混合系列蛋白激酶样结构域在心血管疾病中的研究进展

Research Progress of Mixed Lineage Kinase Domain Like Protein in Cardiovascular Diseases

摘要: 坏死性凋亡途径是一种受体相互作用蛋白1 (receptor interacting protein kinase 1, RIPK1)、受体相互作用蛋白13 (receptor interacting protein kinase 3, RIPK3)、混合系列蛋白激酶样结构域(mixed lineage kinase domain like protein, MLKL)信号通路介导的不依赖半胱氨酸蛋白酶(caspase)的程序性细胞坏死死亡方式之一。MLKL在坏死性凋亡途径中起执行分子的作用，其在心血管疾病、癌症等病理过程中起着重要作用。在这篇文章中，我们概述了坏死性凋亡执行分子MLKL的分子机制，强调了其复杂的调节和执行的最新观点，以及在心血管相关疾病的研究进展。

Abstract: Necroptosis is a form of programmed necrotic cell death mediated by a signaling pathway involving receptor-interacting protein kinase 1 (RIPK1), receptor-interacting protein kinase 3 (RIPK3), and mixed lineage kinase domain-like protein (MLKL), which is independent of caspase proteases. MLKL plays an executioner role in the necroptotic pathway and is significantly involved in pathological processes such as cardiovascular diseases and cancer. In this article, we summarize the molecular mechanisms of the necroptosis executioner MLKL, emphasizing the latest views on its complex regulation and execution, as well as research progress in cardiovascular-related diseases.

1. 混合系列蛋白激酶样结构域与坏死性凋亡

程序性细胞死亡是由特定的分子介导的受调节细胞死亡方式[1]，在生理和病理中起着重要作用，凋亡、焦亡和坏死性凋亡是程序性细胞死亡的三种方式[2]。长期以来人们认为凋亡是可受调节的，而坏死是不受控制的，然而近年来的研究发现，一种由RIPK1、RIPK3和MLKL [3]介导可受调节的细胞坏死被称为坏死性凋亡。普遍接受的坏死性凋亡途径是由死亡结构域或者质膜上的不同受体(如TNFR、TRAIL、Fas/CD95、IFNγ和TLR4)与配体结合后触发，随后引起下游的信号通路被激活[4]。被激活后，这些受体募集衔接蛋白(FADD、TRADD 和TRIF)，它们与RIPK1和caspase-8或-10相互作用[5]-[7]形成一种复合物，在caspase-8活性被抑制的情况下RIPK1被CYLD去泛素化[8]，并募集和磷酸化RIPK3形成RIPK1/RIPK3复合物，随后该复合物募集并磷酸化MLKL，在高度磷酸化肌醇磷酸存在下[9]，磷酸化的MLKL寡聚化并会发生特定的构象变化，暴露出一个四螺旋束，并进一步促进了其半胱氨酸依赖的寡聚化过程，进而形成类似淀粉样纤维的复合体结构[10]-[12]，即使在缺乏RIPK1、RIPK3的情况下，MLKL强制聚合也足以触发坏死性凋亡，这表明MLKL聚合对于坏死性凋亡至关重要[13]，该复合物被称为坏死小体[14]。随后MLKL寡聚体易位到质膜[15]，引起膜构象变化形成一个孔道，该孔道通过允许离子流入、细胞器或细胞肿胀和膜裂解，然后无法控制地释放细胞器或细胞内物质，从而引起渗透失衡导致细胞裂解，进而导致坏死性细胞凋亡。此外，MLKL可激活其他阳离子通道(如TRPM7)以促进坏死性凋亡[16]。最近的研究表明，坏死性凋亡途径在心血管系统疾病进展中起着较为重要的作用，MLKL充当了连接炎症和心肌细胞变性、死亡的关键节点的角色，本文对MLKL及其在心血管疾病作用进行了系统性的梳理。

2. MLKL与心血管疾病的关系

2.1. MLKL与心力衰竭

在主动脉弓缩窄(TAC)模拟的小鼠心力衰竭模型[17]中，热休克蛋白90 (Hsp90)的过表达增强了MLKL诱导的细胞坏死性凋亡，坏死性凋亡关键蛋白(RIPK1、RIPK3、MLKL)及其磷酸化形式表达显著升高了三倍，使用Hsp90抑制剂抑制了RIPK1/RIPK3/MLKL通路的激活，阻断了RIPK1激酶的活性，抑制了RIPK3-MLKL的相互作用，同时也减少了p-MLKL的膜转位，坏死性凋亡相关蛋白表达恢复至基线水平，同时心肌细胞存活率提高50%，进而改善了心脏的收缩功能。同时也有研究[18]表明，使用Hsp90抑制剂17-AAG处理后的心衰小鼠的p-MLKL水平明显下降，减轻了心衰小鼠的心脏肥大和心功能不全，延缓了心脏的重塑，但17-AAG对MLKL的抑制是否有助于减轻人心力衰竭发展仍需要进一步的研究。在慢性心力衰竭发展的的过程中，RIPK3-MLKL-钙离子通路[19]似乎起着较为关键的作用。

2.2. MLKL与心肌缺血/再灌注损伤

在缺血/再灌注损伤(H/R)条件下心肌细胞中存在经典的坏死性凋亡途径、活性氧的爆发及线粒体功能下降，引起坏死性凋亡细胞数量增加、细胞的活力减弱。WB分析显示H/R显著增加了p-MLKL的表达和激活来诱导坏死性凋亡[20] [21]。使用不同浓度的白藜芦醇处理H/R暴露的H9c2细胞后发现，白藜芦醇通过靶向抑制TNF-α/RIP1/RIP3信号通路，阻断了坏死小体形成，减少了由p-MLKL介导的细胞膜穿孔，进而显著改善了细胞的存活率，降低了坏死性凋亡细胞的比例，并以剂量依赖性方式抑制细胞坏死性凋亡。在牛蓟素处理的H/R心肌细胞中，不仅心肌梗死面积、心肌酶浓度显著下降，组织病理学显示明显改善细胞损伤，而且坏死性凋亡相关蛋白表达受到抑制，H/R诱导的ROS水平也受到了抑制，同时线粒体膜电位升高，线粒体功能障碍得到了恢复，ATP合成增加，能量代谢得到改善。抑制MLKL可以清除活性氧的数量，改善心肌缺血/再灌注损伤，因此可以推测牛蓟素通过某种方式阻止了坏死性凋亡信号。此外褪黑素[18] [22]在H/R过程中也发挥着某种作用，在灌注前10分钟给予实验组细胞低剂量褪黑激素治疗后，TNF-α水平显著下降，并且负向调节RIP3诱导的磷酸化MLKL/CaMKII信号传导，显著降低ROS的产生和心肌细胞坏死性凋亡并改善心脏功能，以及发挥一定的镇痛作用。有研究[19]表明，对于H/R条件下的缺血预处理组，可以减少心肌细胞梗死面积，显著提高了心功能改善率，降低了心律失常的发生[23]。

2.3. MLKL与扩张型心肌病

MLKL水平在人扩心病(DCM)心肌细胞中显著升高，对扩心病患者心肌细胞组织样本中p-MLKL进行信号定位[24]后发现其主要存在于细胞核、细胞质和闰盘当中，尤其是在肥大的心肌细胞胞核(尤其形态怪异者)中p-MLKL信号更为明显，而心肌间质中几乎检测不到，推测p-MLKL在细胞核内聚集，通过破坏细胞核膜完整直接导致细胞死亡，或参与核内其他促进细胞死亡的信号传导。同时在纤维瘢痕周围的心肌细胞p-MLKL信号也相较于阴性对照升高，信号升高可能与心肌细胞坏死性凋亡后释放损伤相关分子，激活了纤维细胞促进了心肌细胞的纤维化。同样地在DCM小鼠模型中，p-MLKL信号在细胞核、细胞质、闰盘升高，在纤维瘢痕周围的心肌细胞中聚集，这与人心肌细胞表现出相同的特性。核p-MLKL水平高的患者组不良事件发生率显著高于核p-MLKL水平低的患者组，Kaplan-Meier生存曲线显示，核p-MLKL高水平组的无不良事件生存率低于核p-MLKL低水平组，总p-MLKL和核p-MLKL水平均高于野生型小鼠，其血清水平与心肌细胞纤维化面积相关。由此可见，p-MLKL在DCM心肌细胞中的定位增加可能与左心室舒张功能障碍及预后相关。综上可以看出，p-MLKL核内信号或可以作为扩张型心肌病的无创评估指标，同时对于扩心病患者使用MLKL抑制剂或可以干扰MLKL转移至细胞核从而延缓心肌细胞的纤维化的进展，未来对于MLKL在扩心病的机制的研究以及在临床实验上仍需更深一步研究。

2.4. MLKL与糖尿病型心肌病

Cao T [25]等人的研究表明，MLKL介导的坏死性凋亡信号通路存在于糖尿病心脏中，在高糖处理后(24小时)的小鼠心肌细胞中坏死性凋亡信号被激活，p-MLKL水平显著提高的同时可见心肌细胞损伤标志物(心肌酶、肌钙蛋白I)的浓度也升高了。MLKL基因敲除小鼠(MLKL KO小鼠)的心肌细胞中心肌损伤标志物的浓度显著低于野生型，用Evans染色显示MLKL KO糖尿病小鼠的心肌坏死面积也显著减少，病理学提示心肌胶原沉积减少从而减轻了心肌纤维化，在2个月后的随访后，MLKL KO小鼠的超声心动图也显示心功能也高于野生组。该实验亦将体外成人心肌细胞与高葡萄糖在二甲双胍和恩格列净的存在下共孵育24小时后发现，实验组相对于对照组中心肌细胞损伤标志物存在着显著差异，并且细胞中磷酸化的MLKL水平也显著降低，推测二甲双胍可能通过激活AMPK抑制mTOR通路减轻了炎症反应，显著减少了MLKL的磷酸化水平，进而抑制了坏死性凋亡途径，降低了细胞死亡率。恩格列净可能通过调节钠离子稳态或未知的STLT2作用靶点减少MLKL的磷酸化，抑制坏死性凋亡途径。

2.5. MLKL与冠状动脉粥样硬化性心脏病

在心肌梗死小鼠模型中坏死性凋亡的心肌细胞出现了一种独特的形态学特征[26]，心肌节段性坏死性凋亡(MSN)，由MLKL介导的巨噬细胞间炎性粘附促进形成。MLKL在巨噬细胞中促进细胞膜孔的形成，介导炎症因子IL-1β释放和心肌细胞死亡，并且增强整合素介导的巨噬细胞与心肌细胞的粘附。敲除巨噬细胞特异性MLKL基因(MLKLM-KO)可减轻MSN水平，随后表现出较少的细胞膜孔形成和炎症粘附，改善了心肌梗死后的心脏功能，而再输注野生型巨噬细胞到MLKLM-KO小鼠中则加剧了MSN。一项研究[27]表明，MLKL在血栓的形成上也发挥着作用。血小板中的MLKL在凝血酶的刺激下通过RIPK3-AKT轴实现磷酸化，并在磷酸化的早期(5分钟内)驱动血小板向着促凝血表型转化，使用MLKL抑制剂预处理洗涤人血小板后阻断了MLKL的磷酸化，可以显著减轻整合素的活化、纤维蛋白原结合及血小板聚集，可见抑制MLKL可以干扰同源凝血酶受体信号通路或下游事件进而抑制血小板活化。磷酸化的晚期(2小时后)，MLKL在持续被凝血酶的持续刺激下易位至质膜，引发膜透化导致细胞内蛋白泄漏，同时在膜完整性丧失的同时也导致细胞活力下降，在使用MLKL抑制剂后膜泄露可显著减少，这提示着其可能在血栓的稳定和清除存在着某些机制。综上，MLKL在血小板为主早期的血栓形成活化及晚期的凋亡消退发挥着重要作用，靶向MLKL可以抑制血栓形成同时并促进血栓消退，MLKL的这种“双重特性”为心血管疾病的治疗提供了一种新的方向。同时在临床研究[28]中证明，冠心病患者血清中MLKL水平在不同类型的冠心病患者中具有显著差异，与冠状动脉狭窄程度密切相关，对冠心病患者MACE的发生有着较为准确的预测价值。

3. 靶向MLKL的治疗策略与挑战

在心力衰竭模型中，RIPK3通过促进MLKL的磷酸化及其膜转位，p-MLKL在膜上形成钙离子通路，钙离子的内流速度提升两倍以上。阻断由p-MLKL形成的钙离子通道使得心肌细胞纤维化面积至少下降了60%，因此对于靶向MLKL或由p-MLKL形成的钙离子通道，或可以为研发治疗慢性心衰或抑制心脏重塑的新型药物提供了思路。对于心肌缺血再灌注损伤心肌细胞，缺血预处理条件下可以通过抑制MLKL转位到膜的过程从而减轻坏死性凋亡，因此在临床中是对于缺血事件发生时及时的预处理，是否作为非药物性的抵抗坏死性凋亡途径方案，或对于患者心脏功能及疾病的预后存在益处。在糖尿病型心肌病中，坏死性凋亡途径及其执行分子MLKL在心脏损伤充当关键角色对存在重要作用，且二甲双胍和恩格列净也对抑制MLKL水平和坏死性凋亡途径有着重要作用。然而对于坏死性凋亡途径和MLKL的研究仅是在小鼠层面，降糖药物对于坏死性凋亡途径和MLKL的抑制也仅是在成人心肌细胞层面，两者并没有共一个层面，是否上述结果是否在临床实验也可存在仍需进一步研究。但单单从实验的结果上看，抑制MLKL和使用二甲双胍、恩格列净或可对糖尿病患者有益。

4. 结语

坏死性凋亡作为一种可受调节的细胞死亡方式，MLKL作为坏死性凋亡途径中的关键执行蛋白，近年来在心血管疾病中的作用逐渐受到关注，目前仍面临着急需解决的问题。例如，(一) 虽然在不同的心血管疾病均存在相同的坏死性凋亡途径，但MLKL在不同的心肌细胞或心肌病中仍存在着各自的差异，其具体差异性的机制仍需进一步的深入研究。(二) 是否可以开发可用于临床工作中快速、简便、低成本的基于MLKL的生物标志物，用于预测或者诊断心血管疾病。(三) 是否可以评估长期抑制MLKL对心脏功能或心肌细胞及全身生理功能的影响。综上，坏死性凋亡途径执行分子MLKL与细胞损伤、炎症反应及多种心血管疾病进展密切相关，通过抑制MLKL的活性或其上游信号通路，可以显著减轻心血管损伤，为心血管疾病的治疗提供了新的靶点和思路。未来的研究需要进一步探索MLKL在心血管疾病中的复杂机制，开发更为精准和有效的治疗手段，有望为心血管疾病的预防和治疗带来新的突破。

NOTES

^*通讯作者。