1. 引言
多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma, MM)是一种恶性浆细胞增生性疾病，具有进展迅速、复发率高、治疗成本高和严重影响患者生活质量等特点。其主要是由于异常浆细胞在骨髓中无控制地增殖，分泌大量单克隆免疫球蛋白，导致骨髓功能抑制、骨质破坏和免疫功能障碍，从而进一步引发肾脏损伤、贫血和高钙血症等并发症[1] [2]。随着疾病的持续进展，患者可能会出现骨痛、骨折以及感染等症状，严重影响日常活动能力，最终可能需要进行骨髓移植或使用靶向治疗等手段以控制病情。
MM的病因复杂多样，尽管遗传易感性、环境暴露(如放射线暴露)和病毒感染等因素可能共同促成其发生，但其确切机制仍未完全明了[3]。现有研究表明，MM不仅涉及浆细胞的基因突变及表观遗传变化，还与骨髓微环境中的其他细胞，特别是免疫细胞之间的相互作用密切相关。恶性浆细胞通过与骨髓间质细胞、内皮细胞、成骨细胞、破骨细胞及其他免疫细胞的相互作用，形成了一个促进MM细胞存活和增殖的有利微环境。特别是骨髓中的Tregs和MDSCs等免疫抑制细胞通过分泌IL-10、TGF-β等免疫抑制因子，抑制效应T细胞的抗肿瘤活性，进一步削弱宿主的免疫监视[4]。与此同时，MM细胞通过分泌RANKL (受体活化因子核因子κB配体)等因子，诱导成骨细胞凋亡、促进破骨细胞增殖，直接导致骨质溶解及骨折风险增加，这是导致MM患者骨病的重要原因[5]。
在治疗方面，近年来的研究表明，MM不仅仅是骨髓浆细胞增生的结果，免疫系统的紊乱也是该疾病发展的关键因素。因此，基于免疫机制的治疗策略逐渐成为继自体造血干细胞移植、免疫调节剂、蛋白酶体抑制剂之后的第四大支柱疗法[6]。例如，嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法通过重编程患者自身T细胞，使其能够精准靶向并杀伤MM细胞，展现了其在复发性和难治性MM患者中的显著疗效[7]。此外，免疫检查点抑制剂如PD-1/PD-L1抑制剂虽然在MM的单药治疗中疗效有限，但与其他药物联合使用可能提高其治疗效果[8]。然而，尽管这些免疫疗法在一定程度上改善了MM患者的预后，免疫微环境中的复杂性和异质性仍然限制了其广泛应用，同时，对于复发的MM耐药性的问题还没有得到解决[9]，因此，探索新的分子机制，寻找新靶点、多靶点治疗手段成为MM治疗的发展方向。
免疫系统在MM中的作用使得基于免疫机制的治疗成为未来的研究热点，而免疫细胞与MM之间的因果关系的深入理解将为免疫治疗的开发提供新的靶点和理论依据。在免疫学研究不断进展的背景下，孟德尔随机化(Mendelian Randomization, MR)作为一种新兴的因果推断工具，通过利用遗传变异作为工具变量，能够有效控制传统流行病学中的混杂因素，进而为免疫细胞与MM的因果关系提供了新的研究思路[10]。双向双样本孟德尔随机化(Bidirectional Two-sample MR)方法允许我们在探讨免疫细胞对MM影响的同时，评估MM是否可能通过特定机制反向影响免疫系统，从而揭示更为复杂的病理机制[11]。近年来，免疫细胞在其他疾病(如骨坏死和炎症性疾病)中的因果关系研究已有所报道，但对MM的研究仍有很多的探索空间[12]。
为进一步阐明免疫细胞在MM发病机制中的具体作用，本研究旨在利用双向双样本孟德尔随机化分析，全面评估731种免疫细胞表型与MM之间的因果关系。本研究将为理解MM的免疫学基础提供新的线索，并为未来的免疫治疗策略开发提供潜在的靶点和理论支持。
2. 方法
2.1. 研究设计
本研究采用双向双样本孟德尔随机化(Mendelian Randomization, MR)方法，评估731种免疫细胞表型与多发性骨髓瘤之间的因果关系。MR分析基于三个假设：① 相关性假设，工具变量(IVs)与暴露因素密切相关；② 独立性假设，IVs与已知或未知的混杂因素无关；③ 排他性假设，IVs仅通过暴露因素影响结局变量。图1展示了总体设计。本研究中收集的所有数据均来自公共数据库，数据上传前均已脱敏，不涉及个人隐私或可识别信息，不涉及信息数据和机构知情同意授权，因此无需伦理批准。
2.2. 暴露和结局数据获取
免疫细胞表型的全基因组关联研究(GWAS)数据来自公开数据库GWAS Catalog (项目编号：GCST90001391至GCST90002121)，数据涵盖了3757名欧洲受试者的731种免疫表型。多发性骨髓瘤的GWAS数据则来自FinnGen数据库，包括345829名欧洲受试者，其中病例787例，对照345105例。
2.3. 工具变量的选择
首先，在免疫细胞的GWAS数据中筛选与暴露因素显著相关的单核苷酸多态性(SNPs)，其阈值设定为P < 1 × 10−5，同时设置连锁不平衡(LD)参数r2为0.01，SNP间距为500 kb，以避免LD对分析结果的影响。随后通过PhenoScanner V2数据库进一步排查混杂因素，剔除潜在的无效SNP。对于所选SNP，使用F统计量检验弱工具变量(F值大于10)，若F值低于10则将其排除，确保分析的稳健性。并剔除掉F统计量 < 10的低相关性SNP，保留高相关性的SNP作进一步分析。最后剩余的SNP是暴露的最终IV。
2.4. 统计分析
本研究使用R软件4.33及TwoSampleMR包进行MR分析。具体统计方法包括逆方差加权法(IVW)、MR-Egger回归、加权中位数法、简单模式法和加权模式法，以IVW为主要分析方法，其他方法作为补充。为验证结果的稳健性，进行敏感性分析，包括Cochran’s Q检验(P > 0.05表示无异质性)和Egger-intercept (P > 0.05表示无水平多效性)。为评估单个SNP对结果的影响，使用敏感性检验进行分析。最终结果以优势比(OR)和95%置信区间(CI)表示，P < 0.05为统计学显著性。
2.5. 反向因果关系分析
为进一步探讨多发性骨髓瘤对免疫细胞表型的潜在反向因果影响，我们进行了反向MR分析，重复上述SNP筛选、统计方法和敏感性分析步骤。
2.6. 结果呈现与数据可得性
所有分析结果均以表格和散点图形式展示。使用的所有数据均为公开数据集，分析过程中未涉及新的数据采集。
Figure 1. Overall design
图1. 总体设计
3. 结果
3.1. 正向因果关系分析
在正向双样本孟德尔随机化分析中，以731种免疫细胞表型作为暴露因素、以多发性骨髓瘤作为结局变量进行分析。使用逆方差加权(IVW)方法为主要分析方法，同时结合加权中位数(WM)、简单模式(Simple mode)、加权模式(Weighted mode)和MR-Egger方法以增强结果的稳健性。在IVW分析中，发现11种免疫细胞表型与多发性骨髓瘤发生具有显著的因果关系(P < 0.05)，其中T淋巴细胞组6个，单核细胞组1个，B细胞组1个，树突细胞组2个(见图2)。其中有7种免疫细胞表型与多发性骨髓瘤呈正相关(OR > 1)，CD8dim %T cell，IVW (OR = 1.16, 95% CI = 1.01 to 1.32, P = 0.033)，CD28- CD127- CD25++ CD8br AC，IVW (OR = 1.17, 95% CI = 1.02 to 1.34, P = 0.027)，CD28 on CD28 + CD45RA- CD8br，IVW (OR = 1.18, 95% CI = 1.01 to 1.36, P = 0.032)，CD19 on IgD+ CD24+，IVW (OR = 1.25，95% CI = 1.07 to 1.45, P = 0.005)，CD62L on monocyte，IVW (OR = 1.15, 95% CI = 1.03 to 1.27, P = 0.009)，CD11c on myeloid DC，IVW (OR = 1.14，95% CI = 1.02 to 1.28, P = 0.027)，CD11c on CD62L+ myeloid DC，IVW (OR = 1.18，95% CI = 1.05 to 1.33, P = 0.007)，而4种表型与其呈负相关(OR < 1), TD DN (CD4-CD8-) AC，IVW (OR = 0.83，95% CI = 0.72 to 0.95, P = 0.008)，CD45RA- CD28- CD8br %CD8br, IVW (OR = 0.99, 95% CI = 0.98 to 1.00, P = 0.002)，CD3 on CD28 + CD45RA + CD8br，IVW (OR = 0.90，95% CI = 0.84to 0.96, P = 0.001)，CD3 on CD39 + CD8br，IVW (OR = 0.89, 95% CI = 0.80 to 1.00, P = 0.041)。敏感性分析结果表示，用于多发性骨髓瘤MR分析的上述11种免疫细胞表型均未发现异质性(Cochran’s Q检验P > 0.05)，也没有水平多效性(MR-Egger截距法P > 0.05)，同时，运用MR-PRESSO炎症IVW模型的分析结果，最终证明因果稳健性的结果是可信的。
3.2. 反向因果关系分析
在反向双样本MR分析中，我们探讨了多发性骨髓瘤对731种免疫细胞表型的潜在反向因果影响。使用IVW法发现，26种免疫细胞表型在反向因果关系中表现出显著关联(P < 0.05) (见图3)。其中10种表型对免疫细胞水平具有正向调控作用(OR > 1)，HLA DR++ monocyte %monocyte，IVW (OR = 1.05，95% CI = 1.01 to 1.10, P = 0.023)，CD39+ activated CD4 regulatory T cell %activated CD4 regulatory T cell，IVW (OR = 1.09, 95% CI = 1.01 to 1.16, P = 0.021)，CD39 + activated CD4 regulatory T cell %CD4 regulatory T cell，IVW (OR = 1.06, 95%CI = 1.01 to 1.11, P = 0.013)，CD25 on IgD + CD24 + B cell，IVW (OR = 1.04, 95% CI = 1.00 to 1.09, P = 0.046)，CD38 on IgD + CD24- B cell, IVW (OR = 1.05, 95%CI = 1.00 to 1.09, P = 0.036)，CD38 on naive-mature B cell，IVW (OR = 1.06, 95% CI = 1.01 to 1.10, P = 0.013)，IgD on transitional B cell，IVW (OR = 1.05, 95%CI = 1.01 to 1.10, P = 0.017)，CD66b on Granulocytic Myeloid-Derived Suppressor Cells, IVW (OR = 1.09, 95%CI = 1.01 to 1.16, P = 0.024)，CD3 on Terminally Differentiated CD8 + T cell，IVW (OR = 1.05, 95%CI = 1.00 to 1.10, P = 0.038)，CD11c on myeloid Dendritic Cel，IVW (OR = 1.05, 95%CI = 1.00 to 1.10, P = 0.034)。而16种表型则表现出负向关联(OR < 1)，CD39+ resting CD4 regulatory T cell Absolute Count，IVW (OR = 0.95, 95%CI = 0.91 to 0.99, P = 0.016), CD39+ resting CD4 regulatory T cell %CD4 regulatory T cell，IVW (OR = 0.95, 95%CI = 0.91 to 1.00, P = 0.036)，CD25++ CD4 + T cell Absolute Count，IVW (OR = 0.95, 95%CI = 0.91 to 1.00, P = 0.032)，CD25++ CD45RA- CD4 not regulatory T cell Absolute Count, IVW (OR = 0.95, 95%CI = 0.91 to 1.00, P = 0.035)，CD45RA- CD4+ T cell Absolute Count，IVW (OR = 0.95, 95%CI = 0.90 to 0.99, P = 0.018)，Central Memory CD4+ T cell Absolute Count，IVW (OR = 0.95, 95%CI = 0.91 to 0.99, P = 0.018)，Central Memory CD8+ T cell Absolute Count，IVW (OR = 0.96, 95%CI = 0.92 to 1.00, P = 0.049)，CD4+ T cell Absolute Count，IVW (OR = 0.95, 95%CI = 0.91 to 0.99, P = 0.019)，CD3- lymphocyte Absolute Count，IVW (OR = 0.96, 95%CI = 0.91 to 1.00, P = 0.039)，Natural Killer Absolute Count，IVW (OR = 0.96, 95%CI = 0.92 to 1.00, P = 0.040)，CD20 on unswitched memory B cell，IVW (OR = 0.96, 95%CI = 0.92 to 1.00, P = 0.045)，PDL-1 on CD14 + CD16+ monocyte，IVW (OR = 0.95, 95%CI = 0.91 to 0.99, P = 0.022)，PDL-1 on CD14- CD16+ monocyte，IVW (OR = 0.96, 95%CI = 0.92 to 1.00 P = 0.0498)，CD16 on CD14+ CD16+ monocyte，IVW (OR = 0.95, 95%CI = 0.91 to 0.99 P = 0.022)，CD80 on monocyte，IVW (OR = 0.99, 95%CI = 0.94 to 0.9 P = 0.016)，CD45RA on naive CD8+ T cell，IVW (OR = 0.95, 95%CI = 0.91 to 1.00 P = 0.0497)。反向敏感性分析结果显示，上述26种免疫细胞表型用于多发性骨髓瘤MR分析均不具有异质性(Q检验P > 0.05)，也不具有水平多效性(MR-Egger截距法P > 0.05，(presso global P > 0.05))。同时，运用MR-PRESSO炎症IVW模型的分析结果，最终证明因果稳健性的结果是可信的。
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Figure 2. Positive causal relationship
图2. 正向因果关系
Figure 3. Reverse causal relationship
图3. 反向因果关系
4. 讨论
本研究首次通过双向双样本孟德尔随机化(MR)方法，系统地评估了731种免疫细胞表型与多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma, MM)发病风险之间的因果关系。基于遗传工具变量的分析提示，正向MR分析结果显示，11种免疫表型与多发性骨髓瘤发病风险具有显著的因果关系；在反向MR中，26种免疫细胞表型与多发性骨髓瘤表现出显著关联(P < 0.05)。
正向MR分析结果显示，7种免疫细胞表型与多发性骨髓瘤发病风险呈正相关，而这些免疫细胞表型缺乏直接在多发性骨髓瘤中的研究。先前的研究表明，在MM患者中，B细胞和T细胞的功能受到显著抑制，记忆B细胞数量的减少削弱了免疫应答，CD8+ T细胞活性降低减少了直接杀伤MM细胞的效果，同时，MM细胞通过降低HLA-I类分子的表达和增加免疫检查点分子(如PD-L1)的表达实现免疫逃逸，避免CD8+ T细胞的识别和清除[13]。另外，免疫抑制微环境的形成，包括调节性T细胞(Tregs)和髓源性抑制细胞(MDSCs)的增加，这些细胞分泌抑制性细胞因子如IL-10和TGF-β，从而帮助肿瘤逃逸免疫监视[14]。这些发现提示，调节特定免疫细胞表型可能成为降低MM发病率的有效途径。
同时，结果提示了4种表型与多发性骨髓瘤的发生呈负相关，为今后多发性骨髓瘤的治疗提供思路。在MM的免疫治疗中，靶向激活或修复CD3+ T细胞功能是一个重要的研究方向。通过双特异性抗体(如BiTEs)将CD3与MM细胞上的特定抗原(如BCMA)连接，可以增强T细胞对MM细胞的识别和杀伤作用[15]。AMG 420的I期临床试验表明了其通过连接T细胞上的CD3和MM细胞上的BCMA来诱导T细胞的杀伤作用，但由于毒性和给药方式的限制，最终没有继续开发[16]。现在临床所使用的新型的抗体药物偶联物、双特异性抗体、免疫调节剂和Bcl-2抑制剂等，都表明免疫调节治疗多发性骨髓瘤的有效性[17]。
反向MR分析进一步揭示了MM对特定免疫细胞表型的潜在调控作用，暗示了免疫系统在MM发病过程中具有双向调节作用。我们发现，MM的发生可能会引起某些免疫细胞表型的变化，这表明MM可能通过抑制特定免疫细胞的功能来逃避免疫监视。这些发现提示，MM不仅与免疫系统的失调有关，可能还通过反馈调控免疫系统，进一步推动疾病的恶化。
此外，我们的研究结果还发现CD11c on myeloid Dendritic Cel与多发性骨髓瘤发病风险之间存在显著的双向关系。我们不仅揭示了CD11c在髓系树突状细胞中的表达增加预示着多发性骨髓瘤更高的发病风险，还指出了多发性骨髓瘤对CD11c表达的反馈性调节作用。这种双向的因果关系表明，一方面CD11c on myeloid Dendritic Cel可能作为MM的促癌因素，CD11c水平升高可影响mDC的免疫调节能力，从而推动肿瘤进展；另一方面，多发性骨髓瘤可能通过其微环境的改变反馈性地促进CD11c在mDC中的表达，从而进一步减弱宿主抗肿瘤免疫应答，推动疾病的进展[18]。CD11c是一种广泛用于识别树突状细胞的标志物，它与CD18结合形成异二聚体细胞粘附受体，在细胞迁移、存活和增殖中发挥作用[19]。当CD11c在人类单核细胞来源的和人类普通的树突状细胞中高度表达时，可以在人类肿瘤中发现CD11c+ 细胞，并且分布在肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)数量较多的区域，这说明了CD11c在肿瘤生长进展中扮演着重要的角色。L. KOVAROVA在一项临床研究中记录了患者在接受治疗期间树突状细胞的变化，发现愈合后的患者血液中拥有更低水平的CD11c表达，这与我们发现的多发性骨髓瘤患者CD11c表达增加相符。研究表明，肿瘤微环境中的免疫细胞在癌症免疫疗法中既可作为抗肿瘤力量，又可被肿瘤利用以逃避免疫的双向性角色[20]。CD11c亚群依靠GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)来维持生存，并且在刺激后能产生高水平的IL-12，并激活初始T细胞，驱动T细胞向Th1亚型分化，从而产生抗肿瘤免疫。一项小鼠的动物实验中表明，PIKfyve消融通过选择性改变非经典NF-κB通路来调控CD11c+细胞(主要是树突状细胞)的功能。CD11c+细胞中PIKFYVE的缺失和阿匹莫德(一种有效且特异性的PIKFYVE抑制剂)的治疗都抑制了肿瘤生长，增强了DC依赖性T细胞免疫，并增强了荷瘤小鼠模型中的免疫检查点阻断(ICB)治疗的功效[21] [22]。这一发现为探寻MM发病机制提出了新的思路，也提示CD11c可能作为双向调控的潜在治疗靶点，未来通过靶向CD11c调控mDC的抗原呈递功能有望改善MM患者的预后。
本研究结果进一步强化了近年来对多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma, MM)与免疫系统复杂关系的理解，揭示了免疫细胞在MM发生和发展过程中的双向调控作用。以往的研究多集中在特定免疫细胞类型的个体作用上，例如B细胞、T细胞或自然杀伤细胞等在MM微环境中的角色。然而，本研究首次通过大规模的全基因组关联分析(GWAS)数据，系统地评估了多种免疫细胞表型对MM的因果作用，涵盖了免疫系统的更广泛维度。通过因果推断分析，我们不仅确认了一些免疫细胞在MM中的作用，还识别了一系列潜在的免疫调节靶点，为未来基于免疫系统的MM治疗策略提供了新的方向和思路。这些发现为精准医学背景下的MM免疫治疗提供了理论支持，有望推动MM治疗手段的多样化和精准化，为患者带来更为有效的治疗选择。
然而，本研究仍存在一些局限性。首先，尽管本研究使用了大样本的GWAS数据，但所有数据均来自欧洲人群，可能存在种族差异，这限制了结果的广泛适用性。其次，虽然MR方法在很大程度上减轻了混杂因素的影响，但我们无法完全排除未测量的混杂因素可能对结果的影响。尤其值得关注的是潜在的水平多效性问题：某些SNP可能通过影响与免疫功能和MM风险均相关的共同生物学通路(例如，涉及炎症调控、细胞增殖或代谢的通路)来同时作用于暴露和结局，从而可能使因果估计产生偏倚。尽管我们的敏感性分析(如MR-Egger截距和MR-PRESSO)未发现显著的多效性证据，但仍不能完全排除这一可能性。最后，本研究基于遗传工具变量进行分析，虽然通过敏感性分析验证了结果的稳健性，但未来仍需通过功能性实验进一步验证这些因果关系。
5. 结论
综上所述，本研究首次通过全面的双向双样本MR方法，提供了遗传学证据支持多种免疫细胞表型与多发性骨髓瘤发病风险之间存在复杂的因果关系。这些结果为理解MM的免疫学机制提供了新的见解，并为未来的免疫治疗策略开发提供了理论依据。
基金项目
四川省科技厅项目(25NSFSC2602)。
NOTES
*通讯作者。