1. 引言
复发性流产(Recurrent Spontaneous Abortion, RSA)是指与同一配偶连续发生2次或2次以上的妊娠28周以内的胚胎或胎儿丢失，在育龄期妇女中发生率约为1%~5% [1]。部分RSA患者可继发不孕，研究表明，URSA患者再次妊娠流产率仍高达50% [2]。即使通过辅助生殖技术(Assisted Reproductive Technology, ART)助孕，其临床妊娠率仍较低，流产风险高。排除染色体、解剖、内分泌及自身免疫性疾病等明确因素的RSA [3]，其余称为不明原因复发性流产(Unexplained RSA, URSA)，其发病机制尚未完全阐明。母胎免疫耐受失衡被认为是URSA的核心发病机制之一[4]。调节性T细胞(Regulatory T cells, Tregs)是一种免疫抑制性T细胞，作为维持母胎免疫耐受的关键细胞群体，通过多种机制可抑制活化的 NK细胞和CD8+ T细胞的杀伤功能，诱导和维持免疫耐受。根据发育来源，Treg细胞可分为胸腺来源的Treg (tTreg)和外周诱导的Treg (pTreg)，两者共同参与维持机体免疫稳态[5]。研究表明，URSA患者外周血和子宫内膜组织中Treg细胞数量减少及功能异常，可能导致对胚胎父源抗原的免疫耐受破坏，进而引发流产[6]。综合回顾既往关于NK细胞和Treg细胞相关指标对于URSA自然妊娠的患者的相关性分析，其结果具有争议。目前尚且缺乏其对于URSA合并不孕ART助孕患者的相关研究，因此本研究拟明确外周血Treg细胞及其亚群数量是否可以预测URSA合并不孕ART助孕患者助孕结局。本研究通过检测URSA合并不孕患者外周血多种Treg指标，分析其与辅助生殖技术(ART)助孕结局的关系，以期为临床评估URSA合并不孕患者预后提供更精准的免疫学依据。
2. 资料与方法
2.1. 研究对象
选取2019年1月至2023年12月期间在本院生殖医学中心就诊的165例URSA合并不孕并进行ART助孕的患者作为研究对象，所有患者均不包括重复周期。纳入标准：① 有2次或2次以上自然流产史；② 符合不孕症诊断标准(未避孕正常性生活1年未孕)；③ 年龄25~42岁；④ 夫妻染色体核型正常；⑤ 子宫解剖结构正常；⑥ 内分泌功能正常；⑦ 无抗磷脂抗体综合征等自身免疫性疾病。排除标准：① 一方染色体异常；② 生殖道解剖结构异常；③ 内分泌功能紊乱；④ 生殖道感染；⑤ 存在其他严重内外科疾病。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。
2.2. 研究方法
2.2.1. 样本采集
所有患者于控制性卵巢刺激前清晨空腹状态下采集外周静脉血3 mL，置于EDTA抗凝管中，2小时内进行流式细胞术检测。
2.2.2. 流式细胞术检测Treg细胞
采用美国BD公司的FACSAriaTMII流式细胞仪进行检测。取50 μL EDTA-K2抗凝全血，分别加入CD4-FITC、CD25-APC、CD127-PE抗体，加抗体混合液20 μL，避光孵育20 min后，加入BD溶血素10倍稀释液450 μL溶血15 min，离心洗涤后重悬，用10×PBS洗两遍后上机检测CD4+T细胞占及其亚群占比，包括：CD4+/Lym、CD25+/CD4+、CD127+/CD4+、CD25+CD127+/CD4+、CD4+CD25+/lym、CD4+CD127+/lym、CD4+CD25+CD127+/lym、CD25int/highCD127low/CD4+ (Treg/CD4+)、CD4+CD25int/highCD127low/Lym (Treg/Lym)、CD4+CD25−/lowCD127+/Lym、CD4−CD25+/Lym、CD4−CD127+/Lym、CD4−CD25+CD127+/Lym。
2.2.3. 助孕方案及结局评估
所有患者均行ART技术助孕。胚胎移植后给予常规黄体支持。本研究中，活产定义为妊娠 ≥ 28周的活婴出生。根据助孕结局将患者分为活产组(78例)和非活产组(87例)。
2.3. 统计学处理
应用SPSS 26.0对数据进行统计分析，对符合正态分布的计量资料用均数 ± 标准差表示，两组之间进行比较采用独立样本t检验，不符合正态分布的计量资料则使用中位数来表示，两组之间用非参数检验进行比较。计数资料以例数(百分比)表示，当期望频数小于5时，采用Fisher精确检验进行比较，其余情况采用卡方检验。先后对数据进行单因素和多因素二元Logistic回归分析，探究不良妊娠结局发生的相关危险因素。以P < 0.05为差异有统计学意义。
3. 结果
3.1. 两组基本临床特征比较
以下为研究人群基线资料表，其中活产组78人，非活产组共87人，两组患者基线资料无显著差异，见表1。
Table 1. Baseline characteristics of the study population
表1. 研究人群基线资料
变量 |
非活产组(n = 87) |
活产组(n = 78) |
P值 |
女方年龄(岁) |
34 (31, 38) |
33 (31, 35) |
0.057 |
男方年龄(岁) |
35 (32, 39) |
33 (31.25, 35) |
0.050 |
体重指数(kg/m2) |
22.34 ± 3.14 |
22.77 ± 2.45 |
0.335 |
基础FSH (IU/L) |
6.45 (5.5, 8.07) |
6.5 (5.43, 8.59) |
0.620 |
基础LH (IU/L) |
4.64 (3.13, 6.15) |
4.56 (3.44, 6.08) |
0.682 |
基础E2 (pg/mL) |
44.3 (33.68, 64.82) |
41.49 (31.05, 59.64) |
0.343 |
不良孕产史(次) |
2 (2, 3) |
2 (2, 3) |
0.126 |
不孕类型，n (%) |
|
|
0.410 |
原发不孕 |
10 (0.11) |
6 (0.08) |
|
继发不孕 |
77 (0.89) |
72 (0.92) |
|
AMH (ng/mL) |
1.97 (0.98, 3.56) |
2.11 (1.45, 4) |
0.164 |
基础窦卵泡数(个) |
13 (8, 16) |
14 (10, 18.75) |
0.061 |
ART相关资料中获卵总数、移植胚胎数、促排方案在活产组和非活产组中存在显著差异，见表2。
Table 2. ART-related data of the study population
表2. 研究人群ART相关资料
变量 |
非活产组(n = 87) |
活产组(n = 78) |
P值 |
新鲜周期，n (%) |
46 (0.53) |
42 (0.54) |
|
解冻周期，n (%) |
41 (0.47) |
36 (0.46) |
|
获卵总数(个) |
10 (6.5, 14) |
12 (9, 17.75) |
0.020 |
移植胚胎数(个) |
2 (1, 2) |
1 (1, 2) |
0.021 |
移植日内膜厚度(cm) |
0.9 (0.8, 1) |
0.9 (0.85, 1) |
0.459 |
最终授精方式，n (%) |
|
|
0.805 |
IVF |
38 (0.44) |
38 (0.49) |
|
ICSI |
45 (0.52) |
37 (0.47) |
|
IVF + ICSI |
4 (0.05) |
3 (0.04) |
|
进行PGT，n (%) |
22 (0.25) |
24 (0.31) |
0.433 |
促排方案，n (%) |
|
|
0.02 |
激动剂方案 |
49 (0.58) |
43 (0.54) |
|
拮抗剂方案 |
29 (0.34) |
37 (0.46) |
|
其他方案 |
7 (0.08) |
0 |
|
注：促排方案组间比较采用Fisher精确检验。
3.2. 两组外周血Treg细胞比较
Treg相关指标检测中，Treg细胞占比CD4+CD25int/highCD127low/Lym在活产组中显著低于非活产组(1.68 ± 0.44 vs 1.86 ± 0.54, P = 0.022)，见表3。
Table 3. Comparison of peripheral blood Treg cell indicators between the two groups
表3. 两组外周血Treg细胞指标比较
Treg细胞变量，n (%) |
非活产组(n = 87) |
活产组(n = 78) |
P值 |
CD4+/Lym |
35.12 ± 6.51 |
33.57 ± 6 |
0.115 |
CD25+/CD4+ |
11.1 (6.05, 19.1) |
9.8 (3.65, 20.85) |
0.486 |
CD127+/CD4+ |
65.4 (43.1, 73.3) |
68.1 (44.78, 76.4) |
0.261 |
CD25+CD127+/CD4+ |
4.9 (2.35, 6.7) |
3.5 (1.2, 6.9) |
0.302 |
CD4+CD25+/lym |
3.36 (2, 6.2) |
2.8 (1.18, 5.42) |
0.127 |
CD4+CD127+/lym |
21.43 (8.76) |
20.65 (9.18) |
0.58 |
CD4+CD25+CD127+/lym |
1.61 (0.76, 2.14) |
1.11 (0.33, 2.46) |
0.159 |
CD25int/highCD127low/CD4+ (Treg/CD4+) |
5.1 (4.6, 6.1) |
4.85 (4.23, 5.68) |
0.100 |
CD4+CD25int/highCD127low/Lym (Treg/Lym) |
1.86 ± 0.54 |
1.68 ± 0.44 |
0.022 |
CD4+CD25−/lowCD127+/Lym |
18.84 ± 8.6 |
19.75 ± 7.81 |
0.475 |
CD4−CD25+/Lym |
1.2 (0.33, 2.95) |
0.66 (0.22, 3.22) |
0.452 |
CD4−CD127+/Lym |
5.5 (3.59, 11.95) |
5.75 (4.37, 10.88) |
0.614 |
CD4−CD25+CD127+/Lym |
0.18 (0.1, 0.3) |
0.16 (0.07, 0.3) |
0.709 |
3.3. 基线资料与妊娠结局的单因素分析
将基线资料以及ART相关资料与活产进行单因素分析，结果显示基线指标中女方年龄增加、男方年龄增加会显著降低活产的概率；而获卵总数增加、移植胚胎数增加会显著增加活产的概率，见表4。
Table 4. Univariate analysis of baseline characteristics and pregnancy outcomes
表4. 基线资料与妊娠结局的单因素分析
变量 |
OR (95% CI) |
P值 |
女方年龄(岁) |
0.921 (0.857, 0.991) |
0.027 |
男方年龄(岁) |
0.934 (0.879, 0.992) |
0.027 |
获卵总数(个) |
1.064 (1.012, 1.118) |
0.015 |
移植胚胎数(个) |
0.504 (0.271, 0.936) |
0.03 |
不良孕产史(次) |
1.156 (0.791, 1.689) |
0.453 |
不孕类型(继发不孕)，n (%) |
1.558 (0.539, 4.507) |
0.413 |
AMH (ng/mL) |
1.017 (0.919, 1.127) |
0.741 |
基础窦卵泡数(个) |
1.041 (0.997, 1.088) |
0.071 |
最终授精方式，n (%) |
|
|
IVF |
参考组 |
|
ICSI |
0.822 (0.44, 1.537) |
0.54 |
进行PGT，n (%) |
1.313 (0.664, 2.597) |
0.434 |
3.4. Treg相关指标与妊娠结局的单因素分析
进一步将Treg细胞相关指标与活产率进行单因素Logistic回归分析，结果显示，Treg/Lym增加会显著降低活产概率(OR = 0.483, 95% CI: 0.254~0.916, P = 0.026)，见表5。
Table 5. Treg cell indicators and pregnancy outcomes
表5. Treg指标相关资料以及妊娠结局
变量，n (%) |
OR (95% CI) |
P值 |
CD4+/Lym |
0.961 (0.914, 1.01) |
0.118 |
CD25+/CD4+ |
1.009 (0.982, 1.036) |
0.513 |
CD127+/CD4+ |
1.003 (0.988, 1.017) |
0.731 |
CD25+CD127+/CD4+ |
1.013 (0.95, 1.081) |
0.69 |
CD4+CD25+/lym |
0.977 (0.898, 1.063) |
0.592 |
CD4+CD127+/lym |
0.99 (0.957, 1.025) |
0.577 |
CD4+CD25+CD127+/lym |
0.938 (0.766, 1.148) |
0.534 |
CD25int/highCD127low/CD4+ (Treg/CD4+) |
0.81 (0.628, 1.046) |
0.106 |
CD4+CD25int/highCD127low/Lym (Treg/Lym) |
0.483 (0.254, 0.916) |
0.026 |
CD4+CD25−/lowCD127+/Lym |
1.014 (0.977, 1.052) |
0.475 |
CD4−CD25+/Lym |
1.032 (0.955, 1.114) |
0.424 |
CD4−CD127+/Lym |
1.011 (0.965, 1.059) |
0.659 |
CD4−CD25+CD127+/Lym |
1.259 (0.513, 3.09) |
0.615 |
3.5. 多因素Logistics回归分析Treg指标对患者妊娠结局的影响
考虑到基线资料可能对Treg细胞与妊娠结局的影响，我们以Treg指标为自变量建立两个多因素logistic回归模型：第一个模型是仅纳入Treg相关指标；第二个模型是纳入Treg指标以及表4中对妊娠结局有影响的基线资料信息。结果表明，Treg指标对于妊娠结局的发生无显著关联(P > 0.05)，见表6。
Table 6. Multivariate Logistic regression analysis of Treg cell indicators and pregnancy outcomes
表6. Treg相关指标与妊娠结局的多因素Logistic回归分析
变量，n (%) |
模型1 |
模型2 |
OR (95% CI) |
P值 |
OR (95% CI) |
P值 |
CD4+/Lym |
0.966 (0.843, 1.107) |
0.62 |
0.99 (0.859, 1.142) |
0.892 |
CD25+CD127+/CD4+ |
1.451 (0.877, 2.399) |
0.147 |
1.56 (0.914, 2.662) |
0.103 |
CD4+CD25int/highCD127low/Lym (Treg/Lym) |
2.077 (0.196, 22.001) |
0.544 |
1.603 (0.14, 18.329) |
0.704 |
CD4+CD25−/lowCD127+/Lym |
1.056 (0.989, 1.128) |
0.103 |
1.064 (0.989, 1.145) |
0.094 |
4. 讨论
RSA病因复杂，临床诊治标准不一，是目前亟待解决的难题。妊娠的失败多因母体对胚胎的排斥所致。T细胞作为适应性免疫的关键参与者，依据其表面分子及功能特性可划分为不同亚群，主要包括CD4⁺辅助T细胞和CD8⁺细胞毒性T细胞两大类别。在CD4⁺T细胞中，根据其分泌的细胞因子及免疫调节功能，又可进一步区分为Th1、Th2、Th17与调节性T细胞(Tregs)等多种功能类型。Th1细胞主要生成IL-2、IFN-γ和TNF-α等促炎因子，这些分子在激活细胞免疫及抗细胞内病原体反应中起核心作用，然而在妊娠状态下，过高水平的Th1反应可能干扰胚胎发育。Th2细胞则倾向于产生IL-4、IL-6和IL-10等细胞因子，这些因子有助于B细胞活化与抗体产生，并被认为对于促进胚胎着床及维持妊娠具有支持作用。Th17细胞则以分泌IL-17为特征，在黏膜屏障防御及清除胞外病原体方面发挥关键功能，尤其对于子宫内环境的微生物控制具有重要意义。Tregs通过分泌IL-10和TGF-β等抑制性细胞因子，在维持自身免疫耐受、促进同种异体移植物存活以及建立母胎界面免疫耐受中发挥关键作用。该细胞数量的减少或功能异常，常与妊娠失败等不良结局密切相关[7]。
URSA的发病与Tregs数量及功能的异常有关。相较于子宫内膜取样，外周血取样具有便捷、可长期动态监测的优势[8]。因此，明确外周血免疫细胞在不明原因复发性流产中的关键作用机制，并建立其波动范围的参考标准，对于该疾病的临床诊断与治疗具有重要价值。多项研究已证实，URSA患者外周血及蜕膜组织中Treg细胞的比例与功能均显著低于正常妊娠人群。例如，Keller等通过系统评价发现，URSA患者外周血和蜕膜中的Treg水平与功能均明显低于正常对照组[9]。Luo等进一步研究证实，URSA患者外周血Treg的免疫调节功能存在缺陷[10]。研究表明，URSA患者孕前外周血Treg水平已显著低于有成功生育史的健康女性，另有研究表明孕前黄体期外周血CD4+CD25+Treg水平降低与URSA患者后续流产风险显著相关，可作为预测URSA患者再次流产的潜在生物标志物值，然而该研究Treg标记仅采用CD4+CD25+，未纳入CD127或Foxp3等更特异性标志物[11]。尽管一些研究表明Tregs的比例低于平均水平及其功能的破坏与不明原因复发性流产(URSA)的发生密切相关，但由于其识别Tregs的方法存在局限性，这些发现仍未得出结论[11] [12]。现前沿研究聚焦于Treg的表型特征，用CD4+CD25highCD127low/−作为Tregs的特征性标志物，发现URSA患者外周血中CD4+CD25highCD127low/− Tregs细胞数量显著降低，且该类细胞核内关键转录因子FOXP3的蛋白质表达水平也明显下降。FOXP3是Treg细胞功能活化的主要调控因子，其表达降低直接反映了Treg免疫抑制功能的受损，可能导致母胎界面免疫耐受失衡，从而增加流产风险[13] [14]。然而，关于特定Treg细胞亚群与URSA合并不孕患者助孕结局的关系研究仍较少，且结果存在争议。
本研究通过分析165例URSA合并不孕患者的外周血Treg细胞与辅助生殖技术助孕结局的关系，单因素分析结果显示，外周血Treg/Lym比值每增加1%，活产的概率降低51%。在经过多因素校正后，Treg/Lym的独立预测作用消失，这表明其与妊娠结局的关联可能受到年龄、卵巢反应性、胚胎移植数量等更强临床因素的影响与混杂。我们认为Treg/Lym在多因素模型中失去显著性可能的原因在于：本研究中，女方年龄、男方年龄、获卵总数和移植胚胎数等传统临床指标在单因素分析中均与妊娠结局显著相关(表4)，且在两组间存在显著差异(表1、表2)，这些因素在临床实践中已被广泛证实对ART结局具有影响。例如，年龄增长伴随卵母细胞质量下降和子宫内膜容受性降低；获卵总数反映卵巢储备与反应性，直接影响优质胚胎的可获得性；而移植胚胎数则直接关系到着床潜能。在多因素模型中，当这些强预测因子被纳入后，Treg/Lym的微弱独立效应被“稀释”或“掩盖”，这强烈提示，在URSA合并不孕人群中，相较于外周血Treg/Lym比率，年龄、卵巢储备及胚胎学因素对活产结局的决定性作用更强，其影响掩盖了Treg/Lym的微弱独立效应。此外，Treg/Lym本身可能受卵巢刺激、内分泌状态等影响，其波动性或与其他免疫细胞亚群的交互作用也未在本研究中充分评估，进一步削弱了其独立预测价值。这揭示了将免疫指标置于整体临床背景中进行综合评判的重要性。本研究检测的是外周血总Treg细胞，其为胸腺来源(tTreg)与外周诱导(pTreg)的混合群体。有研究指出，URSA患者体内这两种来源的Treg细胞均可能存在数量和功能的缺陷。因此，未来研究进一步区分tTreg与pTreg亚群，将有助于更精确地揭示Treg细胞在URSA中的作用机制。
本研究还发现，传统临床指标如获卵总数、移植胚胎数、HCG日内膜厚度等与助孕结局相关，这与多数研究结果一致，进一步证实了这些指标在预测助孕结局中的价值。本文由于是回顾性研究，未对患者的妊娠结局及治疗方案进行详细研究，仅检测了外周血Treg细胞，未同时检测子宫内膜局部Treg细胞，后者与妊娠结局可能关系更为直接。未来需要更大样本、多中心的研究，并结合子宫内膜免疫细胞检测，进一步验证结论，并深入探讨不同来源Treg细胞(tTreg vs pTreg)影响妊娠结局的具体机制。
目前的研究存在一定的局限性。首要问题在于Treg细胞的标记方法尚未统一：部分研究采用CD4⁺CD25⁺CD127⁻的表面标志物进行识别[15]，而另有则依赖核内转录因子(如FOXP3)作为判定依据[16]，这种差异可能导致结果之间存在异质性。尽管URSA的病因尚未完全明确，但本研究结果为探讨Treg细胞在URSA发病机制中的作用提供了初步依据。作为一项探索性研究，当前样本量仍显不足。后续我们将进一步扩大样本规模，以期更全面评估Treg细胞水平在预测URSA患者妊娠结局中的临床价值。
5. 结论
本研究发现，URSA合并不孕患者外周血Treg/Lym比率在单因素分析中与活产结局相关，但在校正临床混杂因素后，其独立预测作用消失。这表明，尽管Treg细胞免疫可能参与URSA的发病机制，但外周血Treg/Lym比率尚不能作为该类患者ART活产结局的独立预测标志物。