响应面法优化低共熔溶剂提取蒲公英绿原酸及其抗氧化活性研究

Optimization of Deep Eutectic Solvent Extraction of Chlorogenic Acid from Dandelion Using Response Surface Methodology and Its Antioxidant Activity

摘要: 本研究基于单因素实验筛选关键参数，采用响应面法(RSM)优化低共熔溶剂(DES)提取蒲公英绿原酸的工艺。确定最优条件为：液料比21:1 mL/g、超声时间108 min、温度80℃，绿原酸提取率达8.41%，显著优于传统溶剂法。抗氧化活性实验表明，蒲公英绿原酸对DPPH自由基、ABTS⁺自由基以及羟基自由基有一定的清除能力，当浓度达到20 mg/L的时候，对于这三种自由基的清除率分别达到了80.63%、87.35%和86.49%，表现出优异的抗氧化能力。本研究不仅优化了蒲公英绿原酸的绿色高效提取工艺，还证实了DES提取物在天然抗氧化剂开发中的应用潜力，为功能性食品及医药领域提供了理论依据。

Abstract: Based on single-factor experiments to screen key parameters, this study employed response surface methodology (RSM) to optimize the extraction process of chlorogenic acid from dandelion using a deep eutectic solvent (DES). The optimal conditions were determined as follows: liquid-to-solid ratio of 21:1 mL/g, ultrasonic time of 108 min, and temperature of 80˚C. Under these conditions, the chlorogenic acid extraction rate reached 8.41%, significantly outperforming traditional solvent extraction methods. Antioxidant activity experiments demonstrated that dandelion chlorogenic acid exhibited certain scavenging capabilities against DPPH free radicals, ABTS⁺ free radicals, and hydroxyl free radicals. At a concentration of 20 mg/L, the scavenging rates for these three free radicals reached 80.63%, 87.35%, and 86.49%, respectively, indicating excellent antioxidant capacity. This study not only optimizes a green and efficient extraction process for dandelion chlorogenic acid but also confirms the potential of DES extracts in the development of natural antioxidants, providing a theoretical foundation for applications in functional foods and pharmaceuticals.

1. 引言

蒲公英(Taraxacum officinale)又名婆婆丁，是菊科蒲公英属广布性药用植物，有着清热解毒、利尿通淋等功效。现代植物化学研究证实，蒲公英含有多元生物活性物质，包括黄酮类、多糖、酚酸类、萜类及植物甾醇等。而绿原酸(CGA)，因其具有抑菌、抗氧化、抗肿瘤、抗炎等药理作用而被人们熟知。目前，传统CGA提取方法有乙醇回流法、超声波法及酶解法等，但存在着提取效率低、溶剂消耗量大、技术能耗高等缺点。因此，迫切需要一种方法高效提取蒲公英中绿原酸[1]-[3]。

低共熔溶剂(Deep Eutectic Solvents, DES)是最近几年被人们所关注的新型的绿色提取溶剂，其通过氢键供体(HBD)与受体(HBA)组装形成氢键，具备低毒性、生物可降解性及超强溶解能力[4] [5]。卢娟等[6]采用氯化胆碱–柠檬酸溶剂组合，使得蒲公英绿原酸提取率达到2.86%。因此，为提高蒲公英绿原酸的提取率，采用响应面法优化超声辅助氯化胆碱–柠檬酸提取蒲公英绿原酸，并评估其抗氧化活性。为蒲公英资源的高效利用提供了环保的提取方法，推动绿原酸在医药领域的应用。

2. 材料与方法

2.1. 材料

2.1.1. 试验仪器

KH-600KDE超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)、TG16高速离心机(长沙迈佳森仪器设备有限公司)、V-5800紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)。

2.1.2. 试验试剂

蒲公英采摘自贵州工程应用技术学院；氯化胆碱购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；柠檬酸购自天津市致远化学试剂有限公司自由基试剂；自由基试剂(DPPH、ABTS⁺)及抗坏血酸购自上海麦克林生化科技股份有限公司；抗坏血酸购自比克曼生物科技有限公司；H₂O₂购自成都金山化学试剂有限公司。

2.2. 方法

2.2.1. 绿原酸标准曲线的绘制

精确称取5.5 mg绿原酸标准品，经无水乙醇溶解后定容至100 mL，配制成标准储备液。分别移取储备液1、3、5、7和9 mL至5支10 mL容量瓶中，乙醇定容，静置15 min。乙醇为空白对照，于326 nm波长处测定吸光度值(三次平行实验均值) [7]。以绿原酸浓度(C, μg/mL)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标建立标准曲线，得到绿原酸标准曲线为y = 0.03346x − 0.05889，R² = 0.9997。

2.2.2. 样品预处理

蒲公英全草经去离子水清洗、阴干后粉碎，过50目筛，密封储存于干燥器中备用。

2.2.3. 蒲公英绿原酸的提取

精密称取上述粉末1.00 g置于锥形瓶中，按一定料液比加入DES溶剂。放入超声波清洗机中，按照设定的超声功率、提取温度和提取时间提取，随后以3000 r/min离心20 min，上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤。取1 mL滤液，用无水乙醇梯度稀释后，于326 nm波长下测定吸光度。绿原酸提取率(Y, %)按式(1.1)计算[7]：

$\begin{array}{c}\eta =\frac{C\times V\times \text{n}}{\text{m}}\times 100\%\end{array}$ (1.1)

式中：η：蒲公英中绿原酸的提取率(%)；C：超声后提取液的浓度(μg/mL)；V：离心后上清液的体积(mL)；n：稀释倍数；m：蒲公英粉末的质量(g)。

2.2.4. 条件优化实验

采用单因素轮换法评估关键工艺参数的影响，分别考察低共熔溶剂摩尔比(1:1、1:2、1:3、3:1、2:1)、低共熔溶剂含水量(10%、30%、50%、70%、90%)、液料比(10 g/mL、15 g/mL、20 g/mL、25 g/mL、30 g/mL)、超声时间(40 min、60 min、80 min、100 min、120 min)和超声温度(40℃、50℃、60℃、70℃、80℃)对蒲公英绿原酸提取率的影响。

2.2.5. 响应面试验设计

根据单因素实验的结果，选取3个对绿原酸提取率影响较大的因素：提取液料比A、超声时间B、超声温度C，以绿原酸提取率为响应值，进行响应面优化设计，如表1所示。

Table 1. Box-Behnken experimental design factors and levels

表1. Box-Behnken 试验设计因素与水平

水平	A：液料比(mL/g)	B：超声时间(min)	C：超声温度(℃)
−1	15	80	70
0	20	100	75
1	25	120	80

2.2.6. 体外抗氧化活性检测分析

(1) DPPH自由基清除试验

取2 mL 0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液，与不同浓度的绿原酸提取液混合，避光反应30 min。于517 nm波长测定样品组吸光度A₁，以蒸馏水替代样品作为空白对照组A₂，蒸馏水替代DPPH溶液为背景组A₀ [8]。

(2) ABTS⁺自由基清除试验

将ABTS溶液(7 mmol/L)与过硫酸钾溶液(140 mmol/L)按体积比1:1混合，避光反应12 h生成ABTS⁺储备液。经无水乙醇稀释至734 nm波长处吸光度为0.70 ± 0.05，即得工作液。取2 mL工作液，分别加入不同浓度的蒲公英提取液，避光反应10 min后，在734 nm波长下的吸光度A₁。同时设置对照实验组，以等体积蒸馏水替代样品为对照组，并用蒸馏水替代ABTS⁺溶液为空白组获取空白参考值A₀ [8]。

(3) 羟基自由基清除试验

取2.0 mL不同浓度蒲公英提取液与2.0 mL H₂O₂、2.0 mL无水乙醇混匀，避光反应30 min后于326 nm测定吸光度A₁；同法测定未加H₂O₂的样品本底吸光度A₂。对照组以2.0 mL H₂O₂与4.0 mL 50%乙醇溶液混合测A₀ [8]。

上述三种自由基清除作用均以抗坏血酸作阳性对照，且清除率的计算公式如下：

$x=\frac{{\text{A}}_0-{\text{A}}_1+{\text{A}}_2}{{\text{A}}_0}\times 100\text{\%}$ (1.2)

3. 结果与分析

3.1. 低共熔溶剂摩尔比对提取率的影响

图1显示，提取率随氯化胆碱–柠檬酸摩尔比呈先增后降趋势。当摩尔比为1:3时达到最大值5.78%，较1:1比例提高32%；而当摩尔比增至3:1时，提取率反而降低至4.52%。此现象可能是因为，当低摩尔比为1:3时，柠檬酸含量提供足量羧基，通过与绿原酸分子形成致密氢键网络，显著增强其溶解性；反之，高胆碱比例破坏氢键供受体平衡，削弱溶剂–溶质分子作用力。

Figure 1. Influence of DES molar ratio on chlorogenic acid extraction yield

图1. 低共熔溶剂摩尔比对绿原酸提取率的影响

3.2. 低共熔溶剂含水量对提取率的影响

图2显示，提取率随低共熔溶剂含水量增加先增后减，70%达到最大值为5.07%。当含水量大于70%时，提取率显著下降至4.21%。其原因可能是适量水分可增强溶剂极性和传质效率，利于提取，但过量水会稀释溶剂活性成分，降低提取能力。此外，含水量低，溶剂黏度过大，会阻碍溶剂在植物细胞间的渗透和绿原酸的扩散。

Figure 2. Influence of DES water content on chlorogenic acid extraction yield from dandelion

图2. 低共熔含水量对蒲公英中绿原酸提取率的影响

3.3. 液料比对提取率的影响

图3显示，提取率随液料比增大而显著提升，在20 mL/g时达到最大值5.74%。当液料比在20:1 mL/g后，提取率呈现下降趋势。低液料比溶剂传质效率受限，导致溶质扩散动力不足，而限制溶出，因此，适量溶剂提高效率。因此，响应面试验选取15 mL/g、20 mL/g、25 mL/g。

Figure 3. Influence of liquid-to-solid ratio on chlorogenic acid extraction rate

图3. 液料比对绿原酸提取率的影响

3.4. 超声时间对提取率的影响

图4显示，提取率在40~100 min内随超声时间延长呈上升趋势，于100 min达到最大值为8.66%，此后显著下降。可能原因是时间不足时溶出不完全，延长有利于溶出；但过长时间可能导致绿原酸降解或溶剂饱和，反而降低效率。因此，响应面试验选取80 min、100 min、120 min。

Figure 4. Influence of ultrasonic time on chlorogenic acid extraction rate

图4. 超声时间对绿原酸提取率的影响

3.5. 超声温度对提取率的影响

图5显示，在超声温度从40℃到80℃的范围内，随着超声温度的升高，提取率呈现出逐渐上升的趋势。当温度处于较低水平时，提取率上升相对较缓；而当温度进一步升高，提取率的上升速度有所加快，整体呈现出随温度升高而提取率逐步提高的变化规律。

Figure 5. Influence of ultrasonic temperature on chlorogenic acid extraction rate

图5. 超声温度对绿原酸提取率的影响

3.6. 响应面试验

3.6.1. 响应面回归模型建立

在单因素实验的基础上，以绿原酸提取率为响应指标，采用Design Expert 12.0.3软件进行响应面分析。依据Box-Behnken设计原则，对三因素三水平进行实施实验设计，相关数据详见表2。

根据Design Expert 12.0.3响应面软件对表2结果进行回归分析，得到3个因素的编码值二次回归方程为：Y = 6.29 + 0.7072A − 0.2063B + 1.40C + 0.2422AB − 0.8437AC + 0.0271BC − 1.83A² − 1.49B² + 1.32C²。

Table 2. Response surface test design and results

表2. 响应面试验设计与结果

模型	A：液料比(mL/g)	B：超声时间(min)	C：超声温度(℃)	绿原酸提取率(%)
1	15	80	75	2.83
2	25	80	75	3.74
3	15	120	75	1.86
4	25	120	75	3.74
5	15	100	70	2.74
6	25	100	70	5.86
7	15	100	80	7.41
8	25	100	80	7.15
9	20	80	70	5.07
10	20	120	70	4.67
11	20	80	80	7.65
12	20	120	80	7.36
13	20	100	75	6.39
14	20	100	75	6.61
15	20	100	75	6.30
16	20	100	75	6.19
17	20	100	75	5.97

3.6.2. 响应面回归模型方差分析

通过Design Expert 10.0.3软件进行方差分析，结果见表3。

Table 3. Analysis of variance for the regression model

表3. 回归模型的方差分析

方差来源	平方和	自由度	均方差	F值	P值
模型	52.55	9	5.84	138.47	<0.0001	significant
A	4.00	1	4.00	94.89	<0.0001
B	0.3403	1	0.3403	8.07	0.0250
C	15.78	1	15.78	374.30	<0.0001
AB	0.2346	1	0.2346	5.56	0.0504
AC	2.85	1	2.85	67.52	<0.0001
BC	0.0029	1	0.0029	0.0695	0.7996
A^2	14.05	1	14.05	333.31	<0.0001
B^2	8.56	1	8.56	202.90	<0.0001
C^2	7.35	1	7.35	174.30	<0.0001
残差	0.2952	7	0.0422
失拟项	0.0702	3	0.234	0.4163	0.7513	not significant
纯差	0.2249	4	0.0562
总误差	52.84	16
R^2 = 0.9944
R^2Adj = 0.9721

注：P < 0.05表示影响显著，P < 0.01表示影响极显著。

由表3可知，F模型 = 138.47，P模型 < 0.0001，表明模型整体高度显著。失拟项P = 0.7513，为不显著，证实模型未遗漏关键变量且拟合充分。模型决定系数R² = 0.9944，调整R² = 0.9721，表明99.44%的响应值变异可被解释，拟合优度优良。在因素影响中，液料比(A)、超声温度(C)的P < 0.0001，为极显著；超声时间(B) P = 0.0250 < 0.05，为显著。在交互项中，AC的P值 < 0.0001，为极显著，表明AC协同效应极强(F = 67.52)，是工艺优化的核心交互项；AB的P值 = 0.0504接近0.05，有一定影响趋势，表明AB存在微弱协同作用；但BC的P值 = 0.7996，为不显著，表明二者独立作用于响应值。二次项A²、B²、C²均P < 0.0001，极显著。根据F值与P值判断，蒲公英中绿原酸的提取率受各因素的影响大小依次为：C：超声温度 > A：液料比 > B：超声时间[8]。

3.6.3. 响应面分析

为了研究各种因素之间的相互影响对蒲公英中绿原酸提取率的影响，采用Design Expert 12.0.3，绘制等高线图和3D图，如图6所示。当等高线图是圆形时，表示这两个因素的交互作用比较弱，当等高线图是椭圆形时，表示这两个因素的交互作用比较强。

(a) 液料比与超声时间

(b) 液料比与超声温度

(c) 超声时间与超声温度

Figure 6. Effect of two-factor interaction on chlorogenic acid extraction rate in dandelion

图6. 两因素交互作用对蒲公英中绿原酸提取率的影响

如图6所示，液料比(A)对绿原酸提取率呈显著主导效应：其响应曲面曲率变化剧烈，且等高线密度分布特征(图6(a))表明提取率随A值变动波动幅度达12.7%~38.4%。超声时间(B)与温度(C)次之，其中AC交互项表现出强协同作用(P < 0.01)，体现为曲面陡变区与等高线椭圆偏转(长短轴比 > 2.5)；AB交互呈弱关联趋势(P = 0.062)，而BC交互无统计学意义(P > 0.05)，对应等高线近圆形分布[9]。

3.6.4. 验证性试验

采用Design Expert 13软件构建响应面模型优化绿原酸提取工艺。模型预测显示：当液料比21:1 (mL/g)、超声时间108 min、温度80℃时，理论提取率达8.42%。固定上述参数进行三次重复验证，实测平均提取率为8.41% (相对误差0.12%)，证实模型具有良好预测精度与工艺重现性[10]。

3.7. 抗氧化活性试验

3.7.1. DPPH自由基清除作用

Figure 7. Greenish acid’s DPPH radical scavenging capacity in dandelion

图7. 蒲公英中绿原酸对DPPH自由的基清除能力

DPPH自由基(溶于乙醇呈特征性紫色)在抗氧化剂作用下发生褪色反应，其清除率与吸光度变化呈正相关[11] [12]。图7显示，当蒲公英绿原酸浓度达20 mg/L时，DPPH清除率达80.63%，表明该化合物具有显著自由基清除效能，但其活性仍显著低于抗坏血酸。

3.7.2. ABTS⁺自由基清除作用

ABTS⁺自由基由过硫酸钾氧化生成，其无水乙醇溶液呈特征性蓝绿色(最大吸收波长734 nm)。当加入抗氧化剂时，电子转移反应导致体系褪色(蓝绿→淡黄)，吸光度降低值与清除率呈正相关，此变化可定量表征抗氧化活性[13] [14]。图8显示，20 mg/L绿原酸对ABTS+自由基的清除率达87.35%，证实其具有显著自由基清除能力，但该活性仍低于抗坏血酸。

Figure 8. Greenish acid in dandelion’s capacity to neutralize ABTS free radicals

图8. 蒲公英中绿原酸对ABTS自由基的清除能力

3.7.3. 羟基自由基清除作用

Figure 9. Hydroxyl radical scavenging capacity of chlorogenic acid in dandelion

图9. 蒲公英中绿原酸对羟基自由基的清除能力

羟基自由基(•OH)活性强、破坏力大，清除难度高[15]。图9显示，当绿原酸浓度达20 mg/L时，清除率为86.49%，证实其具有显著自由基清除能力；而抗坏血酸在所有测试浓度下均表现出更强的清除效能。

4. 结论

本研究采用超声辅助低共熔溶剂法提取蒲公英中的绿原酸，在单因素试验基础上，结合响应面法对提取工艺进行优化，确定了最佳工艺参数为：液料比21 mL/g、超声温度80℃、超声时间108 min。在此条件下，绿原酸的实际提取率达到8.41%，显著高于文献报道的常规方法提取率[16]，且与模型预测值吻合良好，表明该优化工艺稳定可行。抗氧化活性评价结果显示，在20 mg/L的质量浓度下，蒲公英绿原酸提取物对DPPH自由基、ABTS⁺自由基及羟基自由基三种自由基的清除率分别为80.63%、87.35%和86.49%，表明其具备较强的抗氧化能力，具有开发为天然抗氧化剂的良好潜力。

该提取工艺显著提高了蒲公英绿原酸的提取率，在降低能耗和溶剂用量的同时兼顾环境友好性，为蒲公英资源的高值化利用提供了新途径。所得绿原酸提取物抗氧化性能突出，可广泛应用于食品、保健品及化妆品等领域，作为天然防腐剂或功能性添加剂，符合绿色、健康的消费趋势。

基金项目

2024年贵州省大学生创新创业训练立项项目“N-苄基-供电子取代苯甲酰胺衍生物的合成”(S2024106680564)；2024年贵州省大学生创新创业训练立项项目“N-苄基-3-卤取代苯甲酰胺类衍生物的合成”(S2024106680563)。

NOTES

^*通讯作者。