1. 引言
系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种累及多系统的慢性自身免疫性疾病，目前缺乏有效的根治手段，需要长期药物治疗[1]。临床上一般以糖皮质激素作为主要治疗药物，但单一药物治疗往往效果不佳，且长期使用激素严重影响SLE患者的生活质量[2]。免疫抑制剂也是SLE治疗的常用药物，有研究表明糖皮质激素与免疫抑制剂联合使用可以有效控制SLE，从而降低激素的使用量，减少副作用的发生[3]。
甲泼尼龙(methylprednisolone)为糖皮质激素，研究显示，糖皮质激素通过调控基因的转录抑制多种细胞因子(如TNF-α、白介素-2及白介素-6等)的合成从而影响细胞因子的分泌[4]。沙利度胺(thalidomide)是一种氨基酸衍生物，治疗SLE副作用小且不易复发，是SLE的二线药物[5]。来氟米特(leflunomide)为新型的免疫抑制剂，具有抗增殖活性，不仅能够抑制自身免疫，还能稳定肾脏功能，是SLE的常用药物[6] [7]。一项研究显示，沙利度胺联合来氟米特治疗SLE的效果优于泼尼龙和环磷酰胺[8]；另一项研究表明沙利度胺联合来氟米特治疗SLE的效果强于甲泼尼龙联合来氟米特[3]。这些研究显示沙利度胺联合来氟米特治疗SLE的有效性，同时避免了使用激素所产生的副作用。然而甲泼尼龙作为SLE的一线药物，是否能被沙利度胺和来氟米特两种免疫抑制药的联用完全取代，尚存疑问。本研究以咪喹莫特(Imiquimod)在C57/BL6小鼠上构建SLE模型，通过比较沙利度胺分别联合甲泼尼龙和来氟米特对SLE小鼠的治疗效果，探讨来氟米特替代甲泼尼龙联合沙利度胺治疗SLE的可能性，以期为临床合理用药提供科学依据。
2. 材料与方法
2.1. 实验动物
健康雌性C57BL/6J小鼠40只，无特定病原体，体重16~20 g，6~8周龄，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司(生产许可证号：SCXK(鲁)20220006)。所有动物饲养在济宁医学院实验动物中心【SYXK(鲁)20240004】，饲养温度22℃~24℃，湿度40%~70%，12 h光照/12 h黑暗循环照明。所有动物实验操作均按照济宁医学院动物伦理审查委员会章程进行(伦理审批号：JNMC-2025-DW-221)。
2.2. 试验试剂与仪器
咪喹莫特(四川明欣药业有限责任公司)；4%多聚甲醛通用型组织固定液(biosharp)；小鼠抗-dsDNA IgG特异性ELISA试剂盒(Alpha Diagnostic International)；抗IgG-FITC (Cell Signaling)，FITC anti-mouse B220 (Biolegend, 103205)，PE anti-mouse GL7 (Biolegend, 144607)，APC anti-mouse CD95 (Biolegend, 152604)，APC anti-mouse CD138 (Biolegend, 142506)，PE anti-mouse CD3 (Biolegend, 100205)，Brilliant Violet 421 anti-mouse CD11c (Biolegend, 117343)。
微孔板检测仪(BioTek CYTATION 5，美国)，正置光学显微镜(OLYMPUS，日本)，流式细胞仪(BD FACS VERSE，美国)，激光共聚焦荧光显微镜(Leica TCS SP8，德国)。
2.3. 系统性红斑狼疮小鼠模型建立及给药方案
40只C57BL/6小鼠在清洁级环境下适应性饲养7天后，随机分为4组，每组10只，分别为：① 空白组，简称NC组；② 造模组，简称Model组；③ 沙利度胺联合来氟米特组，简称Lef组；④ 沙利度胺联合甲泼尼龙组，简称Methy组。在Model组、Lef组和Methy组小鼠上构建SLE模型，方法如下：取咪喹莫特乳膏1.25 mg，均匀涂抹小鼠右耳皮肤，每周给药3次，连续给药7周。
小鼠SLE建模开始两周后，NC和Model组接受0.9% NaCl溶液作安慰剂灌胃治疗。Lef组接受沙利度胺和来氟米特混合悬浊液的灌胃治疗，Methy组接受沙利度胺和甲泼尼龙混合悬浊液的灌胃治疗。小鼠的给药剂量为人的12.3倍，参考人的初始给药剂量：沙利度胺(100 mg∙d−1)、来氟米特(20 mg∙d−1)和甲泼尼龙(8 mg∙d−1)以及小鼠发病情况确定如下治疗策略：
NC组：灌胃0.9% NaCl溶液，每周3次，连续灌胃7周。
Model组：灌胃0.9% NaCl溶液，每周3次，连续灌胃7周。
Lef组：沙利度胺(17.6 mg∙kg−1∙d−1)和来氟米特(3.5 mg∙kg−1∙d−1)，每周3次，灌胃2周后，沙利度胺剂量减少25%，来氟米特剂量减少50%，每周3次，灌胃2周后，沙利度胺剂量减少50%，来氟米特维持剂量，每周3次，灌胃1周后，改为每天灌胃，持续1周后沙利度胺和来氟米特恢复初始剂量，每天灌胃，持续1周。
Methy组：沙利度胺(17.6 mg∙kg−1∙d−1)和甲泼尼龙(1.4 mg∙kg−1∙d−1)，每周3次，灌胃2周后，沙利度胺剂量减少25%，甲泼尼龙剂量减少50%，每周3次，灌胃2周后，沙利度胺剂量减少50%，甲泼尼龙维持剂量，每周3次，灌胃1周后，改为每天灌胃，持续1周后沙利度胺和甲泼尼龙恢复初始剂量，每天灌胃，持续1周。
2.4. 小鼠脾脏重量和脾细胞检测
药物治疗7周后解剖小鼠，取脾脏称重。研磨脾脏，制备单细胞悬液，1700 rpm离心5 min后向细胞沉淀中加入红细胞裂解液，反应5 min后加入PBS终止，离心，PBS重悬细胞沉淀。以不少于1 × 106个细胞∙mL−1的密度分装脾细胞悬液，加入FITC anti-mouse B220，PE anti-mouse GL7，APC anti-mouse CD95，APC anti-mouse CD138，PE anti-mouse CD3和Brilliant Violet 421 anti-mouse CD11c抗体，4℃孵育30 min，PBS洗涤重悬，流式细胞仪上机检测。
2.5. 苏木精–伊红(HE)染色法观察小鼠肾脏组织的病理变化
小鼠处死后，取出肾组织，以4%多聚甲醛溶液固定，包埋后制备石蜡切片，进行HE染色。显微镜下观察肾脏组织病理学变化。
2.6. 酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测血清中抗ds-DNA的水平
取小鼠眼球血置于抗凝管中，4000 rpm离心15 min，取上清移入EP管中，利用ELISA法检测血清中抗ds-DNA水平。按照试剂盒说明书进行操作。
2.7. 免疫荧光法检测肾组织切片中IgG的水平
取小鼠肾脏组织，固定、包埋后制备石蜡切片，经二甲苯脱蜡后依次浸泡95%、90%、85%、80%和75%乙醇和纯水进行水化，滴加3%的过氧化氢孵育，随后利用微波加热修复抗原，5% BSA封闭，滴加FITC标记的抗小鼠IgG抗体室温孵育2 h，PBS洗去未结合抗体，DAPI染色封片后以激光共聚焦显微镜观察荧光信号。
2.8. RNAseq测定脾组织表达
取一定量1.4中制备的脾细胞悬液，每个小鼠对应一个样本，每组选取3个样本，离心后得细胞沉淀，加入1 mL TRIzol收取细胞至1.5 mL EP管中，进行RNAseq，分析差异表达基因，进行GO和KEGG富集分析。
2.9. 统计学处理
采用GraphPad Prism 8统计数据并绘制图表。计量资料以平均数 ± 标准差表示。组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t-检验。p < 0.05表示具有统计学意义。
3. 结果
3.1. 来氟米特和甲泼尼龙分别联合沙利度胺治疗SLE小鼠对脾脏重量的影响
脾脏肿大是咪喹莫特诱导的SLE的典型特征，通过测定各组小鼠脾脏重量，发现Model组小鼠平均脾脏重量是NC组小鼠的1.74倍，呈现显著升高的现象(p < 0.05)，说明SLE造模成功。经药物治疗后，Lef组和Methy组小鼠脾脏重量低于Model组，且差异具有显著性(p < 0.05)，说明经过来氟米特或甲泼尼龙联合沙利度胺治疗后，SLE小鼠脾脏肿胀现象得到缓解，而Lef组和Methy组相比，脾脏重量未呈现显著差异(p > 0.05) (图1)。
Figure 1. Spleen weight of mice in each group (n = 6, *p < 0.05, ns: p > 0.05)
图1. 各组小鼠脾脏重量(n = 6, *p < 0.05, ns: p > 0.05)
3.2. 来氟米特和甲泼尼龙分别联合沙利度胺治疗SLE小鼠对肾脏组织病理学观察
对NC组、Model组、Lef组和Methy组肾组织切片进行HE染色，观察显示，NC组小鼠肾组织不存在明显的病理学变化。Model组可见部分肾小球系膜细胞增生，伴基质增多。Lef组和Methy组较Model组损伤均较轻，仅有局部轻微的肾小管肿胀及肾小球轻微的细胞增生，无炎细胞浸润，且Methy组较Lef组更接近正常生理状态，肾组织形态结构更为完整(图2)，说明与来氟米特相比，甲泼尼龙联合沙利度胺更能缓解SLE造模引起的肾损伤。
Figure 2. Histopathological changes of kidney in each group (HE staining, ×400)
图2. 各组小鼠肾组织病理学变化(HE染色，×400)
3.3. 来氟米特和甲泼尼龙分别联合沙利度胺治疗SLE小鼠对血清抗ds-DNA抗体的影响
抗ds-DNA抗体与SLE密切相关，是诊断SLE的重要指标之一。NC组、Model组、Lef组和Methy组的血清抗ds-DNA抗体分别为(24.37 ± 8.86)，(80.27 ± 19.91)，(58.87 ± 23.26)，(57.67 ± 9.92) ng∙mL−1。与NC组小鼠相比，Model组小鼠血清中抗ds-DNA抗体含量显著增加，有统计学意义(p < 0.05)。经药物治疗后，与小鼠相比，Lef组和Methy组抗ds-DNA抗体含量与Model组差异无统计学意义(均p > 0.05)，但都有下降趋势(图3)，说明以来氟米特和甲泼尼龙分别联合沙利度胺治疗SLE小鼠，对小鼠血清抗ds-DNA抗体影响较微弱。
Figure 3. Serum concentration of anti-ds-DNA in mice of each group (ng∙mL−1) (n = 3, *p < 0.05, ns: p > 0.05)
图3. 各组小鼠血清抗ds-DNA抗体浓度(ng∙mL−1) (n = 3, *p < 0.05, ns: p > 0.05)
3.4. 来氟米特和甲泼尼龙分别联合沙利度胺治疗SLE小鼠对肾组织IgG的影响
通过免疫荧光探究肾脏IgG沉积情况。结果显示，NC组肾小球无IgG沉积，Model组小鼠肾小球毛细血管袢和系膜区出现IgG免疫复合物沉积。与Model组相比，Lef组IgG荧光强度无明显差异，而Methy组肾小球中IgG的荧光强度明显减弱(图4)。说明与来氟米特相比，甲泼尼龙联合沙利度胺治疗SLE小鼠，更能有效降低小鼠肾组织中IgG免疫复合物沉积。
注：白色箭头指示肾小球。
Figure 4. Immunofluorescence staining of IgG (A) and IgM (B) deposition in mouse glomeruli (n = 6)
图4. 免疫荧光检测小鼠肾小球中IgG (A)和IgM (B)的沉积情况(n = 6)
3.5. 来氟米特和甲泼尼龙分别联合沙利度胺治疗SLE小鼠对脾脏免疫细胞的影响
由于治疗组显著改善免疫复合物沉积，而免疫球蛋白主要来源于B细胞，我们利用流式细胞术测定各组小鼠脾脏中B细胞、T细胞等免疫细胞的数量。结果显示，与空白组相比，造模组小鼠脾细胞总数(图5(A))升高(p < 0.05)，经治疗，Lef组和Methy组脾细胞总数皆低于造模组(p < 0.05)，但两治疗组之间无显著差异(p > 0.05)。进一步测定脾细胞亚群发现，与造模组相比，B220+脾细胞数量(图5(B))、CD3+脾细胞数量(图5(E))和DC数量(图5(F))在两治疗组中显著下调，其中Methy组B220+脾细胞数量低于Lef组，差异具有显著性(p < 0.05)，而CD3+脾细胞数量和DC数量在两治疗组间无显著差异(p > 0.05)。B220+脾细胞多数为B细胞，分析B细胞亚群发现，两治疗组的生发中心B (GC B)细胞较造模组显著降低(p < 0.05) (图5(C))，同时，两治疗组间相比，Methy组GC B细胞显著低于Lef组(p < 0.05)，而浆细胞数量虽在造模后上升(p < 0.05)，但两治疗组未明显改变其水平(p > 0.05) (图5(D))。这些结果说明SLE造模使小鼠B、T和DC等免疫细胞增生，而来氟米特和甲泼尼龙分别联合沙利度胺能有效改善SLE的免疫细胞增生现象，并且甲泼尼龙联合沙利度胺的改善效果更好，主要表现在其更大程度上降低生发中心B细胞的方面。
![]()
Figure 5. Flow cytometry analysis of splenic immune cell populations (n = 5, *p < 0.05, ns: p > 0.05). (A) Total splenocyte count in each group; (B) Number of B220+ splenocytes in each group; (C) Number of GC B cells in each group, gated from B220+GL7+CD95+ cells; (D) Number of plasma cells in each group, gated from B220+CD138- cells; (E) Number of CD3+ splenocytes in each group; (F) Number of dendritic cells (DCs) in each group, gated from CD11c+ cells
图5. 流式细胞术检测脾脏免疫细胞数量(n = 5, *p < 0.05, ns: p > 0.05)。(A) 各组小鼠脾细胞总数；(B) 各组小鼠B220+脾细胞数量；(C) 各组小鼠GC B细胞数量，GC B细胞圈自B220+GL7+CD95+门；(D) 各组小鼠浆细胞数量，浆细胞圈B220+CD138-门；(E) 各组小鼠CD3+脾细胞数量；(F) 各组小鼠DC细胞数量，DC细胞圈自CD11c+门
3.6. 脾细胞RNA测序结果分析
为进一步从分子水平对比两种治疗方案对SLE的治疗效果，我们对四组小鼠的脾细胞进行转录组测序。差异基因分析显示，与Model组相比，Methy组中SLE相关关键基因ACOD1水平升高，差异接近显著水平(p = 0.067)，Rbp4、HPX、Cyp2e1等SLE发病标志分子显著降低(p < 0.05) (图6)，而Lef组中以上基因表达水平与Model组无显著差异(p > 0.05)，这进一步说明，甲泼尼龙联合沙利度胺在缓解SLE症状中较来氟米特的效果更优越。
Figure 6. Expression levels of key SLE-related genes in the Model and Methy groups based on spleen cell transcriptome sequencing (n = 3, *p < 0.05, ns: p > 0.05)
图6. 脾细胞转录组测序结果中SLE相关关键基因在Model和Methy组的表达情况(n = 3, *p < 0.05, ns: p > 0.05)
4. 讨论
本研究以沙利度胺分别联合来氟米特和甲泼尼龙的方案治疗SLE，对比来氟米特和甲泼尼龙在治疗SLE时发挥的关键作用。结果显示两种联合治疗方案均能显著缓解SLE小鼠的脾脏肿胀和免疫细胞增生现象，与之前研究结果相符。其中甲泼尼龙联合沙利度胺疗法在减轻肾脏病理损害和降低肾组织IgG沉积、减少脾脏B细胞和生发中心B细胞以及改变SLE相关关键基因表达水平方面效果更佳，进一步证实了甲泼尼龙联合沙利度胺对治疗SLE小鼠更具有效性。
SLE发病的重要原因为：B淋巴细胞功能异常，进而引发免疫球蛋白分泌异常和肾损伤等症状[3]。甲泼尼龙联合沙利度胺在缓解肾损伤和降低免疫复合物沉积方面表现出更优于来氟米特联合沙利度胺的效果，可能与甲泼尼龙对B细胞的较强抑制能力有关。临床治疗显示，高剂量甲泼尼龙是慢性淋巴细胞白血病(CLL)复发的挽救治疗手段[9]，而CLL是一种成熟B淋巴细胞克隆增殖性肿瘤，姚等证明高浓度甲泼尼龙抑制MEC-1细胞增殖活性，诱导细胞凋亡[10]。这些研究从侧面证明甲泼尼龙对B细胞发挥抑制增殖和诱导凋亡的作用。在机制层面，甲泼尼龙为糖皮质激素(GC)，GC主要通过基因和非基因两条通路发挥治疗作用：一方面GC结合胞质糖皮质激素受体(GCR)引发基因通路，抑制AP-1和NF-κB等转录因子，从而减少促炎因子如IL-2、IL-6和TNF-α等的合成；另一方面，GC与膜表面GCR互作，诱导单核细胞凋亡，降低免疫活性，或通过与细胞膜的理化互作，影响阳离子转运，抑制炎症活性。通过基因和非基因的途径，GC发挥抑制T、B细胞增殖和活化，抑制免疫球蛋白产生、干扰单核与中性粒细胞向炎症部位迁移等多样化的调节功能[11]。而来氟米特是一种免疫抑制剂，它的作用机制是抑制二氢乳酸脱氢酶和酪氨酸激酶的活性，抑制嘧啶合成，从而影响淋巴细胞的增殖和活化，减少自身抗体的产生[12]。与甲泼尼龙相比，来氟米特作用较单一，发挥的治疗效果有限。
此外，在本研究中，脾细胞转录组测序显示Methy组ACOD1水平高于Model组。据报道，ACOD1基因敲除加重咪喹莫特诱导的小鼠SLE表型，说明ACOD1在SLE中发挥保护性作用[13]。ACOD1介导衣康酸的合成。SLE病人衣康酸血清水平降低，补充衣康酸可缓解SLE中的器官损伤[14]。这些结果显示甲泼尼龙可能通过上调ACOD1缓解SLE。Methy组和Model组的下调差异基因中，Rbp4 [15]、HPX [16]、Cyp2e1 [17]等都是SLE发病的标志分子，它们的降低也说明甲泼尼龙对SLE的明显缓解作用。
综上所述，甲泼尼龙联合沙利度胺对SLE的治疗中展现出了来氟米特联合沙利度胺所不能达到的治疗效果，说明来氟米特无法完全替代甲泼尼龙在SLE的应用。在临床治疗SLE中，特别是中、重度患者时，建议考虑甲泼尼龙联合其他药物的疗法，以达到更好的治疗效果。本研究为SLE的联合治疗提供了新的实验依据，尤其是甲泼尼龙联合沙利度胺在肾脏保护和细胞免疫调控方面的优势。然而本研究仅采用了小鼠模型进行实验研究，与人类发病存在一定的差异。因此，未来尚需在临床试验中进一步验证。
基金项目
济宁医学院大学生创新训练计划(cx2023181)；济宁医学院高层次科研项目培育计划(JYGC2022KJ001)。
NOTES
*通讯作者。