莱茵衣藻的生殖发育和遗传毒性研究

Research on Reproductive Development and Genotoxicity in Chlamydomonas reinhardtii

摘要: 莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)因生长迅速、成本低廉且富含蛋白质、不饱和脂肪酸和维生素等营养成分在食品、保健和生物技术领域具有良好的开发应用前景，但毒理学评价数据缺乏使其应用受到了严重限制。为评估其安全性破解应用桎梏，本研究系统开展了四项毒理学实验。细菌回复突变试验(Ames试验)显示，在8~5000 μg/皿剂量范围内，莱茵衣藻未引起测试菌株突变菌落数显著增加。哺乳动物微核试验结果表明，ICR小鼠经1.67~6.67 g/kg BW剂量灌胃后，骨髓嗜多染红细胞微核率与阴性对照组无显著差异。小鼠精母细胞染色体畸变试验表明，各剂量组染色体异常细胞率未见显著升高。大鼠致畸试验结果证实，孕鼠在整个妊娠期饲喂掺入量高达10%的莱茵衣藻饲料，对其体重增长、生殖功能、胎鼠生长发育及各类型畸形率均未产生不良影响。综上所述，本研究实验结果表明莱茵衣藻未表现出遗传毒性、致突变性及生殖发育毒性，为其作为新食品资源的安全开发利用提供了科学依据。

Abstract: Chlamydomonas reinhardtii (CR) is a rapidly growing, nutrient-dense unicellular green alga rich in proteins, unsaturated fatty acids, and vitamins, with broad potential in food, healthcare, and biotechnology; however, data on reproductive and genetic safety remain limited. We conducted four standard toxicology studies to evaluate its safety: a bacterial reverse-mutation (Ames) test at 8 - 5000 μg/plate (±S9), a mammalian bone-marrow micronucleus assay in ICR mice orally gavaged at 1.67 - 6.67 g/kg body weight, a mouse spermatocyte chromosome-aberration assay, and a developmental toxicity/teratogenicity study in SD rats fed diets containing up to 10% CR throughout gestation. CR did not produce a biologically meaningful increase in revertant colonies in any tester strain; micronucleated polychromatic erythrocyte frequencies in treated mice did not differ from negative controls; spermatocyte chromosomal-aberration rates were comparable between treated and control groups across doses; and no adverse effects were observed on maternal body-weight gain, reproductive indices, fetal growth and development, or the incidence of external, visceral, or skeletal malformations in rats. Under these experimental conditions, CR showed no genotoxicity, mutagenicity, or reproductive and developmental toxicity, providing a scientific basis for its safe use as a novel food or health-related ingredient and supporting its further development and regulatory evaluation.

1. 引言

莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)，是一种单细胞真核水藻，隶属于绿藻门团藻目衣藻科，是一种卵形单细胞，具两根等长鞭毛用于游动，前端有红色眼点感光[1]。莱茵衣藻生长迅速、周期短，兼具无性与有性繁殖模式，并能通过光合自养、异养等多种方式生长，其世代周期在理想的光照和营养条件下通常仅为8至10小时。其简易的培养特性使其享有“绿色酵母”之称[2] [3]。该藻细胞结构简单，遗传操作便捷且成本低廉，能高效实现遗传转化，因而在分子遗传学与基因工程研究中被广泛应用[4]-[6]。莱茵衣藻中含有丰富的营养物质[7]，其中蛋白质含量高达46.9%，并含有人体所有必需氨基酸；总脂肪酸含量最高，且含有更多的不饱和脂肪酸，ω-3脂肪酸占48%；莱茵衣藻的叶绿素与类胡萝卜素含量显著高于螺旋藻等其他藻类，并富含铜、铁、硒等矿物质及核黄素、烟酸、泛酸等多种维生素[7]。

莱茵衣藻富含的营养成分使其在功能效果方面受到了广泛的关注。Randa Darwish等人采用气相色谱–质谱、分光光度法等方法证实了表明莱茵衣藻富含的叶绿素、类胡萝卜素和硒具有良好的增强免疫、改善贫血并维护皮肤健康等功效[8]；Francis等人通过莱茵衣藻干预DSS诱导的小鼠肠炎模型，结果发现莱茵衣藻可以通过调节肠道微生物群结构组成和代谢从而有效地缓解溃疡性结肠炎[9]；Sheyma Khemiri等人利用面团流变学研究验证了莱茵衣藻作为食品添加剂能够通过改善面团的空间网状结构来优化面包的各项指标[10]；Beth A. Rasala等人选择莱茵衣藻叶绿体作为表达系统进行基因组转化，揭示了莱茵衣藻成为生产人类治疗性蛋白质平台的强大潜力[11]。总之，莱茵衣藻正成为新食品原料领域日趋受人瞩目的冉冉新星。

尽管当前的众多研究报道揭示了包括莱茵衣藻在内的众多微藻类物质的营养成分、食用功效和应用潜力，但是其安全性也日渐成为关注的焦点。Lara Davani等人利用超声固液萃取与BSTFA-TMCS衍生化结合的方法研究发现小球藻、珊藻等藻类可以吸收并富集水体污染物双酚A [12]，可能会增加食品中雌激素物质引发的潜在风险；白渲楹等人在质检过程中发现部分螺旋藻产品存在重金属超标、灰分含量高等问题[13]；Timothy S. Murbach等人通过模拟胃液中TS04蛋白质快速消化，发现衣藻绿藻可能会引起人体的过敏反应[14]。欧盟曾对莱茵衣藻的急性毒性和亚慢性毒性进行了充分的评估并认为其相对安全，但遗传毒性和致敏性尚待进一步验证明确[15]。简而言之，毒理学研究数据的匮乏已经成为莱茵衣藻在食品开发中广泛应用的巨大阻碍[16]。因此，亟需通过系统的毒理学实验科学评价其安全性并建立安全阈值，为其在新食品、功能性食品开发应用等方面提供有力的毒理学依据。

2. 材料与方法

2.1. 材料

莱茵衣藻粉(山西透云生物科技有限公司)。本样品中各营养素含量分别为：蛋白质41.7 g/100 g，脂肪5.3 g/100 g，粗多糖13.9g/100 g，总膳食纤维25.4 g/100 g，矿物质元素磷元素1000 mg/100 g，维生素B2 3.53 mg/100 g，维生素E 45.671 mg/100 g，含有18种氨基酸(包括人体必需的8种氨基酸)，总氨基酸含量为34.24 g/100g。本样品中有毒有害物质的含量均低于相应的国标规定其中包括铅含量0.265 mg/kg，砷含量0.020 mg/kg，汞含量1.07 × 10⁻³ mg/kg，菌落总数(大肠菌群、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等) < 10 CFU/g等；未检测到农药残留以及MC-LR、MC-RR、MC-YR等微囊藻毒素。

甲醛(无锡市展望化工试剂有限公司)，冰乙酸(上海凌峰化学试剂有限公司)，2，4，6-三硝基酚(麦克林)，氢氧化钾(天津市永大化学试剂有限公司)，甘油(山东科源生化有限公司)，水合氯醛(阿拉丁)，茜素红(SIGMA)，组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102 (上海市疾病预防控制中心)，DMSO(SIGMA)，NB培养基(酷来博)，羧甲基纤维素钠(麦克林)，环磷酰胺(SIGMA)，秋水仙素(碧云天)等。

2.2. 动物

本研究选用SPF级(无特定病原体级别) ICR小鼠与Sprague-Dawley大鼠作为实验对象，按实验要求均衡分组进行以下毒理学实验：哺乳动物微核试验、染色体畸变试验和致畸试验，构建完整的生殖发育和遗传毒性评估体系。正式实验开始前，所有动物需经历72小时环境适应期，期间统一按照符合国际标准的实验动物设施(温度恒定20℃~25℃，相对湿度40%~70%，12小时昼夜节律光照)。上述的ICR小鼠由浙江省实验动物中心提供，实验动物生产许可证号为SCXK(浙)2019-0002，实验动物使用许可证号为SYXK(浙)2016-0022。SD大鼠由浙江省实验动物中心提供，实验动物生产许可证号为SCXK(浙)2019-0002，实验动物使用许可证号为SYXK(浙)2016-0022。

2.3. 细菌回复突变试验

采用鼠伤寒沙门氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102菌株，通过平板掺入法评估样品遗传毒性。莱茵衣藻经DMSO溶解并灭菌后，稀释为8、40、200、1000、5000 μg/皿五个剂量组，设空白、溶剂及阳性对照(叠氮钠等)。实验在代谢活化(S9+)与非代谢活化(S9−)条件下同步进行，每浓度三个平行。通过计数组氨酸缺陷菌株的回变菌落数判断结果：若样品组回变菌落数超过空白对照一倍以上，且存在剂量–反应关系或某一浓度点可重复的显著增加，则判定样品具有致突变性。验证试验进一步确认了实验系统的可靠性[17]。

2.4. 哺乳动物红细胞微核试验

选用50只健康ICR小鼠(雌雄各半)，随机分为5组：三个样品剂量组(1.67, 3.34, 6.67 g/kg BW)、阴性对照组(1% CMC-Na)及阳性对照组(环磷酰胺40 mg/kg BW)。样品以1% CMC-Na配制，按20 mL/kg BW每日灌胃两次，间隔24小时。末次给药6小时后取骨髓制片，经甲醇固定、Giemsa染色后观察。每只动物计数至少2000个嗜多染红细胞(PCE)，记录含微核的PCE数(千分率)，并确保PCE/RBC比例不低于阴性对照的20%。结果按性别统计，采用Poisson检验比较组间差异。阳性判断标准为：任一剂量组微核率显著高于阴性对照(P < 0.05)，且存在剂量–反应关系；或虽无剂量关系，但同一剂量在重复实验中仍呈现显著性差异。否则判定为阴性[18]。

2.5. 小鼠精母细胞染色体畸变试验

选用25只健康雄性ICR小鼠(25 g~35 g)，随机分为5组(每组5只)：三个样品剂量组(1.67, 3.33, 6.67 g/kg BW)、阴性对照组(1% CMC-Na)及阳性对照组(环磷酰胺40 mg/kg BW，单次腹腔注射)。样品组每日灌胃一次，连续5天。首次给药后第12天处死动物，处死前4小时腹腔注射秋水仙素(6 mg/kg BW)。取睾丸经低渗、固定、离心后滴片，Giemsa染色。每只动物观察100个中期分裂相细胞，每组共统计500个细胞，记录染色体畸变类型(断裂片段、微小染色体、易位等)及畸变细胞率。采用二项分布比较各剂量组与阴性对照的差异，若畸变细胞率显著增高且存在剂量–反应关系，则判定为阳性[19]。

2.6. 致畸试验

本研究选用SPF级SD大鼠(雌性100只，180~220 g；雄性30只)，在合格环境中交配。受精后将孕鼠随机分为四组：三个莱茵衣藻饲料掺入剂量组(2.5%, 5.0%, 10.0%)及基础饲料对照组，每组不少于19只。于妊娠第6~15天自由摄食含样品的饲料，每日观察记录孕鼠一般状况，并于第0、6、9、12、15、20天称重。妊娠第20天处死孕鼠，记录黄体数、活胎数、死胎及吸收胎数。活胎仔测量体重、体长、尾长及性别，检查外观畸形。每窝取半数胎鼠分别进行骨骼染色(观察骨骼畸形)和Bouins液固定(观察内脏畸形)。数据采用SPSS 13.0进行方差分析和卡方检验，统计各项指标的发生率及组间差异[20]。

3. 结果与分析

3.1. 细菌回复突变试验结果

菌株回变菌落数统计结果详见表1和表2。试验数据显示，在±S9代谢活化系统的条件下，各剂量组受试物诱发的回变菌落数均与溶剂对照组无显著差异(P > 0.05)。而阳性对照组在两种代谢条件下均呈现显著致突变性，其菌落数较溶剂对照组增高2倍以上(P < 0.01)。综合上述结果，莱茵衣藻在细菌回复突变试验中未显示遗传毒性，符合Ames试验阴性判定标准。

3.2. 哺乳动物红细胞微核试验结果

如表3所示，通过统计学分析表明，各性别剂量组的PCE/RBC比值均未低于阴性对照组的20%，证明了莱茵衣藻在本实验条件下未表现出细胞毒性。进一步采用ANOVA方差分析微核率数据发现，所有剂量组的微核细胞率与阴性对照组相比均无显著差异(P > 0.05)，而阳性对照组中含微核的PCE数远高于其他四组，且微核率显著高于阴性对照组，其差异具有显著性意义。综上所述，本试验条件下，未见莱茵衣藻对小鼠骨髓红细胞含微核细胞率产生明显影响，本次检测结果为阴性。

Table 1. Results of the bacterial reverse mutation test (first experiment)

表1. 细菌回复突变试验结果(第一次)

受试物	剂量 (μg/皿)	回变菌落数(X ± SD)
		TA97a		TA98		TA100		TA102
		–S9	+S9	–S9	+S9	–S9	+S9	–S9	+S9
空白 对照	0.0	112.0 ± 12.3	140.3 ± 13.5	30.3 ± 3.2	41.0 ± 4.4	132.3 ± 11.6	160.7 ± 13.4	254.3 ± 15.7	290.7 ± 17.5
溶剂 对照	0.0	121.3 ± 20.5	151.3 ± 20.6	33.3 ± 4.2	44.7 ± 5.0	140.3 ± 21.4	171.3 ± 20.1	260.7 ± 21.2	301.3 ± 21.0
样品	8	108.7 ± 13.2	140.3 ± 8.7	32.3 ± 4.2	41.0 ± 5.2	133.0 ± 9.5	162.7 ± 21.4	249.0 ± 22.6	291.3 ± 20.0
	40	104.3 ± 9.3	132.7 ± 13.0	31.3 ± 3.2	35.3 ± 4.9	125.3 ± 20.0	158.3 ± 16.0	245.7 ± 17.5	301.7 ± 21.8
	200	116.0 ± 14.4	152.7 ± 22.0	33.7 ± 4.0	37.7 ± 5.9	139.7 ± 14.2	160.3 ± 15.5	254.7 ± 21.1	282.7 ± 18.9
	1000	122.7 ± 21.8	138.0 ± 15.6	30.7 ± 5.5	42.3 ± 3.5	136.7 ± 12.7	171.0 ± 14.8	256.3 ± 18.6	295.0 ± 20.0
	5000	118.3 ± 13.2	146.3 ± 12.7	34.0 ± 3.6	45.3 ± 4.5	141.7 ± 13.6	166.7 ± 9.6	260.0 ± 15.5	300.3 ± 16.7
NaN3	2.0	/	/	/	/	2730.0 ± 151.0	/	/	/
Dexon	50	2483.3 ± 100.2	/	1153.3 ± 162.9	/	/	/	853.3 ± 115.0	/
2AAF	10	/	1656.7 ± 202.1	/	4826.7 ± 194.3	/	3026.7 ± 185.6	/	/
1.8HAQ	25	/	/	/	/	/	/	/	926.7 ± 68.1

注：NaN₃——叠氮钠，Dexon——对二甲基氨基苯重氮磺酸钠(敌克松)，2AAF——2-乙酰氨基芴，1.8HAQ——1.8-二羟基蒽醌。

Table 2. Results of the bacterial reverse mutation test (second experiment)

表2. 细菌回复突变试验结果(第二次)

受试物	剂量 (μg/皿)	回变菌落数(X±SD)
		TA97a		TA98		TA100		TA102
		–S9	+S9	–S9	+S9	–S9	+S9	–S9	+S9
空白对照	0.0	109.3 ± 14.7	143.3 ± 13.5	31.3 ± 3.2	41.3 ± 4.7	131.7 ± 11.0	161.3 ± 15.5	253.7 ± 14.6	291.3 ± 17.2
溶剂对照	0.0	123.3 ± 21.2	152.0 ± 20.8	34.0 ± 5.3	43.7 ± 3.5	143.3 ± 21.2	170.3 ± 20.2	264.3 ± 20.3	303.7 ± 21.8
样品	8	108.3 ± 9.3	142.0 ± 17.8	30.7 ± 3.1	40.7 ± 4.6	130.3 ± 13.7	160.3 ± 11.7	252.0 ± 20.9	295.3 ± 18.5
	40	108.3 ± 13.7	151.3 ± 21.9	32.3 ± 4.9	35.3 ± 4.2	127.0 ± 8.9	158.7 ± 15.1	246.3 ± 17.9	301.3 ± 19.7
	200	116.0 ± 15.6	134.7 ± 12.5	31.7 ± 4.7	39.7 ± 5.0	135.3 ± 21.6	152.7 ± 16.8	250.7 ± 14.8	285.7 ± 21.1
	1000	122.7 ± 21.5	148.3 ± 15.5	33.3 ± 4.9	41.0 ± 4.6	138.7 ± 11.7	169.3 ± 9.3	259.7 ± 18.4	297.0 ± 17.1
	5000	119.3 ± 11.6	153.7 ± 9.1	34.0 ± 4.6	42.7 ± 3.2	143.7 ± 15.5	171.0 ± 21.1	262.7 ± 21.1	302.7 ± 20.3
NaN3	2.0	/	/	/	/	2743.3 ± 100.2	/	/	/
Dexon	50	2496.7 ± 251.1	/	1176.7 ± 64.3	/	/	/	870.0 ± 79.4	/
2AAF	10	/	1603.3 ± 158.2	/	4573.3 ± 466.1	/	2966.7 ± 245.4	/	/
1.8HAQ	25	/	/	/	/	/	/	/	953.3 ± 37.9

注：NaN₃——叠氮钠，Dexon——对二甲基氨基苯重氮磺酸钠(敌克松)，2AAF——2-乙酰氨基芴，1.8HAQ——1.8-二羟基蒽醌。

Table 3. Results of mammalian erythrocyte micronucleus assay

表3. 哺乳动物红细胞微核试验结果

性别	组别	剂量(g/kg)	鼠数	PCE数	含微核的PCE数	含微核细胞率(‰)	PCE/RBC (%)
雌	阴性对照	0.0	5	10000	24	2.4 ± 0.4	51.2 ± 0.57
	样品	1.67	5	10000	28	2.8 ± 0.6	51.7 ± 0.57
		3.34	5	10000	28	2.8 ± 0.6	51.8 ± 0.57
		6.67	5	10000	30	3.0 ± 0.4	51.5 ± 0.79
	环磷酰胺	40 mg/kg	5	10000	236	23.6 ± 0.9^*	47.5 ± 0.79
雄	阴性对照	0.0	5	10000	25	2.5 ± 0.6	51.8 ± 0.57
	样品	1.67	5	10000	27	2.7 ± 0.6	51.9 ± 0.82
		3.34	5	10000	30	3.0 ± 0.8	51.5 ± 0.79
		6.67	5	10000	33	3.3 ± 0.6	51.4 ± 0.74
	环磷酰胺	40 mg/kg	5	10000	235	23.5 ± 0.8*	46.8 ± 1.20

注：与阴性对照组比较，^*P < 0.01。

3.3. 小鼠精母细胞染色体畸变试验结果

如表4所示，莱茵衣藻对小鼠精母细胞染色体畸变发生率经统计分析，各剂量实验组与阴性对照组相比，其染色体异常细胞率、常染色体及性染色体早分离率均无统计学显著差异(P > 0.05)。通过与阳性对照组进行对比，其指标显著高于阴性对照组，其差别具有显著性意义(P < 0.01)。综上所述，本研究条件下未观察到莱茵衣藻对小鼠精母细胞染色体畸变发生具有显著影响，该遗传毒性检测结果呈阴性。

Table 4. Results of the chromosome aberration assay in mouse spermatocytes

表4. 小鼠精母细胞染色体畸变试验结果

组别	剂量 (g/kg)	观察 细胞数	性染色体 单价体(个)	常染色体 单价体(个)	染色体 畸变(个)	染色体异常 细胞数(个)	染色体异常 细胞率(%)
阴性对照	0.0	500	0	4	8	6	1.2
样品	1.67	500	0	3	7	7	1.4
	3.33	500	0	2	4	4	0.8
	6.67	500	0	5	10	8	1.6
环磷酰胺	40 mg/kg	500	0	15	68	56	11.2^**

注：^**与阴性对照组比较，P < 0.01。

3.4. 致畸试验结果

3.4.1. 一般观察

试验期间，各组孕鼠摄食、饮水未见异常，体重增长良好，未见中毒表现和体征，也无死亡。

3.4.2. 莱茵衣藻对孕鼠体重增长的影响

如图1所示，每组分配受精鼠至少19只，在剔除未孕受精鼠，阴性对照组与低、中、高三个剂量组的孕鼠数分别是17只、18只、17只和18只，孕鼠的所有指标进入试验统计范围。试验期间，受孕大鼠的体重从第0天的222.75 ± 6.43 g增长到解剖前的385.85 ± 36.03 g，各剂量组孕鼠体重增长情况良好，第0天、第6天、第9天、第12天、第15天、第20天体重、增重及净增重与对照组比较均无统计学意义(P > 0.05)。

Figure 1. Impact of Chlamydomonas reinhardtii on the body weight of pregnant mice

图1. 莱茵衣藻对孕鼠体重的影响

3.4.3. 莱茵衣藻对孕鼠生殖功能的影响

如图2所示，各组孕鼠的黄体数分别是275只、287只、271只、282只，着床数分别是234只、248

Figure 2. Impact of Chlamydomonas reinhardtii on the reproductive function of pregnant rats

图2. 莱茵衣藻对孕鼠生殖功能的影响

只、235只、247只，各组的活胎分别为231只、244只、232只、243只，吸收胎数分别为3只、4只、3只、4只，未发现死胎。各剂量组孕鼠的着床、吸收胎、活胎、死胎、着床前死亡率等指标与对照组相近，差异均无统计学意义(P > 0.05)。本试验条件下未见莱茵衣藻对孕鼠生殖功能产生损害性影响。

3.4.4. 莱茵衣藻对胎鼠生长发育的影响

如表5所示，各剂量组胎鼠的体长(身长 + 尾长)、体重和性别比指标与对照组比较差异均无统计学意义(P > 0.05)。在本试验条件下未见莱茵衣藻喂饲孕鼠对胎鼠生长发育产生影响。

Table 5. Impact of Chlamydomonas reinhardtii on the growth and development of fetal mice

表5. 莱茵衣藻对胎鼠生长发育的影响

组别	受检胎鼠数(n)	体长(cm)	体重(g)	雌：雄
对照组	231	5.091 ± 0.120	3.58 ± 0.18	1.00:1.13
低剂量组	244	5.077 ± 0.132	3.53 ± 0.27	1.00:0.97
中剂量组	232	5.046 ± 0.166	3.55 ± 0.40	1.00:1.00
高剂量组	243	5.086 ± 0.099	3.59 ± 0.23	1.00:1.25

3.4.5. 莱茵衣藻对胎鼠畸变的影响

如表6所示，各剂量组与对照组均未观察到胎鼠发生外观畸形，本试验条件下，未见莱茵衣藻对胎鼠外观畸形的发生产生影响。

如图3所示，对照组、各剂量组都观察到部分胎鼠发生胸骨缺失、囟门增大现象。其中，各组的胸

Table 6. Impact of Chlamydomonas reinhardtii on external malformations of fetal rats

表6. 莱茵衣藻对胎鼠外观畸形的影响

组别	受检胎鼠数(n)	外观畸变率(%)
		脑外露	脊椎裂	腹外露	唇裂	无尾
对照组	231	0 (0.0)	0 (0.0)	0 (0.0)	0 (0.0)	0 (0.0)
低剂量组	244	0 (0.0)	0 (0.0)	0 (0.0)	0 (0.0)	0 (0.0)
中剂量组	232	0 (0.0)	0 (0.0)	0 (0.0)	0 (0.0)	0 (0.0)
高剂量组	243	0 (0.0)	0 (0.0)	0 (0.0)	0 (0.0)	0 (0.0)

Figure 3. Impact of Chlamydomonas reinhardtii on skeletal malformations of fetal rats

图3. 莱茵衣藻对胎鼠骨骼畸形的影响

骨缺失率分别为75.4%、84.1%、77.5%和76.6%，各组胎鼠的囟门增大个数均为2只。各剂量组胸骨缺失、囟门增大与对照组比较均无统计学意义(P > 0.05)。本试验条件下未见莱茵衣藻对胎鼠骨骼畸形的发生产生影响。

如表7所示，对照组和各剂量组均未观察到胎鼠内脏畸形发生，在本试验条件下，未见莱茵衣藻对胎鼠内脏畸形的发生产生影响。

Table 7. Impact of Chlamydomonas reinhardtii on visceral malformations of fetal rats

表7. 莱茵衣藻对胎鼠内脏畸形的影响

剂量	受检胎鼠数(n)	内脏畸形率(%)
		鼻腔充血	脑室充血	肾脏萎缩	上腭裂
对照组	105	0 (0.0)	0 (0.0)	0 (0.0)	0 (0.0)
低剂量组	118	0 (0.0)	0 (0.0)	0 (0.0)	0 (0.0)
中剂量组	112	0 (0.0)	0 (0.0)	0 (0.0)	0 (0.0)
高剂量组	119	0 (0.0)	0 (0.0)	0 (0.0)	0 (0.0)

4. 讨论

民以食为天，粮食安全与饮食健康一直是广受社会各阶层关注的焦点问题[21]。党的十八大以来，习近平总书记多次强调要树立大农业观、大食物观，农林牧渔并举，多途径开发食物来源，构建多元化食物供给体系。微藻作为一种水生光合微生物，不仅分布广泛、环境适应能力强、生长迅速、种植成本低廉，而且可以合成多种高附加值代谢产物，在食品医药等领域具有良好的应用前景并备受关注[22] [23]。万静等人把螺旋藻与苦荞茶按照一定配比，调胶后加工成了保健果冻，从而弥补糖尿病人群由于饮食限制导致的营养失衡，提升免疫力[24]；郑海林等人将小球藻与雪梨结合，开发出了小球藻雪梨复合果汁，以达到增强免疫、降血糖和降血压等功效[25]；郭晋红等人利用裂壶藻经生物发酵、分离、提纯等工艺生产出可供食用的富含DHA的油脂，以达到促进脑部神经发育的功效[26]。这些微藻开发应用不仅有效地拓展增加了食物来源，补充、丰富了我国的食物供给体系，而且为新功能性食品的开发和食品产业的可持续提供了新的方向策略[27] [28]。

莱茵衣藻作为一种兼具食用、药用及能源供给等多重价值的植物资源，不仅富含维生素、脂质、必需氨基酸等生物活性物质成分[29]，还含有丰富的粗多糖和微量元素，如硒、铁、铜等[7] [8]，因此具有多种健康功效并展现出巨大的开发价值与市场潜力[30]。原芝荷等人研究发现莱茵衣藻可以通过改善面团的网络结构来提高馒头等面食口感并增强其风味进而优化产品品质[31]；另有研究表明以莱茵衣藻为主要原料研发的固体饮料、代餐粉等表现出良好的补充硒元素和控制血糖的效果，在糖尿病病人特殊食品、减肥食品开发等方面展现出巨大潜力[32]；赵金瑶等人将莱茵衣藻与酸奶共同发酵能增强酸奶的感官风味并提升其营养价值[33]。

尽管莱茵衣藻具有广阔的应用前景，但毒理学评价数据的匮乏使其在新产品开发实践中受到诸多限制。因此我们通过体内体外试验对莱茵衣藻的安全性进行了综合评价。细菌回复突变是国内外通用地利用特定细菌来快速、低成本地检测物质是否具有致突变性的方法，本试验的结果显示为阴性，表明在试验剂量下未检测到莱茵衣藻的体外遗传毒性，这与王志忠等人对鄂尔多斯钝顶螺旋藻的评估结果一致[34]；哺乳动物微核试验和小鼠精母细胞染色体畸变试验都是国标中通用的体内遗传毒性试验方法，前者通过观察哺乳动物(最常用是小鼠)的细胞中是否存在“微核”，来快速检测物质是否会造成染色体损伤；后者通过检测物质能否引起生殖细胞(具体指精母细胞)染色体损伤直接评估受试物对后代遗传风险的潜在危害。本研究中这两种试验结果均判定为阴性，这表明在试验剂量下莱茵衣藻的体内遗传毒性较为安全，该结果与多力坤·买买提玉素甫等人对海南螺旋藻以及王黎颖对盐藻的评价结果一致[35] [36]。此外，我们通过大鼠致畸试验进一步评估了其对受试动物发育的影响，本研究中当孕鼠饲料中莱茵衣藻粉的掺入量高达10% (100 g/kg)时，其对孕鼠的妊娠过程、胎鼠的生长发育指标(如体重、体长)以及内脏和骨骼的畸形率等观测指标均未显示出与对照组有显著性差异。这表明莱茵衣藻即使在较高的暴露水平下，不仅对亲代无毒，而且对胚胎–胎儿发育的发育也无不良影响，该结论与刘娟等人对黄丝藻的评价结果一致，进一步明确了莱茵衣藻在生殖发育与遗传方面具备良好的安全性[37]。

综上所述，本系列研究通过体内外相结合的方法，从基因突变、染色体损伤到胚胎发育等多个观测终点，对莱茵衣藻进行了综合评价。所有结果均表明其具有较高的生物安全性，未发现潜在的遗传毒性和发育毒性风险。这为莱茵衣藻新型营养源的开发和在功能性食品中的应用提供了翔实的毒理学依据和科学支撑。

NOTES

^*通讯作者。