响应面法坛紫菜类菌孢素氨基酸(MAAs)超声辅助提取工艺优化

Optimization of Ultrasound-Assisted Extraction Process for Mycosporine-Like Amino Acids (MAAs) from Pyropia haitanensis by Response Surface Methodology (RSM)

摘要: 为优化坛紫菜(Pyropia haitanensis)中类菌孢素氨基酸(Mycosporine-like Amino Acids, MAAs)的提取工艺，采用响应面法系统优化超声提取工艺参数，重点考察超声能量密度(35%~45%)、提取时间(30~90 min)及料液比(1:25~1:45 g·mL⁻¹)对提取效果的影响，并通过高效液相色谱–质谱联用(High Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry, HPLC-MS/MS)对MAAs组分进行分离鉴定。结果表明，坛紫菜中主要含有Shinorine和Porphyra-334两种特征性MAAs，均具有典型的紫外吸收特性；确定的最佳提取工艺条件为：以39%乙醇为提取溶剂，在35℃恒温水浴环境下，按1:35的料液比混合，采用500 W功率超声(能量密度40%)连续处理60 min，此时MAAs得率可达14.63% ± 0.32%。与传统水提法相比，该工艺不仅使提取时间缩短33.3%，溶剂消耗量降低20%，还显著提升了得率17.3% (P < 0.05)。该超声辅助提取工艺为MAAs在防晒化妆品及功能食品领域的应用提供参考。

Abstract: To optimize the extraction process of Mycosporine-like Amino Acids (MAAs) from Pyropia haitanensis, response surface methodology was employed to systematically optimize the ultrasonic extraction parameters. The effects of ultrasonic energy density (35%~45%), extraction time (30~90 min), and solid-liquid ratio (1:25~1:45 g·mL⁻¹) on extraction efficiency were focused on, and the MAA components were separated and identified by High-Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry (HPLC-MS/MS). The results showed that Pyropia haitanensis mainly contained two characteristic MAAs, namely Shinorine and Porphyra-334, both of which exhibited typical ultraviolet absorption properties. The optimal ultrasonic extraction conditions were determined as follows: 39% ethanol as the extraction solvent, mixing the sample with the solvent at a solid-liquid ratio of 1:35 in a constant temperature water bath at 35˚C, and continuous ultrasonic treatment at 500 W power (corresponding to 40% energy density) for 60 min. Under these conditions, the MAA yield reached 14.63% ± 0.32%. Compared with the traditional water extraction method, this process not only shortened the extraction time by 33.3% and reduced the solvent consumption by 20%, but also significantly increased the MAA yield by 17.3% (P < 0.05). This ultrasonic-assisted extraction process provides a reference for the application of MAAs in the fields of sunscreen cosmetics and functional foods.

1. 引言

臭氧层衰减引发的紫外线辐射生物学效应与应对策略研究，已成为全球关注的重要科学议题[1]。UV-B波段紫外线凭借较强的穿透能力，可诱导表皮细胞DNA光化学损伤并抑制免疫功能[2] [3]，对生态系统稳定和公共卫生安全构成双重威胁[4]。在环境治理层面，人工合成紫外线防护剂引发的次生污染问题促使科研界将目光转向天然产物的开发与应用[5]。

类菌孢素氨基酸(MAAs)作为海洋生物长期进化形成的分子防御体系，其独特的环状共轭结构赋予其在UV-A/UV-B波段的高效光子捕获能力[6]。现有研究表明，红藻门物种中MAAs的生物合成能力显著优于其他藻类，其中坛紫菜作为典型代表物种，其代谢产物多样性及次生代谢物积累水平展现出独特的开发价值[7]-[9]。尽管该生物质资源具有可观储量，现有提取技术体系仍存在能效比失衡、产物得率受限等工程化瓶颈，制约着天然光保护剂的产业化进程[10]-[12]。

基于海洋生物资源高值化利用理念[13]-[15]，研究以超声场强化传质机制作为工艺创新切入点，通过系统优化过程参数，构建针对MAAs的高效分离技术路线[16]该研究着重突破传统提取方法在传质动力学及选择性分离方面的技术瓶颈[17]-[19]，同时整合现代分析技术实现产物组分的精准解析，以期为开发环境友好型紫外线防护材料提供新的理论支撑[20] [21]。

2. 材料与方法

2.1. 实验材料

有机坛紫菜，霞浦千海蓝食品有限公司；纯净水，湖南娃哈哈食品有限公司；甲醇(色谱纯)，上海麦克林生化科技股份有限公司；乙酸(色谱纯)，上海麦克林生化科技股份有限公司；无水乙醇(分析纯)，天津市科密欧化学试剂有限公司。

2.2. 坛紫菜MAAs提取工艺

单因素实验：将紫菜进行烘干用破壁机进行粉碎、35%的乙醇以1:30的料液比在32℃的条件下超声浸提45 min，冷冻离心得到上清液，调节乙醇的浓度至80%醇沉8 h，冷冻离心除去DNA和蛋白质[22]。

40℃旋转蒸发除去大部分的水和溶剂，冷冻干燥至粉末，得到MAAs粗提取物。分别对超声时间、超声频率、乙醇浓度、液料比、超声温度进行预实验。选取影响因素较大的因素进行响应面法试验优化。

响应面实验：根据单因素实验结果，采用Box-Behnken响应面设计方法，开展四变量三水平的中心组合试验，以液料比、超声时间、超声频率、乙醇浓度为响应因子，以坛紫菜中MAAs的提取率(mg/g)为响应变量，采用响应面试验设计法优化其提取工艺参数[23]。具体试验因素及水平配置详见表1。

Table 1. Table of factors and levels for response surface optimization experiment

表1. 响应面优化试验的因素水平表

水平	料液比/g·ml^−^1	超声时间/min	超声能量密度/%	乙醇浓度/%
−1	30	45	35	30
0	35	60	40	40
1	40	75	45	50

注：超声仪最大频率为40 KHz功率500 W，超声能量密度40%表示500 W·40%。Note: The maximum frequency of the ultrasonic instrument is 40 KHz and the power is 500 W, Ultrasonic energy density 40% represents 500W·40%.

2.3. 坛紫菜中MAAs得率的量化计算方法

根据文献报道的MAAs摩尔消光系数ε及方法[24]-[26]，可计算出坛紫菜MAAs中MAAs总含量，计算公式如下：

$X=A\times \frac{M}{\epsilon }$

式中：X为MAAs质量，mg；A为特征吸收波长334 nm下的吸光度；M为分子质量332，g/mol；ε为MAAs摩尔消光系数43,700，L∙mol⁻¹·cm⁻¹。

$W=\frac{m}{M}\times 100\%$

式中，W为MAAs得率(%)；m为初始提取的MAAs质量(g)；M为坛紫菜干粉末质量(g)。

2.4. 坛紫菜MAAs化学成分的检测与表征

HPLC测定：采用C18柱(5 um, 4.6 mm × 150 mm)，柱温为25℃，进样量20 uL，流动相A为0.3%乙酸水溶液，流动相B为甲醇，流速为1.0 mL/min，检测波长为334 nm，梯度洗脱条件：0~10 min，B%：10%~70% [27]。

ESI-MS测定：喷雾气压45 psi，氮气流速10.0 L/min，干燥温度350℃，破碎电压100 V，毛细管电压4500 V，全扫描(Scan)，参比离子质荷比：121.0509，922.0098，为参比离子对测定结果进行实时矫正，分辨率m/z在922.0098处全扫描响应为11,300，质荷比(m/z)范围在120~1000 [28]。

UV-Vis Spec测定：扫描范围200 nm~500 nm，狭缝宽度3 nm，扫描速度中速扫描，1000 nm/min，响应时间0.5~1 s，扫描模式Abs扫描[29]。

2.5. 坛紫菜MAAs标品分离纯化

采用高效液相色谱分离技术根据出峰时间不同分别收集两种氨基酸，经多次减压蒸馏和冻干后得到两种纯的MAAs标品[30]，纯度达99.7%。

2.6. 超声醇提工艺与水提工艺对比

对比两种提取工艺提取时间，溶剂消耗量，得率等，评估该工艺的优势。

3. 结果与分析

3.1. 超声时间变量对坛紫菜MAAs得率的作用规律

由图1分析可得，在15~90 min范围内在前60 min提取率随超声时间的增加而增加，60 min之后略有下降，根据观察发现可能原因为随超声时间的增长，超声所产生的能量累积会引发局部高温，这种物理环境变化可能对MAAs的提取过程产生调控作用。因此选取60 min为最佳超声提取时间。

Figure 1. Effect of ultrasound time on MAAs extraction rate

图1. 超声时间对MAAs提取率的影响

3.2. MAAs提取率受超声功率调控的规律

根据图2结果分析，在最大功率500 W的超声仪中超声功率在25%~55%的范围内呈现先上升再下降的趋势，响应值最优区间为35%~45%，可能影响因素为超声功率较低时不足以破坏紫菜细胞壁从而释放MAAs，过高的超声能量输入会导致MAAs分子结构损伤。为平衡提取效果与能耗成本，500 W功率和40%占空比被选为工业化生产的最优参数。

Figure 2. Effect of ultrasonic energy density on MAAs extraction rate

图2. 超声能量密度对MAAs提取率的影响

3.3. 乙醇浓度梯度对坛紫菜MAAs提取得率的作用规律

由图3实验数据可见，乙醇浓度对MAAs的提取率影响较大。当乙醇浓度较低时，由于MAAs是极性较强的化合物，低浓度乙醇的极性与水较为接近，对MAAs的溶解性有限，难以有效破坏细胞结构使MAAs释放出来，同时可能因溶剂对MAAs的选择性结合能力不足，无法有效置换细胞内的结合物质，最终导致得率偏低。随着乙醇浓度升高到一定程度，40%左右，乙醇既能保持一定的极性来溶解MAAs，又具有一定的脂溶性，可以更好地穿透细胞壁和细胞膜等脂质双分子层结构，使细胞内的MAAs更易被释放到提取溶剂中，此时MAAs的提取率会逐渐升高，达到一个相对较高的水平。当乙醇浓度继续升高，超过60%甚至更高时，乙醇的极性进一步降低，可能会导致MAAs在其中的溶解度下降。同时，过高浓度的乙醇可能会使细胞内的蛋白质等物质过度沉淀，包裹住MAAs，阻碍其被提取出来，反而使MAAs的提取率下降。经多因素交互作用验证，40%乙醇浓度被证明是实现最高MAAs得率的理想选择。

Figure 3. Effect of ethanol concentration on MAAs extraction rate

图3. 乙醇浓度对MAAs提取率的影响

3.4. 料液比对MAAs提取率的影响

由图4可知，料液比参数对坛紫菜MAAs得率的作用关键在于，优化固液相间的质量传递的比表面积液体含量较少时，受溶解度影响紫菜细胞中MAAs不能充分析出，而较大的液体质量时不利于生产，会增大处理量和造成用料的浪费。因此选取1:35为最佳提取工艺的料液比。

Figure 4. Effect of solid-liquid ratio on MAAs extraction rate

图4. 料液比对MAAs提取率的影响

3.5. 超声温度对MAAs提取率的影响

Figure 5. Effect of ultrasound temperature on MAAs extraction rate

图5. 超声温度对MAAs提取率的影响

由图5可知，当超声温度较低时，分子运动相对缓慢，溶剂与样品之间的相互作用较弱。此时，虽然超声能产生一定的空化效应，但由于温度低，溶剂对MAAs的溶解能力有限，且细胞等生物结构的破坏程度也相对较小，MAAs难以从细胞内充分释放到溶剂中，导致提取率较低。随着超声温度升高到一定范围，30℃~45℃，分子热运动加剧，溶剂极性优化与超声空化效应的耦合作用，可通过破坏生物膜结构促进MAAs的释放，并通过改善溶剂与溶质的相互作用提升提取效率。同时，适宜的温度还可能使MAAs的化学结构更稳定，有利于其在提取过程中的保留，进一步提高提取率。超声温度超过50℃阈值时，可能产生双重负面效应：其一，高温引发MAAs分子的热分解反应，导致有效成分含量降低；其二，溶剂挥发性增加将降低空化效应的作用强度，同时引发体系热力学参数波动，最终导致提取效率下降。实验数据显示，超声处理过程中体系温度以约10℃/h的速率递增，该温升幅度与环境温度及超声功率呈正相关。因此，综合考虑选取初始超声温度为33℃，经一小时超声结束后升至40℃左右提取率较高。

3.6. MAAs标准曲线的绘制

收集液相色谱流出液福建产有机坛紫菜中的两种MAAs，Shionrine和Porphyra-334冻干后得到MAAs高纯度样品，配制成标准样液用于紫外检测法标准曲线的绘制[23]。由朗伯比尔定律可知，在一定浓度范围内吸光度值与样品浓度成正比，由图6可知，MAAs在0.04~0.14 mg/ml的范围内具有良好的线性关系，并求得紫菜中MAAs的线性回归方程为y = 5.4893x + 0.0953，相关系数R² = 0.9993，说明MAAs含量在MAAs在0.04~0.14 mg/ml的范围内具有良好的线性关系。该曲线为后续研究中MAAs浓度的确定提供了标准化方法。

Figure 6. Standard curve of MAAs

图6. MAAs标准曲线图

3.7. 响应面实验的结果与分析

为进一步优化坛紫菜MAAs提取工艺，超声空化效应产生的热量导致体系温度呈现线性上升趋势(约10℃/h)，这种温升行为不仅与超声功率正相关，还受环境温度等外部条件的综合影响。因此，综合考虑选取初始超声温度为33℃，超声处理1小时并伴随体系温度升至40℃时，坛紫菜MAAs的提取效果最为理想。以液料比、超声时间、超声功率、乙醇浓度为自变量，坛紫菜MAAs得率为响应值，进行响应面试验设计，结果见表2。

采用Design-Expert13.1.0.1软件对表2的试验结果进行回归分析，得到回归模型：

Y = 14.64 + 0.2459 A − 0.0691 B + 0.0813 C − 0.1132 D + 0.6468 AB − 0.1620 AC + 0.1010 AD + 0.7800 BC + 0.2505 BD + 0.3480 CD − 0.8896 A² − 1.30 B² − 1.53 C² − 1.99 D²。

Table 2. Experimental design and results of response surface method

表2. 响应面法试验设计与结果

实验号number	料液比/g·ml^−^1	超声时间/min	超声能量密度/%	乙醇浓度/%	提取率/mg·g^−^1
1	30	45	40	40	13.155
2	40	45	40	40	12.293
3	30	75	40	40	11.361
4	40	75	40	40	13.086
5	35	60	35	30	11.356
6	35	60	45	30	10.968
7	35	60	35	50	10.612
8	35	60	45	50	11.616
9	30	60	40	30	11.812
10	40	60	40	30	12.221
11	30	60	40	50	11.315
12	40	60	40	50	12.128
13	35	45	35	40	12.512
14	35	75	35	40	11.303
15	35	45	45	40	10.965
16	35	75	45	40	12.876
17	30	60	35	40	11.611
18	40	60	35	40	12.368
19	30	60	45	40	12.102
20	40	60	45	40	12.211
21	35	45	40	30	11.762
22	35	75	40	30	10.996
23	35	45	40	50	10.925
24	35	75	40	50	11.161
25	35	60	40	40	14.816
26	35	60	40	40	14.691
27	35	60	40	40	14.831
28	35	60	40	40	14.626
29	35	60	40	40	14.213

为了检验坛紫菜MAAs提取工艺回归模型的有效性，对回归模型进行方差分析，从表3可以看出，该模型F = 44.38，P < 0.0001，结果显示坛紫菜MAAs提取效果的回归模型具有高度统计学显著性。矫正系数R² (Adj) = 0.9559表明试验误差小，准确度高。模型确定系数R² = 0.9780，预测相关系数R² (Pred) = 0.8962二者数值接近偏差在合理范围；模型失拟项检验结果P = 0.4662 (不显著)，说明拟合方程能够有效反映真实响应曲面；变异系数C.V.%为2.19%，验证了实验设计的科学性和模型预测的稳定性。信噪比(Adeq Precision) = 21.0518，大于临界值4，表明模型准确度高。因此，该方程可用于分析和预测坛紫菜MAAs最优提取工艺。

Table 3. Results of Analysis Of Variance (ANOVA) and significance test

表3. 方差分析及显著性检验结果

变异来源	平方和	自由度	均方差	F-value	p-value	显著性
模型model	44.81	14	3.2	44.38	<0.0001	**
A-料液比	0.7257	1	0.7257	10.06	0.0068	**
B-超声时间	0.0573	1	0.0573	0.7941	0.3879
C-超声能量密度	0.0794	1	0.0794	1.1	0.3119
D-乙醇浓度	0.1537	1	0.1537	2.13	0.1664
AB	1.67	1	1.67	23.2	0.0003	**
AC	0.105	1	0.105	1.46	0.2476
AD	0.0408	1	0.0408	0.5658	0.4644
BC	2.43	1	2.43	33.74	<0.0001	**
BD	0.251	1	0.251	3.48	0.0832
CD	0.4844	1	0.4844	6.72	0.0213	*
A^2	5.13	1	5.13	71.18	<0.0001	**
B^2	10.93	1	10.93	151.56	<0.0001	**
C^2	15.28	1	15.28	211.92	<0.0001	**
D^2	25.65	1	25.65	355.63	<0.0001	**
残差residual	1.01	14	0.0721
失拟项lack of fit	0.7572	10	0.0757	1.2	0.4662
纯误差pure error	0.2525	4	0.0631
总变异cor total	45.82	28

注：**极显著(P < 0.01)；*显著(P < 0.05)。Note: **highly significant (P < 0.01); *significant (P < 0.05).

3.8. 自变量对坛紫菜MAAs提取率的影响程度

由表3可知，该回归模型的自变量一次项A和二次项A²、B²、C²、D²对坛紫菜MAAs提取率有极显著影响(P < 0.01)。响应面分析结果表明，各工艺参数对MAAs提取得率的影响程度由大到小依次为：料液比 > 乙醇浓度 > 超声功率 > 超声时间。

3.9. 响应面交互作用分析及验证实验

曲线的走势越陡，说明该因素对坛紫菜MAAs提取率响应越大。当等高线图呈现明显的狭长特征时，通常意味着两因素间存在较强的交互作用。对坛紫菜MAAs提取率影响最大的因素为料液比，其次为乙醇浓度、超声功率和超时时间，与表3中的分析结果一致。由图7可知，超声时间和超声功率的交互作用对坛紫菜MAAs提取率影响最大，这一现象的潜在原因包括超声参数变化引发的温度波动，该热效应通过调控物质扩散速率与结构稳定性影响提取效果。同时，液料比与超声时间的交互作用显著[25]，溶剂用量与处理时长的组合变化可通过改变传质动力学特征影响目标成分的溶出量。由回归模型预测的坛紫菜MAAs最佳提取工艺为料液比1:35.6965，超声时间60.1849 min，超声能量密度40.1009%，乙醇浓度39.7788%，最大提取率预测值为14.6542%。为了方便生产操作，将优化条件改为料液比1:35，超声时间60 min，超声能量密度40%，乙醇浓度39%。针对最优工艺参数组合进行三次平行实验验证，坛紫菜MAAs的提取率为14.375% ± 0.09%这与预测值较接近，因此该模型可较好地预测和模拟坛紫菜MAAs的得率和最佳的提取工艺。

Figure 7. Response surface of the interaction of various factors on the yield of MAAs from Porphyra haitanensis

图7. 各因素交互作用对坛紫菜MAAs得率的响应面

3.10. MAAs化合物种类的分析

由高效液相色谱中的出峰数及时间3 min和3.5 min确定此品种坛紫菜中有两种MAAs，分别收集两种组分进行200 nm至500 nm紫外光谱扫描。得到两种物质均在334 nm下有最大吸收峰，又对其进行液质联用检测，得到第一个峰荷质比为347，第二个峰荷质比为333，根据文献可判断出第一个峰为Shionrine第二个峰为Porphyra-334。分子结构式及检测数据见下图8。

Figure 8. Liquid-chromatography, mass-spectrometry and ultraviolet-spectrum of MAAs

图8. MAAs液相色谱、质谱、紫外光谱图

3.11. MAAs化合物两种提取工艺对比

由表4可知，超声浸提法对比水提法在提取时间、溶剂耗量、得率方面均有较好的优势。

Table 4. Comparison of two extraction processes for MAAs

表4. MAAs化合物两种提取工艺对比

工艺类型	超声时间/min	乙醇耗量/ml	得率/%
水提法	120	15.84 ± 0.25	12.47 ± 0.35
超声浸提	60	13.2 ± 0.25	14.63 ± 0.32
对比结果	减少1 h	降低20%	提升了17.3%

注：乙醇耗量通过同条件下乙醇用量与乙醇回收量(通过旋转蒸发回收)计算得到，超声工艺乙醇回收率可达82.4% (旋转蒸发温度42℃)。

4. 结论

通过高效液相色谱–质谱联用分析，确定坛紫菜(Pyropia haitanensis)主要含Shinorine (保留时间3 min，[M + H]⁺ m/z 333)和Porphyra-334 (保留时间3.5 min，[M + H]⁺ m/z 347)，经紫外光谱扫描其最大紫外吸收特征峰均位于334 nm；单因素实验表明，液料比对MAAs得率影响最为显著(F = 10.06, P < 0.01)，该工艺参数对结果的影响程度占比52.6%。经响应面法优化后最佳条件为：超声功率：500 W (设备能量密度40%)，处理时间：60 min，液料比：1:35 (g·mL⁻¹)，乙醇浓度：39% (v/v)，温度：36℃ ± 1℃在此条件下得率达14.375% ± 0.09% (n = 3)，较传统水提法提升17.3% (t = 8.41, P < 0.05)，且乙醇回收率可达82.4% (旋转蒸发温度42℃)为坛紫菜类菌孢素氨基酸后续应用提供参考。

基金项目

聊城大学东昌学院大学生创新创业训练计划项目(2025DCA01)。

NOTES

^*共同通讯作者。