基于PHD-HIF轴探讨黑地黄方改善肾性贫血的机制

Exploring the Mechanism of Hei Di Huang Formula in Ameliorating Renal Anemia via the PHD-HIF Axis

摘要: 目的：探讨黑地黄方改善肾性贫血的作用机制与其影响脯氨酰羟化酶–低氧诱导因子(PHD-HIF)轴有关。方法：通过归纳分析现有文献，发现PHD-HIF轴是治疗肾性贫血的重要通路，黑地黄方能有效改善肾性贫血，通过文献检索黑地黄方组方药物的现代药理学研究结果，分析其影响PHD-HIF轴的活性成分与作用基础，从而论证黑地黄方可能通过影响PHD-HIF轴改善肾性贫血。结果：黑地黄方能有效改善肾性贫血，其组方药物中的有效成分能影响PHD活性与HIF-1α稳定性。结论：黑地黄方可能通过PHD-HIF轴改善肾性贫血。

Abstract: Objective: To investigate whether the mechanism by which the Hei Di Huang Formula (HDHF) ameliorates renal anemia (RA) is related to its influence on the prolyl hydroxylase-hypoxia-inducible factor (PHD-HIF) axis. Methods: Through a review and analysis of existing literature, the PHD-HIF axis was identified as a crucial pathway for treating RA. Given the established efficacy of HDHF in improving RA, modern pharmacological research findings on the constituent herbs of HDHF were retrieved. The active components and their potential basis for influencing the PHD-HIF axis were analyzed to evaluate the hypothesis that HDHF ameliorates RA by modulating this axis. Results: HDHF is effective in ameliorating RA. The active compounds in HDHF can influence PHD activity and HIF-1α stability. Conclusion: HDHF may ameliorate renal anemia by modulating the PHD-HIF axis.

1. 引言

肾性贫血(RA)是指各类肾脏疾病导致人体内红细胞生成素(erythropoietin, EPO)绝对或相对生成不足，同时伴随尿毒症毒素通过抑制红细胞生成和缩短红细胞寿命而发生的一类贫血[1]。慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)患者中RA的发生率极高，贫血程度也会随着肾功能不断恶化而愈发严重，这类患者常常处于炎症的状态，还会在铁代谢方面出现紊乱的情况。目前仅就我国而言，CKD的患病人数已达上亿人数之多，其中，仅成人的患病率就高达10.8%，因此肾脏病的防治问题已成为我国当下所面临的诸多公共卫生问题中的重中之重[2]。一项针对非透析依赖性CKD患者的回顾性研究表明，贫血的患病率以及发病率会随着CKD阶段的升高而呈现增长态势，在CKD处于3a至5期的患者中，贫血的发病率在33.8至39.6这个区间[3]。在2019年发表的一项相关研究中，纳入了上海28家血液透析中心的8392例维持性血液透析(Maintenance Hemodialysis, MHD)患者，观察发现Hb能够达到110~130 g/L水平的患者仅占总样本量的40.40%至47.48% [4]。现代研究已经发现，贫血对肾脏疾病的发生发展有一定的推动作用，还会使终末期肾脏疾病、心血管事件及死亡的风险显著增加[5]，并影响肾脏疾病患者的生活质量。因此积极改善RA对CKD患者的生存及生活意义重大。

临床应用黑地黄方治疗肾性贫血取得良好疗效，本文通过整理黑地黄方改善肾性贫血的临床研究，在结合该方组成药物药理学研究进展的基础上，基于脯氨酰羟化酶–低氧诱导因子(Prolyl Hydroxylase-Hypoxia-Inducible Factor, PHD-HIF)轴探讨黑地黄方改善肾性贫血的潜在机制，为后续进一步的临床研究提供理论依据。

2. PHD-HIF轴影响肾性贫血的机制

低氧诱导因子(HIF)在哺乳动物应对低氧环境时发挥重要调节作用，它由HIF-α和HIF-β亚基组合而成的异源二聚体。其中，HIF-α是低氧应答环节的关键亚基，当机体处于低氧条件中时，其受氧分压的调节而被激活，然后对与低氧有关的基因进行刺激，这样细胞组织才能与低氧应激环境相适应。脯氨酸羟化酶(PHD)在HIF的整个反应过程中充当限速酶的角色，当机体处于常氧状态时，体内的HIF可被PHD羟化，羟化后的HIF可通过与E3泛素连接酶结合而降解。

CKD患者的体内，会出现肾血流减少和毛细血管稀疏化的表现[6]，这些均会导致肾组织缺氧。严重的肾组织缺氧会抑制PHD的活性，导致HIF激活增多，进而促进低氧相关基因的表达，使机体适应低氧环境。这一病理生理改变也是PHD-HIF轴能够成为治疗RA的重要通路的根本原因。PHD-HIF轴影响血红蛋白生成的主要途径如下。

2.1. HIF-PHD轴影响EPO产生

EPO主要是由肾脏中的促红细胞生成素合成细胞(Renal Erythropoietin-Producing Cells, REPC)生产，EPO在体内与位于骨髓的红细胞前体细胞表面受体相结合，从而参与红细胞的成熟过程[7]。在生理氧环境中，仅有少部分REPC合成EPO；REPC位于肾脏皮、髓质交界区，在肾脏功能受损时REPC亦受到影响，导致EPO分泌不足，这是CKD患者缺乏EPO、导致肾性贫血的最主要原因。研究发现，机体产生EPO的主要刺激因素是缺氧[8]，低氧环境或者PHI存在可促进HIF-α与HIF-β亚基直接结合形成二聚体HIF，其在细胞核内，通过与EPO增强子序列发生特异性结合，推动REPC合成并分泌EPO，EPO进入血液循环后，最终发挥促红细胞生成的生物学效应[9] [10]，使机体适应低氧环境，从而起到改善肾性贫血的作用。

2.2. PHD-HIF轴影响铁代谢

铁缺乏及高铁调素状态在RA患者中普遍存在，研究表明，PHD-HIF抑制(hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibitor, HIF-PHI)可通过下调铁调素、促进铁吸收，进而改变铁代谢[11]。铁作为Hb的重要组成部分，二价金属转运体(divalent metal transporter 1, DMT1)、肠上皮细胞膜上的膜铁转运蛋白(ferroportin, FPN)和十二指肠细胞色素B (duodenal cytochrome B, Dcy tB)是参与铁吸收过程的重要蛋白。FPN是目前发现的唯一参与细胞内铁向血浆转运的细胞铁输出蛋白，在FNP的作用下，循环铁作为人体铁供给的重要载体，被转铁蛋白输送到骨髓等部位，成为Hb合成必须的原料。铁调素(hepcidin, Hepc)在铁吸收与转运的过程中具有重要的作用，其能够与细胞表面的FPN结合而形成Hepcidin-FPN复合物，该复合物可以诱导FPN的泛素化和降解，进而起到减少人体储备铁的释放、抑制肠道铁的吸收的作用。CKD以及与之相关的炎症均可引起Hepc水平升高[11]，通过影响铁的吸收和利用，引发肾性贫血[12]。研究发现，HIF-2α在铁的摄取中发挥关键作用，铁缺乏的动物实验研究显示，HIF-2α能够促进参与铁吸收的Dcy tB和DMT1的水平，促进饮食铁的吸收[13]，与此同时，铁缺乏可导致铁依赖的PHD活性下降，使得PHD对HIF-2α的分解降低[14]，累积的HIF-2α通过上调FPN1 mRNA表达，促进细胞铁进入血液循环，促进血红蛋白合成，合成的血红蛋白通过运输氧气缓解缺氧状态。由此可见，PHD-HIF轴与铁的代谢和调节密切相关。

2.3. PHD-HIF轴影响造血干细胞产生

PHD-HIF轴不仅调控下游靶基因表达，更直接影响造血干细胞(Hematopoietic Stem Cell, HSC)的稳态与功能。在骨髓中处于静止状态的造血干细胞具有分化成造血祖细胞的潜能[15]。HIF-1α水平的精确调控对于维持HSC的静息状态、自我更新能力和应激应答至关重要[16]。研究表明，PHD抑制剂(HIF-PHI)通过抑制PHD、稳定HIF-1α，可有效增强HSC的细胞周期静止[17]，如此可提高其分化成造血祖细胞的潜能。

因此，PHD-HIF轴主要通过影响EPO的生成、调节铁代谢以及稳定造血干细胞，成为改善RA的重要通路。

3. 黑地黄方治疗肾性贫血的研究现状

3.1. 肾性贫血的中医病机

“肾性贫血”可归属于中医学“虚劳”、“血劳”以及“肾劳”等范畴。大多数医家认为血虚、虚劳病因主要与饮食、情志、劳倦内伤及外邪侵袭相关，致使脾肾亏虚，气血化生乏源，湿浊瘀毒内生，耗伤气血。其病理因素主要因气、血亏耗，气虚不能化生血液，血虚则不能生气，气虚阳不足，血虚阴亦衰，日久阴阳失衡，病情趋于复杂化。其病机主要以“正虚”为本，“邪实”为标，其“正虚”指该病病程长，脾肾亏虚不能生精化血，充养形体；“邪实”指脾虚运化失职湿热瘀毒蕴结。由此可见，肾性贫血的根本在于脾肾亏虚。黑地黄方以补肾健脾立方，喻嘉言叙述黑地黄方可以“治脾肾两脏之虚，而去脾湿，除肾燥，两擅其长”，其源于刘完素的《素问病机气宜保命集》，此方原方剂型为丸剂，主要组成药物为熟地黄、米泔水制苍术及干姜，具有补肾健脾，燥湿化浊之功。

3.2. 黑地黄方治疗RA的临床研究

黑地黄方应用于治疗RA效果显著。本课题组前期研究标明，黑地黄方可在一定程度上提高维持性血液透析伴RA患者营养评估的化验指标例如前白蛋白(PA)、血清白蛋白(Alb)等的水平，改善该部分患者的营养不良状态、临床症状和积分[18]。在常规治疗基础上联合应用黑地黄方治疗肾性贫血，较单独西医治疗有效率可提升17.5%，在铁代谢方面，患者体内血清铁(SI)、血清铁蛋白(SF)和转铁蛋白饱和度(TSAT)较用药前均得到显著提升，因此可以认为黑地黄方可以改善铁代谢[19]。在对EPO的作用方面，黑地黄丸可通过减少人均使用人促红细胞生成素用量，减轻促红素低反应性，提高肾性贫血患者RBC、Hb、HCT水平[20]，纠正肾性贫血。此外，黑地黄方还可通过调节骨髓基质细胞的功能状态，影响其旁分泌活性，从而改善肾性贫血[21]，该方可下调骨髓基质细胞的过度自噬，并促进其分泌SCF、IGF-1等关键的造血支持因子。由此可见，黑地黄方的有效成分可多通路、多靶点改善RA。

4. 黑地黄方的药理学研究

张益庆[22]采用网络药理学方法，预测黑地黄丸治疗肾性贫血的潜在靶点及通路，结果显示在黑地黄丸中共筛选出45个与肾性贫血相关的有效成分和725个潜在作用靶点；拓扑分析得到12个核心靶点；KEGG通路富集分析显示，HIF-1信号通路的富集程度最高(占比41.18%)，进一步从系统药理学角度支持黑地黄方调控PHD-HIF轴的可能性。现代药理学研究证实，黑地黄方的各组成药物的活性成分可通过干预氧化应激、炎症反应等PHD-HIF轴的关键调控环节，具备直接或间接调控该通路的物质基础。

熟地黄作为黑地黄方君药，其主要活性成分为梓醇、地黄多糖等[23] [24]。孙响波等[25] [26]采用HPLC法证实黑地黄方中梓醇含量稳定(每1 g生药含梓醇4.1672 mg)，且可通过血–肾屏障到达肾组织发挥作用。极高的ROS可以直接氧化和损伤HIF-α蛋白，即使它因为PHD被抑制而稳定下来，其功能也可能受损。梓醇具有显著的抗氧化应激作用，它可通过调节Sirt1和激活Nrf2/HO-1信号传导对抗急性肾损伤，改善炎症和氧化应激[27]，还可通过激活Nrf2/Keap1通路，增加抗氧化酶的活性[28]。地黄多糖是熟地黄另一核心活性成分，地黄多糖可抑制人肾小管上皮细胞HK-2Ｈ细胞氧化应激和凋亡[29]。因此梓醇和地黄多糖可能通过改善氧化应激间接抑制PHD活性，为HIF-1α稳定创造条件，为地黄多糖调控PHD-HIF轴提供了间接分子证据。

苍术作为臣药，其主要活性成分为苍术素、苍术醇等分[30]，其主要药理作用为抗炎、调节胃肠功能。生苍术和麸炒苍术在葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠溃疡性结肠炎模型中均表现出治疗效果。它们有助于维持肠道菌群稳态，介导丝裂原活化NF-κB和蛋白激酶(MAPK)信号转导抑制炎症反应，保护结肠上皮细胞，并减轻结肠损伤[31] [32]。苍术醇和苍术素-I可能是这些作用于溃疡性结肠炎的效果的主要成分。鞘氨醇激酶1 (SPHK1)和β-1,4-半乳糖基转移酶2 (B4GALT2)是苍术素-I靶向酶，这类酶可以调节肠道代谢和菌群组成，并改善结肠炎小鼠的炎症[33]。苍术醇介导MAPK信号转导，并激活过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR) α信号通路以抑制炎症反应，缓解肠道菌群失衡。同时，苍术活性成分还有改善肠道平滑肌，提高脂溶性药物的生物利用度的作用[34] [35]。

目前没有直接证据证明苍术可以直接影响PHD-HIF轴。CKD患者的毒素尤其是尿毒症影响肠道微生物群的组成和代谢，失调的肠道菌群可能诱导上皮屏障的破坏，导致暴露在内毒素环境下的肠道面积增加，使得肠道炎症激活，根据“肠–肾轴”的病理生理作用，这种炎症可能迁移至血液循环。苍术所具备的缓解肠道菌群失衡、抗炎作用，间接降低CKD患者体内的尿毒症毒素和炎症因子水平，改善造血微环境。

干姜作为佐药，其主要活性成分为姜辣素等[36]。姜辣素具有明确的缺氧适应调节作用，姜辣素通过在常氧条件下上调HIF-1α和抑制PHD2的催化活性[37]，使HIF-1α适度积累，同时，姜辣素还可以助力调节肾血管、改善肾组织血流灌注[38]。

大枣作为中药，其活性成分总黄酮、总酚的含量与抗氧化能力呈高度正相关[39]，大枣多糖也具有优秀的抗氧化能力。抗氧化实验表明，大枣蛋白水解物[40]具有高自由基清除能力：自由基(90.84%)、超氧自由基(44.77%)和羟基自由基(47.77%)，在体外实验中，大枣蛋白水解物可以显着减少活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)的积累，并增加HepG2细胞中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。因此，大枣与熟地活性成分一样，可能通过改善氧化应激间接抑制PHD活性，为HIF-1α稳定创造条件，大枣多糖还具有抑制肝脏代谢酶CYP450酶活性，延长药物半衰期的作用[41]。

由于黑地黄方成分多元，其改善肾性贫血的作用机制呈现多通路协同的特点。除作用于PHD-HIF轴外，该方亦可能通过其显著的抗炎与抗氧化活性发挥作用，方中苍术可调节肠道菌群并抑制NF-κB/MAPK通路，缓解慢性肾脏病相关微炎症；熟地黄及大枣中的多糖、黄酮等成分则能有效减轻氧化应激，保护造血细胞及肾组织。此外，该方可能通过调节骨髓基质细胞功能、促进SCF等造血因子分泌，直接支持造血过程，并通过改善胃肠道功能与铁代谢状态纠正铁利用障碍。

5. 讨论

熟地黄梓醇、地黄多糖、大枣多糖、大枣总黄酮等可通过降低ROS水平改善PHD活性、稳定HIF-1α；干姜姜辣素通过轻度抑制PHD活性、稳定HIF-1α作用于促红素的生成；苍术通过缓解肠道菌群失衡、抗炎作用，间接影响CKD患者造血微环境，从而为黑地黄方通过影响PHD-HIF轴改善肾性贫血提供了有力的药理学证据。虽然尚未有直接的临床或药理学研究证实黑地黄方通过PHD-HIF轴改善肾性贫血，但未来结合系统生物学与严谨的临床研究进一步揭示该机制具有很强的研究价值。

中药复方药物组分还具有协同增效的作用。熟地黄的核心成分梓醇、地黄多糖等水溶性较差，单独使用时肠道吸收效率低。配合苍术松弛肠道平滑肌、改善肠道通透性，有助于促进黏膜对熟地黄中脂溶性和水溶性成分的吸收；干姜中的姜辣素在改善肾组织灌注的同时，还可辅助熟地中的梓醇等成分通过血-肾屏障，提升药物利用度；大枣多糖具有一定的亲水性和黏性，可在延缓熟地、苍术等药物成分的释放速度，同时还可能通过抑制肝脏代谢酶的活性，减少有效成分的首过效应和代谢清除，进一步维持血药浓度稳定。这种代谢差异，构成了复方多成分在体内协同作用的药代动力学基础。

6. 结论

综上所述，黑地黄方四味组成药物的核心活性成分具备明确的药理学潜力，在药代动力学方面亦有协同增效作用。结合黑地黄方在临床应用于肾性贫血治疗取得良好疗效以及PHD-HIF轴在肾性贫血治疗中的重要角色，黑地黄方很可能通过PHD-HIF轴改善肾性贫血，未来极具临床、药理研究价值。

基金项目

陕西省教育厅专项科研计划项目，基于PHD-HIF-hepcidin信号轴的黑地黄散治疗血液透析肾性贫血病的疗效及其机理研究(23JK0414)。

NOTES

^*通讯作者。