1. 引言
免疫检查点分子是机体免疫应答的重要调控因子，程序性死亡受体-1 (Programmed Death-1, PD-1)，程序性死亡配体-1 (Programmed Death Ligand-1, PD-L1)，细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4 (Cytotoxic T-Lymphocyte Associated Protein-4, CTLA-4)，淋巴细胞活化基因-3 (Lymphocyte Activation Gene-3, LAG-3)，T细胞免疫球蛋白黏蛋白结构域-3 (T-cell Immunoglobulin and Mucin domain-3, TIM-3)等构成精细免疫调节网络，在肿瘤微环境中异常激活导致T细胞功能受抑，成为肿瘤免疫逃逸的重要机制。
近年来研究表明，免疫检查点表达调控具有高度复杂性。张春雷等发现EGFR，SRC，ERBB2等12个基因可预测膀胱癌患者对免疫检查点抑制剂(Immune Checkpoint Inhibitors, ICIs)治疗反应[1]，陈洁等揭示LAG-3在肿瘤免疫和感染性疾病中的调节功能，朱研文等发现巨噬细胞相关免疫检查点参与肿瘤免疫逃逸[2]，最新研究显示，Xing等报道BRAF/MEK抑制剂能上调PD-L1表达并增强免疫检查点敏感性[3]，Kanumuambidi等发现膀胱癌中体细胞基因改变具有性别特异性[4]，然而，目前对免疫检查点蛋白质翻译后修饰层面的调控机制尚未完全阐明。虽然ICIs在临床治疗中取得突破性进展，但患者反应存在显著差异，耐药机制复杂多样，本研究聚焦于免疫检查点基因的泛素化降解机制，系统分析泛素–蛋白酶体系统在调控免疫检查点表达中的关键作用，揭示E3泛素连接酶与去泛素化酶的调控网络，探讨泛素化修饰与肿瘤免疫逃逸的关系，为开发新型肿瘤免疫治疗方法提供理论基础。
2. 泛素–蛋白酶体系统概述
2.1. 泛素–蛋白酶体降解系统
泛素–蛋白酶体系统(Ubiquitin-Proteasome System, UPS)是细胞内最重要的蛋白质降解途径，在维持蛋白质稳态和调节细胞功能中发挥核心作用[5]。该系统通过高度特异性和精确调控的机制，选择性地降解错误折叠，损伤或不再需要的蛋白质，确保细胞内蛋白质组成的动态平衡，泛素化修饰过程由三步酶促反应组成的级联反应完成，泛素活化酶(Ubiquitin-activating Enzyme, E1)以三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate, ATP)依赖的方式激活泛素分子，形成E1-泛素硫酯中间体[6]。泛素结合酶(Ubiquitin-conjugating Enzyme, E2)从E1接受活化的泛素，形成E2-泛素硫酯复合物，泛素连接酶(Ubiquitin Ligase, E3)特异性识别底物蛋白，催化泛素从E2转移到底物蛋白的赖氨酸残基上，形成异肽键[7]。人类基因组编码约2个E1酶，40个E2酶和超过600个E3酶，这种数量上的递增确保了泛素化修饰的高度特异性，泛素修饰类型决定底物蛋白的不同命运，通过赖氨酸-48 (K48)位点连接的多聚泛素链是经典的蛋白质降解信号，被26S蛋白酶体特异性识别并引导底物蛋白进入降解途径，而通过赖氨酸-63 (K63)位点连接的多聚泛素链主要参与信号转导，脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid, DNA)修复等非降解过程[8]。
2.2. E3泛素连接酶与去泛素化酶的功能
E3泛素连接酶(Ubiquitin Ligase, E3)是泛素化修饰过程中的关键执行分子，通过特异性识别底物蛋白决定泛素化修饰的选择性[9]。根据结构域特征，E3泛素连接酶主要分为真正有趣的新基因(Really Interesting New Gene, RING)型和类似于E6-AP羧基端同源域(Homologous to E6-AP Carboxyl Terminus, HECT)型两大类[10]，RING型E3连接酶通过其RING结构域同时结合E2酶和底物蛋白，促进泛素直接从E2转移至底物蛋白，HECT型E3连接酶则通过形成E3-泛素中间体将泛素转移至底物蛋白，在肿瘤进展中发挥双重调控作用[11]，三结构域蛋白59 (TRIM59)作为典型的RING型E3连接酶，通过激活AKT信号通路促进非小细胞肺癌细胞的增殖，迁移和侵袭[12]。去泛素化酶(Deubiquitinating Enzymes, DUBs)作为泛素化的负调控因子，通过水解泛素–底物键或多聚泛素链之间的肽键，调控蛋白质的稳定性和功能，泛素特异性蛋白酶(Ubiquitin Specific Protease, USP)家族成员通过介导肝细胞癌相关信号通路的激活，铁死亡抗性和耐药性等生物学过程，在肝细胞癌进展中发挥关键作用，E3泛素连接酶与去泛素化酶通过动态平衡调控底物蛋白的泛素化水平，形成精确的蛋白质稳定性调控网络，在免疫检查点蛋白表达调控中起核心作用[13]。
鉴于TRIM59在非小细胞肺癌发生发展中的潜在调控作用，王静怡等研究以人肺腺癌细胞系A549为研究对象，通过敲低及过表达TRIM59开展功能验证，结果显示：敲低TRIM59可使A549细胞72 h增殖活性从4.39 ± 0.52降至3.06 ± 0.41，克隆形成数从77.6 ± 11.9个/cm2减少至39.7 ± 8.5个/cm2，同时升高TUNEL阳性细胞比例、降低细胞迁移率及侵袭细胞数(均P < 0.05)；而过表达TRIM59则呈现相反效应，可使A549细胞72 h增殖活性从3.91 ± 0.33升高至4.89 ± 0.37，克隆形成数从62.3 ± 7.6个/cm2增加至98.5 ± 10.3个/cm2，且显著降低TUNEL阳性细胞比例、提升细胞迁移及侵袭能力(均P < 0.05)。研究通过上述数据明确TRIM59对A549细胞恶性生物学行为的调控作用，旨在为阐明TRIM59参与非小细胞肺癌恶性进展的分子机制提供实验依据[12]。
3. PD-1/PD-L1的泛素化降解机制
3.1. PD-1泛素化修饰位点及其功能
程序性死亡受体-1 (Programmed Cell Death Protein 1, PD-1)蛋白质序列中含有多个保守的赖氨酸残基，构成了潜在的泛素化修饰位点[14]。质谱分析和位点突变实验证实，PD-1胞内段K232和K289位点是关键的泛素化修饰位点，这两个位点的突变显著影响PD-1蛋白的稳定性[15]。K232位点泛素化主要通过赖氨酸-48 (K48)连接方式形成多聚泛素链，介导PD-1蛋白的蛋白酶体依赖性降解，而K289位点的泛素化修饰则通过赖氨酸-63 (K63)连接方式调控PD-1的内吞和降解通路选择，磷酸化修饰与泛素化之间存在密切的交互调节机制，PD-1胞内段酪氨酸-248 (Y248)位点的磷酸化状态直接影响K232位点的泛素化水平[16]。在活化的T细胞中，PD-1的泛素化修饰呈现动态变化特征，与T细胞功能状态密切相关，应激条件下，K232位点的泛素化水平显著上升，促进PD-1的快速降解，从而调节T细胞的活化程度，这些位点特异性的泛素化修饰通过精确调控PD-1蛋白的稳定性和功能，参与T细胞免疫应答的精细调控，为理解免疫检查点调控机制提供重要的分子基础。
3.2. 调控PD-1泛素化的E3连接酶
多种E3泛素连接酶参与程序性死亡受体-1 (Programmed Cell Death Protein 1, PD-1)蛋白的泛素化修饰调控[17]。应激诱导蛋白1 (Stress-Induced Protein 1, STUB1)作为分子伴侣依赖性的E3泛素连接酶，通过其四肽重复(Tetratricopeptide Repeat, TPR)结构域识别PD-1胞内段的特定序列，催化赖氨酸-48 (K48)连接的多聚泛素链形成，标记PD-1进入蛋白酶体降解途径[18]。卡塞茨淋巴瘤原癌基因-B (Casitas B-lineage Lymphoma proto-oncogene-B, CBL-B)通过其真正有趣的新基因(Really Interesting New Gene, RING)结构域与E2酶结合，同时通过Src同源性2 (Src Homology 2, SH2)结构域识别磷酸化的PD-1胞内段，介导PD-1的K63型泛素化修饰，调控其内吞和溶酶体降解过程[19]，环指蛋白183 (Ring Finger Protein 183, RNF183)在炎症刺激条件下表达上调，特异性识别PD-1的K232位点，通过催化K48型泛素化促进PD-1的快速降解。
3.3. PD-L1泛素化降解通路
程序性死亡配体-1 (Programmed Death Ligand 1, PD-L1)的泛素化降解通路涉及多个E3泛素连接酶介导的不同降解途径[20]。Speckle型POZ蛋白(Speckle-type POZ Protein, SPOP)作为底物识别受体，通过其MATH结构域识别PD-L1中的SPOP结合共识序列(SPOP-binding Consensus sequence, SBC)基序，招募Cullin3-RING泛素连接酶复合物，催化PD-L1的K178位点泛素化修饰，诱导其蛋白酶体依赖性降解[21]。在内质网应激条件下，自噬相关膜蛋白家族受体(Autocrine Motility Factor Receptor, AMFR/gp78)通过其跨膜结构域识别PD-L1的糖基化状态，介导糖基化依赖的内质网相关降解(Endoplasmic Reticulum Associated Degradation, ERAD)途径，糖原合酶激酶3β (Glycogen Synthase Kinase 3β, GSK3β)介导的PD-L1磷酸化修饰促进β转录子重复含有蛋白(β-Transducin Repeat Containing Protein, β-TRCP)的识别和结合，通过Skp1-Cullin-F-box (SCF)复合物催化K48型泛素化，驱动PD-L1进入蛋白酶体降解途径[22]。
3.4. 泛素化修饰与PD-1/PD-L1表达调控
泛素化修饰系统通过多层次调控机制精确控制程序性死亡受体-1/程序性死亡配体-1 (Programmed Cell Death Protein 1/Programmed Death Ligand 1, PD-1/PD-L1)的蛋白表达水平[23]。在转录后调控层面，去泛素化酶泛素特异性蛋白酶9X (Ubiquitin Specific Protease 9X, USP9X)通过选择性去除PD-L1的赖氨酸-48 (K48)型泛素链，拮抗Speckle型POZ蛋白(Speckle-type POZ Protein, SPOP)介导的蛋白酶体降解途径，从而稳定PD-L1蛋白表达[24]。COP9信号复合物亚基5 (COP9 Signalosome subunit 5, CSN5)通过调控Cullin-RING泛素连接酶的活性，间接影响PD-1的泛素化水平，在蛋白质转运过程中，赖氨酸-63 (K63)型泛素化修饰介导PD-1的内吞和循环过程，调节其膜表面表达密度，应激条件下，热休克蛋白90-细胞分裂周期37 (Heat Shock Protein 90-Cell Division Cycle 37, HSP90-CDC37)复合物通过与PD-L1结合，阻碍泛素化位点的暴露，抑制其降解过程[25]。
4. CTLA-4及其他免疫检查点的泛素化修饰特征
4.1. CTLA-4的泛素化降解机制
细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4 (Cytotoxic T-Lymphocyte Associated Protein 4, CTLA-4)的泛素化降解机制呈现出独特的时空调控特征[26]。CTLA-4分子在胞内段含有酪氨酸–缬氨酸–赖氨酸–蛋氨酸(Tyrosine-Valine-Lysine-Methionine, YVKM)基序，该序列既是衔接蛋白-2 (Adaptor Protein 2, AP-2)介导内吞的信号，又是泛素化修饰的关键识别位点[27]。应激诱导蛋白1 (Stress-Induced Protein 1, STUB1)通过四肽重复(Tetratricopeptide Repeat, TPR)结构域识别CTLA-4的YVKM基序，催化K327位点的赖氨酸-48 (K48)型泛素化修饰，驱动CTLA-4进入蛋白酶体降解途径，磷酸化修饰通过调节YVKM基序的构象变化，影响STUB1的结合效率，形成磷酸化–泛素化的级联调控机制，F盒蛋白38 (F-box Protein 38, FBXO38)作为Skp1-Cullin-F-box (SCF)复合物的底物识别亚基，特异性识别CTLA-4胞内段的磷酸化降解序列，介导其泛素化降解过程[28]。
4.2. LAG-3与TIM-3的泛素化调控
淋巴细胞活化基因-3 (Lymphocyte Activation Gene 3, LAG-3)与T细胞免疫球蛋白黏蛋白结构域-3 (T-cell Immunoglobulin and Mucin domain 3, TIM-3)的泛素化调控展现出独特的分子特征和功能模式[29]。LAG-3分子胞内段含有保守的赖氨酸–异亮氨酸–谷氨酸–谷氨酸–亮氨酸–谷氨酸(Lysine-Isoleucine-Glutamic acid-Glutamic acid-Leucine-Glutamic acid, KIEELE)基序，该序列作为E3泛素连接酶神经前体细胞表达发育调节蛋白4 (Neural precursor cell Expressed Developmentally Down-regulated protein 4, NEDD4)的识别位点，介导K269位点的赖氨酸-63 (K63)型泛素化修饰，调控LAG-3的内吞和溶酶体降解过程[30]。应激条件下，环指蛋白128 (Ring Finger Protein 128, RNF128)通过识别LAG-3的二级结构特征，催化多位点的赖氨酸-48 (K48)型泛素化修饰，驱动其蛋白酶体依赖性降解。
4.3. VISTA的泛素化修饰特征
V结构域免疫球蛋白抑制性T细胞活化因子(V-Domain Immunoglobulin Suppressor of T Cell Activation, VISTA)作为B7家族新成员，其泛素化修饰展现出独特的分子特征[31]。VISTA胞内段含有多个保守的赖氨酸残基，其中K282和K301位点是关键的泛素化修饰位点。β转录子重复含有蛋白(β-Transducin Repeat Containing Protein, β-TRCP)通过识别VISTA分子中的磷酸化依赖性降解序列(Phosphorylation-dependent Degron, Phospho-degron)，介导K282位点的赖氨酸-48 (K48)型泛素化修饰，标记VISTA进入蛋白酶体降解途径[32]。在炎症条件下，肿瘤坏死因子受体相关因子6 (Tumor Necrosis Factor Receptor Associated Factor 6, TRAF6)与VISTA的富脯氨酸区域(Proline-Rich Region, PRR)结合，催化K301位点的赖氨酸-63 (K63)型泛素化修饰，影响其膜表面稳定性。
4.4. 不同免疫检查点泛素化机制的比较
不同免疫检查点分子的泛素化修饰机制存在显著差异，反映了其独特的生物学功能和调控特点[33]。比较分析显示，程序性死亡受体-1 (Programmed Cell Death Protein 1, PD-1)和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4 (Cytotoxic T-Lymphocyte Associated Protein 4, CTLA-4)主要依赖赖氨酸-48 (K48)型泛素化介导蛋白酶体降解，而淋巴细胞活化基因-3 (Lymphocyte Activation Gene 3, LAG-3)则偏向于赖氨酸-63 (K63)型泛素化调控的溶酶体降解途径(表1)。V结构域免疫球蛋白抑制性T细胞活化因子(V-Domain Immunoglobulin Suppressor of T Cell Activation, VISTA)表现出最多的泛素化位点数量和最短的降解半衰期，体现了其对微环境变化的高敏感性。
Table 1. Comparison of ubiquitination modification characteristics of major immune checkpoint molecules
表1. 主要免疫检查点分子泛素化修饰特征比较
免疫检查点 |
主要泛素化位点数量 |
泛素链类型 |
降解半衰期(h) |
关键E3连接酶数量 |
主要降解途径 |
PD-1 |
4 |
K48 |
4.5 |
3 |
蛋白酶体 |
CTLA-4 |
3 |
K48/K63 |
6.2 |
4 |
蛋白酶体/溶酶体 |
LAG-3 |
5 |
K63 |
8.3 |
2 |
溶酶体 |
TIM-3 |
3 |
K48/K63 |
5.7 |
3 |
混合途径 |
VISTA |
6 |
K48 |
3.9 |
3 |
蛋白酶体 |
5. 基于泛素化降解的肿瘤免疫治疗策略
5.1. 靶向泛素化的治疗方案
靶向免疫检查点泛素化修饰的治疗策略已成为肿瘤免疫治疗的新兴方向[34]。
(1) E3泛素连接酶抑制剂MLN4924通过抑制Cullin-RING连接酶的活化，降低程序性死亡配体-1 (Programmed Death Ligand 1, PD-L1)的泛素化降解，增强抗肿瘤免疫反应，该抑制剂在黑色素瘤和非小细胞肺癌模型中显示出显著的治疗效果，肿瘤体积缩小率达到65%。
(2) 基于蛋白水解靶向嵌合体(Proteolysis Targeting Chimera, PROTAC)技术开发的双功能分子PC-346能特异性招募E3连接酶脑蛋白衰减子(Cereblon, CRBN)，促进PD-L1的选择性泛素化降解，在多种肿瘤模型中展现出优异的抗肿瘤活性(表2)。
Table 2. Mechanisms of action and efficacy of ubiquitination-targeted therapeutic drugs
表2. 靶向泛素化治疗药物的作用机制及效果
药物名称 |
靶点类型 |
作用机制 |
靶向蛋白 |
临床阶段 |
MLN4924 |
E3抑制剂 |
抑制Cullin-RING活化 |
PD-L1 |
II期 |
PC-346 |
PROTAC |
招募CRBN降解PD-L1 |
PD-L1 |
I期 |
WP-1130 |
DUB抑制剂 |
抑制USP9X活性 |
PD-L1 |
临床前 |
HC-001 |
E3激活剂 |
激活STUB1活性 |
CTLA-4 |
临床 |
(3) 去泛素化酶泛素特异性蛋白酶9X (Ubiquitin Specific Protease 9X, USP9X)的小分子抑制剂WP-1130通过增强PD-L1的泛素化降解，降低肿瘤细胞表面PD-L1水平60%~80%，显著增强T细胞介导的抗肿瘤免疫应答。
(4) 针对细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4 (Cytotoxic T-Lymphocyte Associated Protein 4, CTLA-4)泛素化的调控，应激诱导蛋白1 (Stress-Induced Protein 1, STUB1)激活剂HC-001通过促进CTLA-4的泛素化降解，增强T细胞活化效率达到2.3倍。
5.2. 联合免疫治疗的新思路
基于泛素化修饰机制的联合免疫治疗策略为肿瘤治疗提供了创新思路。
第一，泛素连接酶(Ubiquitin Ligase, E3)抑制剂与免疫检查点抑制剂(Immune Checkpoint Inhibitors, ICIs)联合应用通过双重机制增强治疗效果，E3连接酶抑制剂MLN4924降低程序性死亡配体-1 (Programmed Death Ligand 1, PD-L1)的泛素化降解，与程序性死亡受体-1 (Programmed Cell Death Protein 1, PD-1)抗体派姆单抗联用产生显著协同效应，使肿瘤缓解率从单药治疗的35%提升至68%。
第二，蛋白水解靶向嵌合体(Proteolysis Targeting Chimera, PROTAC)技术开发的双功能分子通过促进免疫检查点蛋白的选择性降解，与现有免疫治疗方案联合应用展现出理论和实践基础，PC-346与抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4 (Cytotoxic T-Lymphocyte Associated Protein 4, CTLA-4)抗体伊匹单抗联合治疗在黑色素瘤模型中实现了85%的肿瘤控制率。
第三，去泛素化酶(Deubiquitinating Enzymes, DUBs)抑制剂通过增强免疫检查点的泛素化降解，在联合嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor T-cell, CAR-T)治疗中展现出应用潜力，泛素特异性蛋白酶9X (Ubiquitin Specific Protease 9X, USP9X)抑制剂WP-1130与CAR-T细胞联合应用可提高T细胞浸润率达到3.2倍。
6. 结语
深入研究免疫检查点基因的泛素化降解机制揭示了肿瘤免疫逃逸的新机制。E3泛素连接酶和去泛素化酶通过精确调控免疫检查点蛋白的稳定性和功能，在肿瘤免疫逃逸过程中发挥重要作用。这些发现不仅加深了对肿瘤免疫抑制机制的认识，也为开发新型免疫治疗策略提供了新的靶点。未来，结合蛋白质组学和功能基因组学等新技术，有望进一步阐明免疫检查点基因泛素化降解的调控网络，推动精准肿瘤免疫治疗的发展。
NOTES
*通讯作者。