1. 引言
肝细胞癌是全球范围内常见的高致死性恶性肿瘤之一，多数患者确诊时已处于晚期，预后较差。超过90%的原发性肝癌为肝细胞癌[1]。其主要危险因素包括酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)以及慢性乙型(HBV)和丙型(HCV)肝炎病毒感染[2]。肝细胞癌患者的五年总生存率约为70% [3]。尽管在危险因素识别、早期诊断和治疗方面取得了一定进展，肝细胞癌的发病率、死亡率和复发率仍呈上升趋势[4] [5]。因此，寻找与LIHC发生发展相关的新的预后标志物和治疗靶点具有重要临床意义。
VPS72是EP400和Snf2相关的CBP激活蛋白(SRCAP)染色质重塑复合物的组成部分，在这种情况下，VPS72作为分子伴侣介导H2A向H2A.Z的交换，并在ATP依赖的SRCAP或EP400复合物中充当H2A.Z的识别蛋白[6] [7]。然而，VPS72与肝癌的关联迄今未见报道。因此，本研究通过整合多个大型在线数据库的临床指标与生存数据，采用综合生物信息学分析方法，评估了VPS72基因表达在肝细胞癌中的临床意义。
2. 材料与方法
2.1. ONCOMINE数据库
基于ONCOMINE微阵列数据库(https://www.oncomine.org) [8]分析比较肝细胞癌组织与癌旁正常组织中VPS72的mRNA表达水平。使用以下检索条件：基因名称为VPS72；差异分析(癌组织与正常组织对比)；癌症类型为肝癌；数据类型为mRNA。筛选阈值设定为1.5倍变化率、P值 = 0.01，并选取排名前10%的基因。同时鉴定了共表达模块中与VPS72共表达的基因。所有统计学方法与统计量均直接来自于数据库。
2.2. UALCAN数据库
UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html)是一个综合性公开数据库，基于癌症基因组图谱(TCGA)和临床预后数据，提供肿瘤基因表达及预后生存差异分析[9]。通过提取肝细胞癌(LIHC)与正常组织之间的表达数据，分析了不同LIHC肿瘤分期患者的生存差异，同时评估了LIHC中的高甲基化差异。统计检验采用Student’s t检验，显著性水平设定为p < 0.05。
2.3. GEPIA数据库
基因表达谱交互分析(GEPIA, http://gepia.cancer-pku.cn/index.htm)数据库整合了9736例肿瘤样本和8587例正常组织的RNA-seq表达数据[10]。本文分析了VPS72在肿瘤组织与正常组织中的差异表达情况、生存预后差异以及不同病理分期中的表达特征。在Student’s t检验中以p < 0.05为显著性标准。
2.4. TIMER数据库
TIMER (https://cistrome.shinyapps.io/timer/)是一个基于TCGA数据估算免疫细胞浸润水平的可靠平台，涵盖32种癌症类型的10,897个样本[11]。本文检测了VPS72表达与免疫细胞浸润(包括B细胞、CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞)之间的关系。生成的散点图显示了统计学显著性。
2.5. STRING数据库
STRING (http://string-db.org)是一个公开可用的蛋白质–蛋白质相互作用(PPI)数据库，旨在收集、整合和评估公开数据以研究潜在的蛋白质相互作用网络[12]。利用STRING构建了VPS72的蛋白质相互作用网络，以探索其潜在功能伙伴。
3. 结果
3.1. VPS72在LIHC中的表达水平及预后价值
为探究VPS72在LIHC患者中的预后及潜在治疗价值，本文通过ONCOMINE和UALCAN数据库分析了mRNA表达水平。图1(A)展示了ONCOMINE数据库中20种癌症类型与正常组织VPS72 mRNA表达的对比数据。在不同数据集中均观察到LIHC与正常组织间VPS72转录水平的显著差异(见图1(D)~(G))。Roessler Liver 2统计显示，肝细胞癌(LIHC)组织中VPS72过表达量较正常组织提高2.365倍(p = 2.50E−81)；并且在Roessler Liver统计数据显示LIHC组织中表达量增加2.605倍(p = 8.51E−11)。Chen Liver统计表明LIHC组织VPS72 mRNA表达提升2.342倍(p = 4.54E−20)，而Wurmbach Liver统计显示表达量增加2.006倍(p = 3.79E−8)。通过UALCAN和GEPIA数据库进一步验证发现，LIHC组织VPS72 mRNA表达较正常样本显著上调(均p < 0.05) (见图1(B)~(C))。预后分析显示，UALCAN和GEPIA均表明较低水平的VPS72与更高的总生存率相关(见图1(H)~(I))。综上所述，所有的研究结果均表明，LIHC患者的VPS72转录表达显著增加(所有p值均小于0.001)，且高表达提示预后不良。
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Figure 1. (A) Transcriptional expression of VPS72 in 20 different types of cancer; (D~G) Differences in transcriptional expression were compared using Student’s t-test. The cutoff criteria were as follows: p = 0.01, fold change = 1.5, gene rank = 10%, and data type of mRNA (ONCOMINE); (B) mRNA expression of VPS72 in LIHC samples and adjacent normal liver samples (UALCAN); (C) mRNA expression of VPS72 in LIHC samples and adjacent normal liver samples (GEPIA); (H) Prognostic value of mRNA expression of VPS72 in LIHC patients (UALCAN); (I) Prognostic value of mRNA expression of VPS72 in LIHC patients (GEPIA)
图1. (A) VPS72在20种不同类型癌症中的转录表达水平；(D~G)采用Student’s t检验比较转录表达差异，判定标准如下：p = 0.01、差异倍数 = 1.5、基因排名 = 10%、数据类型为mRNA(数据来源：ONCOMINE)；(B) LIHC组织样本与癌旁正常肝组织中VPS72的mRNA表达水平(UALCAN数据库)；(C) LIHC组织样本与癌旁正常肝组织中VPS72的mRNA表达水平(GEPIA数据库)；(H) VPS72的mRNA表达对LIHC患者的预后价值(UALCAN数据库)；(I) VPS72的mRNA表达对LIHC患者的预后价值(GEPIA数据库)
3.2. LIHC患者中VPS72 mRNA表达与肿瘤进展相关临床病理参数的相关性及VPS72启动子
高甲基化差异表达分析
在观察到LIHC患者中VPS72存在过表达后，本文利用GEPIA和UALCAN数据库针对癌症分期和肿瘤分级的具体临床病理参数展开研究。如图2(A)~(C)所示，VPS72的mRNA表达量与患者病理分期呈显著相关(p < 0.01)。但第四分期中出现的表达量下降可能与数据缺失有关——GEPIA和UALCAN数据库中该分期的样本量分别仅为6例和12例(两者p值均<0.01)。此外，通过UALCAN数据库显示，肝癌中VPS72启动子区域存在显著的高甲基化改变(见图2(D))。
Figure 2. (A~C) Relationship between the mRNA expression of VPS72 and individual cancer stages in LIHC patients. The mRNA expression of VPS72 was strongly associated with the cancer stage of individual patients. P < 0.05 (UALCAN, GEPIA); (D) Differential hypermethylation of VPS72 promoter
图2. (A~C) LIHC患者VPS72 mRNA表达与肿瘤分期的相关性分析。VPS72的mRNA表达水平与患者个体肿瘤分期呈显著相关(P < 0.05，数据来源：UALCAN及GEPIA数据库)；(D) VPS72启动子区域的差异性高甲基化状态
3.3. LIHC中与VPS72相关的免疫细胞浸润
肿瘤浸润淋巴细胞可作为癌症患者前哨淋巴结状态和生存率的独立预测因子。因此，本文通过TIMER数据库研究了VPS72差异表达与免疫细胞浸润之间的相关性。如图3所示，VPS72表达与B细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞的浸润呈正相关。具体数据显示：VPS72表达与CD8+ T细胞(相关系数：0.182，p = 7.33e−04)、巨噬细胞(相关系数：0.333，p = 3.01e−10)、中性粒细胞(相关系数：0.258，p = 1.19e−06)、CD4+ T细胞(相关系数：0.322，p = 1.03e−09)及树突状细胞(相关系数：0.306，p = 8.39e−09)的浸润均存在显著正相关。这些结果强烈提示，在肝癌患者中，VPS72可能通过调节B细胞、CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞等免疫细胞的浸润发挥特定作用。
Figure 3. Correlation between VPS72 and immune cell infiltration (TIMER)
图3. VPS72与免疫细胞浸润的相关性(TIMER数据库)
3.4. VPS72与KRTCAP2在LIHC中的共表达
为了进一步研究VPS72在肝细胞癌(LIHC)中的潜在作用，本文利用共表达数据库挖掘了VPS72的共表达数据(见图4(A))。通过TIMER工具进行的深入分析显示，VPS72与KRTCAP2之间存在相关性(见图4(B))，这表明VPS32可能通过KRTCAP2信号通路参与肝细胞癌的进程。
Figure 4. (A) Co-expression profile of VPS72 (ONCOMINE); (B) Correlation between VPS72 and KRTCAP2 expression in LIHC (GEPIA)
图4. (A) VPS72的共表达谱(ONCOMINE数据库)；(B) LIHC中VPS72与KRTCAP2表达的相关性(GEPIA数据库)
3.5. KRTCAP2在LIHC中的表达验证及生存分析
在GEPIA和UALCAN数据库中检测了KRTCAP2的表达情况。结果显示，KRTCAP2在LIHC中的表达显著上调(见图5(A)~(B))。通过GEPIA和UALCAN数据库进行的生存分析证实，KRTCAP2上调与LIHC患者较短的总生存期相关(见图5(C)~(D))。
Figure 5. (A) mRNA expression of KRTCAP2 in LIHC samples and adjacent normal liver samples (UALCAN); (B) mRNA expression of KRTCAP2 in LIHC samples and adjacent normal liver samples (GEPIA); (C)The overall survival status for the expression of KRTCAP2 (UALCAN); (D) The overall survival status for the expression of KRTCAP2 (GEPIA)
图5. (A) KRTCAP2在LIHC样本及癌旁正常肝组织样本中的mRNA表达水平(UALCAN数据库)；(B) KRTCAP2在LIHC样本及癌旁正常肝组织样本中的mRNA表达水平(GEPIA数据库)；(C) 基于KRTCAP2表达水平的肝细胞癌患者总生存期分析(UALCAN数据库)；(D) 基于KRTCAP2表达水平的肝细胞癌患者总生存期分析(GEPIA数据库)
3.6. LIHC患者中VPS72蛋白的功能相互作用网络
Figure 6. The PPI network of VPS72 (STRING)
图6. VPS72的PPI网络(STRING)
通过STRING数据库对VPS72的PPI网络相互作用进行分析，以确定可能的下游靶点及作用机制。结果发现TRRAP、RUVBL1、MORF4L2、MRGBP、YEATS4、KAT5、MORF4L1、SRCAP、DMAP1和RUVBL2是值得进一步研究和分析的潜在靶基因(见图6)。
4. 讨论
肝细胞癌(HCC)是全球最常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年上升[13]。肝癌干细胞(CSCs)具有无限自我更新、分化和肿瘤再生能力，而干细胞的维持可能是肝癌治疗困难的原因之一[14]。高死亡率表明多数患者确诊时已处于晚期，因此制定早期检测策略以减轻肝癌负担至关重要[15]。VPS72是有丝分裂后实现功能性核重编程的关键因子，并能延长HeLa细胞的细胞分裂末期[16]。人类VPS72 (亦称YL1、YL-1或SWC2)最初被鉴定为一种核DNA结合蛋白，可抑制Kirsten肉瘤病毒转化的NIH3T3细胞的锚定非依赖性生长[17] [18]。然而VPS72与肝癌的关联迄今未见报道，本研究首次揭示VPS72可作为肝细胞癌预后预测的潜在生物标志物。
在本研究中，本文通过ONCOMINE数据库分析了VPS72的表达谱。发现VPS72在包括肝细胞肝癌(LIHC)在内的15种肿瘤类型中呈现高表达。不同数据集均显示LIHC组织与正常组织中的VPS72转录水平存在显著差异。随后利用UALCAN和GEPIA数据库验证了VPS72在LIHC中的高表达现象，并基于相同数据库进一步探究了VPS72在LIHC中的预后价值。结果显示VPS72高表达患者的总生存期更差。这些发现共同表明，VPS72表达可能成为LIHC预后预测的潜在生物标志物。
此外，UALCAN和GEPIA数据库分析表明，LIHC组织中VPS72的mRNA表达显著升高，且该基因的mRNA表达与LIHC患者的个体癌症分期和肿瘤分级显著相关。这种差异在更高的癌症分期和肿瘤分级中更为明显。
然而，在第四分期疾病中观察到的VPS72水平下降可能与数据缺乏有关——UALCAN和GEPIA数据库中分别仅有6例和12例患者数据。同时还发现肝癌中VPS72启动子存在显著的高甲基化改变，与常规认知相反，VPS72的启动子区域呈现高甲基化状态，但其基因表达却显著上调，这提示可能存在更为复杂的表观遗传调控机制。一种可能的解释是，尽管VPS72的核心启动子区域发生高甲基化，但其某个或多个远端增强子区域可能发生了低甲基化，这种正向的调控作用可能超越了启动子甲基化的抑制效应，从而最终导致基因表达的净增加。另一种可能是，VPS72是某个强效致癌信号通路(如MYC或NF-κB通路)的关键下游靶点。在肝癌中，这些通路的持续异常激活可能提供了强大的转录动力，从而克服了启动子高甲基化带来的转录抑制。后续研究可通过整合全基因组甲基化数据(如ChIP-seq)和染色质空间构象数据(如Hi-C)来验证这些假说。
此外，VPS72可能参与免疫细胞浸润过程，其表达水平与B细胞、CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞的浸润程度相关，表明其可能通过调节肿瘤微环境影响肝细胞癌(LIHC)患者的临床结局。浸润的免疫细胞并非均一的抗肿瘤群体。一种被广泛接受的解释是T细胞功能耗竭[19]。高水平的VPS72可能有助于营造一个免疫抑制性的微环境，促使浸润的CD8+ T细胞高表达如PD-1、TIM-3等抑制性受体，虽然其物理上存在于肿瘤中，但已失去杀伤肿瘤细胞的功能。此外，VPS72的高表达可能同时伴随着调节性T细胞(Tregs)或髓源性抑制细胞(MDSCs)等免疫抑制性细胞的富集，这些细胞会抵消细胞毒性T细胞的抗肿瘤作用。最后，肝癌细胞本身可能通过下调MHC-I类分子等方式，产生对T细胞杀伤的固有抵抗，使得免疫浸润无效。未来的研究需要利用多色荧光免疫组化或流式细胞术进一步分析浸润免疫细胞的功能状态和亚型构成。
共表达分析显示VPS72与KRTCAP2在LIHC中存在显著的正相关关系，提示两者可能在同一个生物学通路或复合物中协同发挥作用。重要的是，KRTCAP2并非一个无关的伴随基因。验证发现，KRTCAP2在LIHC组织中的mRNA表达同样显著高于正常组织，且其高表达同样预示着患者更短的总生存期。这种在表达模式和预后价值上的一致性，强烈暗示KRTCAP2是VPS72致癌通路中一个具有独立临床意义的关键协同因子。相比于庞大的蛋白质互作网络，选择一个与VPS72高度相关且自身具有明确临床表型的基因进行后续验证，能使研究焦点更集中。因此，对KRTCAP2的深入探索，是基于“共表达关系到独立临床意义验证”的逻辑链条，为其作为VPS72在肝癌中重要的功能伙伴提供了强有力的依据。通过STRING数据库分析VPS72的蛋白质相互作用，发现其与TRRAP、RUVBL1、MORF4L2、MRGBP、Yeats4、Kat5、MORF4L1、SRCAP、DMAP1和RUVBL2等蛋白存在相互作用，为后续机制研究提供了方向。
本文研究存在一定局限性。研究完全基于公共数据库的回顾性数据，缺乏实验验证来证实VPS72在肝细胞癌中的具体功能机制，提示未来需要结合湿实验进行深入的功能研究。
5. 结论
本研究表明，VPS72与肝癌患者的临床分期和肿瘤分级呈显著正相关。此外，VPS72的高mRNA表达水平与肝癌患者较差的总生存期显著相关。VPS72表达水平升高与肝细胞癌(LIHC)中多种免疫细胞浸润增加存在关联，包括B细胞、CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞。这些结果表明，VPS72有望作为肝癌患者的预后生物标志物并为早期肝癌诊断提供依据。
数据和材料可用性
所有数据均包含于文章中，数据来源于公共数据库，具体数据库信息见方法部分。
伦理批准和参与者同意
所有作者均已审阅最终稿件并同意发表。本研究中的所有临床资料均经机构审查委员会批准，且根据机构审查委员会的程序审查，免除了获取患者同意的要求。
利益冲突
作者声明无利益冲突。
缩 写
LIHC：肝细胞癌
NOTES
*通讯作者。