甲状腺乳头状癌患者外周血2型固有淋巴样细胞含量分析

Analysis of Type 2 Innate Lymphoid Cells in Peripheral Blood of Patients with Papillary Thyroid Carcinoma

摘要: 目的：探讨甲状腺乳头状癌(PTC)患者外周血中2型固有淋巴样细胞(ILC2)的表达水平及其临床意义。方法：收集30例PTC患者和20例健康对照者的外周血标本，采用流式细胞术和实时荧光定量PCR (qPCR)检测ILC2的比例及其关键转录因子GATA3的mRNA表达水平。结果：PTC患者外周血中ILC2比例及GATA3 mRNA表达均显著低于健康对照组(P < 0.05)。结论：ILC2在PTC患者外周血中表达减低，可能参与疾病的发生发展过程，或具有作为潜在生物标志物的价值。

Abstract: Objective: To investigate the expression of type 2 innate lymphoid cells (ILC2s) in the peripheral blood of patients with papillary thyroid carcinoma (PTC) and its clinical relevance. Methods: Peripheral blood samples were collected from 30 PTC patients and 20 healthy controls. The frequency of ILC2s and the mRNA expression of GATA3 were detected by flow cytometry and quantitative real-time PCR (qPCR), respectively. Results: The proportion of ILC2s and the expression level of GATA3 mRNA in the PTC group were significantly lower than those in the control group (P < 0.05). Conclusion: The decreased expression of ILC2s in peripheral blood may be associated with the pathogenesis of PTC and could serve as a potential biomarker for the disease.

1. 引言

甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤，其中甲状腺乳头状癌(Papillary Thyroid Carcinoma, PTC)占甲状腺癌病例的80%~85% [1]。PTC通常进展缓慢、预后良好，但部分病例临床表现不典型，确诊时已发生淋巴结转移，影响治疗决策与预后。目前，超声引导下细针穿刺活检(fine needle aspiration, FNA)是诊断PTC的主要手段，但其为有创操作，且存在一定假阴性风险。因此，寻找无创、可靠的生物标志物对PTC的早期诊断具有重要意义。

固有淋巴样细胞(innate lymphoid cell, ILC)是近年来备受关注的先天免疫细胞亚群，缺乏特异性抗原受体[2]，参与黏膜免疫、组织修复及肿瘤免疫调控[3]。2型固有淋巴样细胞(ILC2)作为ILC家族成员之一，依赖转录因子(GATA-binding protein 3, GATA3)分化发育，并通过分泌IL-5、IL-13等细胞因子参与2型免疫应答，在肿瘤微环境中具有双向调控作用[4]。目前，关于ILC2在PTC中的表达特征及其作用尚不明确。本研究通过检测PTC患者外周血中ILC2的比例及GATA3 mRNA表达水平，初步探讨ILC2在PTC中的潜在作用。

2. 材料与方法

2.1. 研究对象

选取经病理确诊为PTC的30例患者作为实验组(PTC组)，其中男性5例，女性25例，年龄31~64岁，平均(45.8 ± 7.8)岁。纳入标准：初治、未经手术或放化疗的原发性PTC患者。排除标准：合并其他甲状腺疾病、恶性肿瘤、免疫性疾病、严重器官功能障碍或妊娠期妇女。另选20例性别、年龄匹配的健康体检者作为对照组。

2.2. 主要试剂与仪器

流式抗体包括FITC标记的Lineage抗体(CD3、CD14、CD19、CD20、CD56)、PE标记的CD294 (CRTH2)、RB780标记的CD127、RB705标记的CD45、PE标记的CD117 (BD公司)；Ficoll淋巴细胞分离液(Solarbio)；RNA提取、反转录及qPCR试剂(天根生物)；引物由上海生工合成。流式细胞仪(Beckman FC500)，qPCR仪(Roche LightCycler® 96)。

2.3. 实验方法

2.3.1. 流式细胞术检测ILC2

采集EDTA抗凝外周血2 mL，使用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMCs)。调整细胞浓度为3~5 × 10⁶/mL，加入Lineage-FITC、CD127-RB780、CD294-PE、CD45-RB705、CD117-PE抗体，避光孵育30 min后上机检测。ILC2定义为Lin⁻CD45⁺CD127⁺CD294⁺CD117⁺/⁻细胞。

2.3.2. qPCR检测GATA3 mRNA

提取外周血总RNA，反转录为cDNA后进行qPCR扩增。引物序列：GATA3上游5’-CTGGTGTGCATAGCGGAGGTTG-3’，下游5’-CCTGCGGACTGGCAATAATCGG-3’。以β-actin为内参，采用2^-ΔΔCT法计算基因相对表达量。

2.4. 统计学分析

使用SPSS 26.0软件进行数据处理。计量资料以均数±标准差或中位数(四分位数范围)表示，组间比较采用独立样本t检验或Mann-Whitney U检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

3. 结果

3.1. 一般资料比较

两组在年龄、性别构成上差异无统计学意义(P > 0.05)，具有可比性(表1)。

Table 1. Comparison of two groups of general data

表1. 两组一般资料比较

项目	实验组 (n = 30)	对照组 (n = 20)	P
年龄(岁)	45.8 ± 7.8	41.9 ± 9	0.131
性别n (%)
男	5 (16.7)	3 (15)	0.523
女	25 (83.3)	17 (85)	0.612

3.2. ILC2比例比较

流式细胞术显示，PTC组外周血ILC2比例显著低于对照组(P = 0.026) (表2，图1)。

Table 2. Comparison of the proportion of ILC2 in peripheral blood between the two groups

表2. 两组外周血ILC2比例比较

组别	N	ILC2细胞(%)
实验组	30	3.70 (1.9~6.8)
对照组	20	6.55 (4.475~9.425)
z		−2.228
P		0.026

Figure 1. The percentage of ILC2 in the experimental group and healthy controls was detected by flow cytometry

图1. 流式细胞术检测实验组和对照组的ILC2百分比

3.3. GATA3 mRNA表达水平

qPCR结果显示，PTC组GATA3 mRNA表达水平低于对照组(P = 0.021) (表3)。

Table 3. Comparison of GATA3 mRNA expression between the two groups ($\overline{x}\pm s$ )

表3. 两组GATA3 mRNA表达比较($\overline{x}\pm s$ )

组别	N	GATA3 mRNA
实验组	30	0.45 ± 0.24
对照组	20	0.63 ± 0.26
t		2.4
P		0.021

4. 讨论

本研究首次报道PTC患者外周血中ILC2比例及其转录因子GATA3的mRNA表达均显著降低，提示ILC2可能参与PTC的免疫调节过程。ILC2在不同肿瘤中的作用存在异质性。研究表明，ILC2在肺腺癌、膀胱癌等肿瘤中通过分泌细胞因子如IL-5、IL-13促进肿瘤生长[5] [6]；而在胰腺癌、结直肠癌中则可能发挥抗肿瘤作用[7] [8]。本研究结果显示，PTC患者ILC2水平下降，与某些肿瘤中ILC2高表达的结果相反，反映了ILC2在不同肿瘤微环境中的功能多样性[9]-[11]。

ILC2减少可能与PTC免疫逃逸机制有关。主要涉及以下几个方面，一方面是由于组织中重分布，ILC2从外周血向组织迁移，肿瘤细胞或肿瘤相关成纤维细胞分泌的相应配体可能在患者体内形成一个“浓度梯度”，将外周血中的ILC2招募至肿瘤组织内部，从而导致其在循环血液中的数量相对减少[2]，值得注意的是，这种募集过程可能伴随着组织驻留特征的获得，使得ILC2在进入肿瘤组织后不再返回循环系统。另一方面为转录重编程与谱系可塑性，ILC2由其核心转录因子GATA3主导。然而，ILC家族具有显著的可塑性。在肿瘤微环境中，高水平的IL-12和IL-23等细胞因子，可通过激活STAT4和STAT3信号通路，诱导ILC2下调GATA3的表达，同时上调T-bet (向ILC1转化)或RORγt (向ILC3转化)的表达[9] [12]，这种谱系转分化直接导致了具有ILC2表型的细胞数量减少。另一方面，与T细胞类似，长期暴露于肿瘤抗原和免疫抑制因子(如TGF-β、PGE2)的炎性环境中，ILC2可能进入一种“耗竭”状态。这种状态表现为抑制性受体(如PD-1、CTLA-4)表达上调，增殖能力下降，以及效应功能减弱[13] [14]。在肿瘤微环境中，持续性的炎症信号和代谢压力(如葡萄糖竞争)可能直接激活线粒体凋亡通路，导致ILC2数量不可逆地减少。从系统性的角度来看，肿瘤可能通过分泌G-CSF等因子影响骨髓的造血功能，促使造血干细胞向髓系分化，可能影响淋巴系祖细胞(包括ILC2前体)的发育[15]。此外，肿瘤相关的全身性炎症状态产生的IFN-γ和TNF-α等细胞因子，可能进一步破坏ILC2前体在周围组织中的存活与稳态维持。综上所述，肿瘤患者外周血ILC2的降低是“招募、转化、耗竭、抑制”多种机制共同作用的结果。本研究在PTC中观察到的ILC2降低现象，为理解甲状腺癌免疫微环境提供了新的视角。

本研究存在一定局限性。如样本量较小，且为单中心研究，结论的普适性需进一步验证；仅检测外周血，缺乏对肿瘤组织与癌旁组织中ILC2浸润情况的对比分析，无法区分其降低是由于系统性减少还是局部迁移；未检测ILC2相关细胞因子如IL-5、IL-13等水平，难以评估其功能状态；研究设计为横断面，无法推断ILC2变化与PTC进展之间的因果关系。后续研究将扩大样本量，开展组织水平检测，进行功能性细胞因子验证，结合肿瘤组织与外周血多维度分析，进一步阐明ILC2在PTC中的作用机制。

NOTES

^*通讯作者。