (b) IR transmission spectrum of Rabi splitting produced by injecting water into the FP cavity

图3. VSC下的拉比分裂。(a) 腔距为5.5 μm时空腔的红外透射光谱；(b) 向FP腔注入水后产生拉比分裂的红外透射光谱

以下测量结果均比较了共振与非共振条件下300 s时的电流。图4(a)和图4(b)分别展示了腔距为5.5 μm时，在共振条件和非共振条件下加入GOD前后的IT曲线。需要说明的是，图4中的IT曲线均基于三次实验结果处理后重新绘制，以减少实验误差。

(a) (b)

Figure 4. Comparison of IT curves before and after adding GOD. (a) IT curves under resonant coupling condition with cavity spacing of 5.5 μm; (b) IT curves under non-resonant coupling condition with cavity spacing of 5.5 μm

图4. 加入GOD前后的IT曲线对比。(a) 共振耦合条件下，腔距为5.5 μm的IT曲线；(b) 非共振耦合条件下，腔距为5.5 μm时的IT曲线

由于5.5 μm (3409 cm⁻¹)为共振强耦合点，接着我们选用了5.3 μm (3538 cm⁻¹)、5.1 μm (3677 cm⁻¹)、5.7 μm (3290 cm⁻¹)和5.9 μm (3178 cm⁻¹)作为弱耦合与之进行比较；图5(a)显示了共振条件下由IT曲线绘制的柱状图，图5(b)则对应非共振条件。对GOD的催化效果，我们把加酶后电流增量记为ΔI，并在共振和非共振状态下分别进行监测；结果表明，当腔距在5.1~5.9 μm之间变化时，共振条件下的ΔI随耦合强度而变化，而非共振条件下的ΔI则随光程长度呈线性变化(图5(c))。其中，在3409 cm⁻¹腔模下，共振与非共振的ΔI差异最大，说明此时抑制作用最显著。这些结果与振动模式通过与光子腔耦合改变势能格局的机理相一致。

通过调节水分子与FP腔模式之间的共振耦合强度，可以有效调控GOD的催化率。GOD的催化率通过共振与非共振条件下ΔI的比值来计算。结果显示，当腔模式在3100~3700 cm⁻¹范围内变化时，3409 cm⁻¹条件下的催化率最低，仅为37%，即VSC对葡萄糖氧化反应的抑制率达到63%，此处VSC效果最强。当腔模波数偏高(3538 cm⁻¹: 58%; 3677 cm⁻¹: 74%)或偏低(3290 cm⁻¹: 51%; 3178 cm⁻¹: 72%)时，GOD的催化率逐渐升高，表明VSC的抑制作用减弱。这一趋势与远离水的O-H振动带后腔–分子耦合减弱的现象相一致(图5(d))。

GOD的催化活性中心为黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，其催化循环包含两个关键步骤：第一氧化阶段，

(a) (b)

(c) (d)

Figure 5. Modulation of GOD catalytic activity by VSC. (a) IT results at 5.1~5.9 μm lumen spacing under resonant coupling. (b) IT results at 5.1~5.9 μm lumen spacing under non-resonant coupling. (c) ΔI values after adding GOD at different cavity pitches. (d) Catalytic rate of GOD at different cavity mode wave numbers

图5. VSC对GOD催化活性的调控。(a) 共振耦合下5.1~5.9 μm腔距的IT结果。(b) 非共振耦合下5.1~5.9 μm腔距下的IT结果。(c) 不同腔距下加入GOD后的ΔI值。(d) 不同腔模波数下GOD的催化率

GOD的氧化形式(GOD_o，含FAD)从葡萄糖分子获取两个电子和两个质子，被还原为GOD_r (含FADH₂)，同时葡萄糖被氧化；第二再氧化阶段，GOD_r需将电子转移至最终受体氧气(O₂)，使其还原为过氧化氢(H₂O₂)，自身重新转化为GOD_o，从而维持催化循环[13]。值得注意的是，电子从FADH₂至O₂的传递并非直接进行，水分子在其中扮演“电子桥”角色，即FADH₂先将电子和质子转移至水分子，生成高活性水自由基物种(如·OH或H₃O⁺)，H该活性物种进一步将电子传递至O₂。

VSC通过FP光学微腔与水分子的O-H伸缩振动(3409 cm⁻¹)发生强耦合，引发拉比分裂，形成高能态(P+)和低能态(P−)两个极化激元态。已有实验证据表明，这种耦合会显著影响酶的催化活性，例如Ebbesen等人发现O-H振动与腔模强耦合能够降低胃蛋白酶(pepsin)的活性[14]。同时，综述性研究指出，P+态能量较高且通过非辐射途径快速衰减，而P−态能量较低、更为稳定，因此更可能在化学反应动力学中发挥主导作用[15]。这些结果共同表明，VSC所导致的能级重构与极化子态形成，可能是调控酶催化效率的关键机制。其中，P-态的能量低于原始O-H振动能级，导致O-H键振动频率下降。这种频率降低意味着水分子间的氢键网络更加稳定，同时水分子的电负性增强，即对电子的吸引和保持能力提高。

在GOD催化反应中，水分子通常需要作为电子给体参与电子转移。然而，在VSC条件下，由于水分子稳定性增加和电负性增强，其电子供体能力下降，从而阻碍了催化循环中的两个关键步骤：首先，FADH₂难以将电子转移至水分子；其次，活化的水物种也难以将电子进一步传递给O₂。结果是，整个电子传递链被有效“堵塞”，O₂无法顺利再生为GOD_o，导致催化循环显著受抑。电化学实验结果进一步验证了这一机制，显示电子转移能垒升高，整体催化速率明显下降。除了水分子的O–H振动模式外，体系中还可能存在其他潜在的耦合对象。例如，葡萄糖氧化酶的酰胺I、II振动带以及底物葡萄糖分子的O–H振动，也可能与腔模发生相互作用，从而对电子–质子转移过程产生影响。尽管本研究的结果主要表明水O–H振动在调控作用中占主导地位，但未来仍需通过选择性同位素标记、不同底物对比实验或理论模拟，进一步明确各类振动模式在反应动力学调控中的具体贡献。这将有助于全面理解VSC对复杂生物体系的调控机制。

4. 结论

总之，本研究证明了含O-H伸缩振动的VSC能显著调控GOD的催化率，并可通过电化学信号实现实时监测。在FP腔内的GOD催化体系中，我们观测到最高63%的抑制率，说明VSC对水分子的O-H振动的调控是影响电子转移效率的关键因素。具体而言，强耦合引发极化子态的形成，改变了水分子氢键网络的稳定性，从而阻碍了底物与酶活性位点之间的质子耦合电子转移过程，使电子转移速率下降。本研究不仅为理解生物电化学反应提供了新的微观视角，也为未来利用光学手段调控酶活性及构建光控生物传感器体系提供了新的可能性。

致 谢

感谢国家自然科学基金项目(No. 32271298,T2241002)、国家重点研发计划项目(No. 2021YFA1200402)、太赫兹生物物理创新实验室项目(No. 23-163-00-GZ-001-001-02-01)、中国科学院大学温州研究所项目(WIUCASQD2021003, WIUCASQD2021011)的支持。

附 录

Figure S1. FP cavity component diagram

图S1. FP腔组件图

Figure S2. Electrochemical-FP cavity diagram

图S2. 电化学-FP腔图

Figure S3. Infrared transmission spectrum of pure water

图S3. 纯水的红外透射光谱

NOTES

^*共同第一作者。

^#通讯作者。