1. 前言
糖尿病肾病(diabetic kidney disease, DKD)是糖尿病最常见的微血管并发症之一，也是终末期肾病的主要病因，其发病机制复杂，涉及炎症反应、代谢紊乱及纤维化等多重病理过程[1]。目前临床治疗以控制血糖和血压为主，但无法有效阻断疾病进展，因此探索多靶点、多通路的干预策略至关重要[2]。白术(Atractylodes macrocephala)作为传统中药，具有健脾益气、燥湿利水的功效，其活性成分(如白术内酯I、II、III等)已被证实具有抗炎、抗氧化和调节糖脂代谢的作用，但其治疗DKD的具体机制仍不明确[3] [4]。
网络药理学通过构建“成分–靶点–通路”网络，能够系统揭示中药多组分、多靶点的协同作用机制，为解决复杂疾病治疗提供了新思路。分子对接技术还可以进一步验证活性成分与关键靶点的结合能力，为网络预测提供实验依据。
本研究采用网络药理学方法，构建“成分–靶点–通路”多维网络，系统预测白术活性成分干预糖尿病肾病的关键靶点和信号通路。同时结合分子对接技术，计算核心成分与关键靶点的结合能，验证其相互作用可靠性。通过整合多组学分析和计算模拟技术，旨在从分子水平揭示白术治疗糖尿病肾病的多靶点作用机制，为中药现代化研究提供新思路，并为开发新型糖尿病肾病治疗药物奠定理论基础。
2. 材料与方法
2.1. 中药白术活性成分筛选
将“白术”作为检索词条，运用TCMSP数据库获得其已知化学成分，基于OB ≥ 30%和DL ≥ 0.18原则筛选其活性成分(OB ≥ 30%可确保候选成分具有足够肠道吸收率，DL ≥ 0.18可覆盖80%以上已批准药物类药性范围，同时保留天然产物特有结构多样性。) [5] [6]，并在PubChem数据库中查找上述活性成分的SMILE式。
2.2. 白术活性成分作用靶点和糖尿病肾病相关靶点的预测
将白术活性成分的SMILE式输入SWISS数据库中获取其作用靶点，并将TCMSP数据库和STITCH数据库所预测的靶点同时纳入研究。经去除重复项合并剩余数据后将所得靶点名称输入UniProt数据库，获得其相应靶点的人源的靶点基因名称及其ID。在TTD、GeneCards、OMIM数据库中，以“diabetic kidney disease”为关键词对糖尿病肾病相关靶点进行检索。
2.3. 白术活性成分–作用靶点网络的建立
将依据“1.2”项整合的白术“活性成分”及其“可能作用靶点”分列输入Excel表格中，把它们当作两类节点(node)，如若具有相关性则用边(edge)连接。采用Cytoscape3.10.2软件，构建中药白术“活性成分–作用靶点”的交互作用网络图。
2.4. 白术活性成分–靶点–糖尿病肾病网络分析与建立
使用Cytoscape3.10.2软件构建白术的“药物有效成分–靶点–通路”多层级网络模型，将已去重整合的白术活性成分作用靶点和糖尿病肾病关联靶点输入String数据库，进行蛋白互作分析。将从String数据库导出的蛋白互作分析结果(tsv.格式)导入Cytoscape软件直接获取相互作用网络。运用CytoNCA插件计算网络中各节点的度值(degree)，筛选出度值最高的关键靶点，作为后续分子对接实验的重点靶点。同时打开“1.3”中建立的白术活性成分–作用靶点网络，点击Cytoscape软件的关联(Merge)功能键输出模型，形成最终的“白术活性成分–靶点–通路–糖尿病肾病”网络图。
2.5. 生物过程与通路分析
在DAVID数据库中输入白术与DKD相关的关键靶点基因，对上述靶点进行GO分析(生物过程BP、分子功能MF和细胞组成CC)和KEGG通路富集分析，并下载分析结果。对P值从小到大进行排序(设定阈值P < 0.01)，汇集排在前十名的生物过程或通路，用微生信网络平台绘图后，进行解析说明。
2.6. 分子对接研究
采用分子对接技术验证白术中核心成分与核心靶点蛋白晶体结构的亲和力。筛选白术中排名前3的核心成分，将其与白术治疗DKD作用靶点中排名前3的核心靶点进行对接展示。首先从pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获取配体相应的二级分子结构，从PDB数据库(https://www.rcsb.org/)中获取受体的分子结构，利用Pymol软件去除多余的水分子和氨基酸残基，将受体和配体分子导入AutoDock Vina 1.1.2软件中进行分子对接，运行50次独立对接，以结合能 ≤ −5.0 kcal/mol作为相互作用的标准，最后再次利用Pymol软件进行可视化展示关键氢键和疏水相互作用，验证白术成分与AGE-RAGE通路的结合特征。
3. 结果
3.1. 白术活性成分的筛选与鉴定
基于TCMSP数据库检索共获得白术的78个化学成分。根据OB ≥ 30%和DL ≥ 0.18的标准进行筛选，最终获得7个关键活性成分(表1)。其中，14-乙酰基各里光酰基-8-反式白术三醇(14-acetyl-12-senecioyl-2E,8E,10E-atractylentriol)14-乙酰基-12-千里光酰基-8-顺式白术三醇(14-acetyl-12-senecioyl-2E,8Z,10E-atractylentriol)、12-千里光酰基-8-反式白术三醇(12-senecioyl-2E,8E,10E-atractylentriol)、α-香树脂醇(α-Amyrin)等倍多炔类成分占据主要地位，这些化合物已被报道具有抗炎和抗氧化活性。
Table 1. Active components of Atractylodes macrocephala Koidz
表1. 白术活性成分
MOL ID |
Molecule Name |
MW |
OB (%) |
DL |
MOL000020 |
12-senecioyl-2E,8E,10E-atractylentriol |
312.39 |
62.4 |
0.22 |
MOL000021 |
14-acety1-12-senecioyl-2E,8E,10E-atractylentriol |
355.44 |
60.31 |
0.31 |
MOL000022 |
14-acetyl-12-senecioyl-2E,8Z,10E-atractylentriol |
356.45 |
63.37 |
0.3 |
MOL000028 |
α-Amyrin |
426.8 |
39.51 |
0.76 |
MOL000033 |
(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimethyl-17-[(2R,5S)-5-propan-2-yloctan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol |
428.82 |
36.23 |
0.78 |
MOL000049 |
3β-acetoxyatractylone |
274.39 |
54.07 |
0.22 |
MOL000072 |
8β-ethoxy atractylenolide III |
276.41 |
35.95 |
0.21 |
3.2. 白术活性成分靶点与DKD疾病靶点的预测
通过整合SwissTargetPrediction和TCMSP数据库预测白术活性成分的潜在靶点，去重后得到367个靶点。同时，从GeneCards、TTD和OMIM检索DKD相关靶点，共计15082个疾病靶点。通过韦恩图分析，发现349个白术-DKD共同靶点(图1)，其中8个与AGE-RAGE通路(AGER、NFKB1、MAPK1、AKT1、IL6、TNF、VEGFA、HSP90AA1)显著关联。
Figure 1. Venn diagram of common targets among Atractylodes macrocephala active components, action targets, and DKD
图1. 白术活性成分–作用靶点-DKD共同靶点韦恩图
3.3. 白术–靶点–糖尿病肾病(DKD)关键网络分析
通过寻找白术与糖尿病肾病疾病交集靶点绘制PPI网络图(图2)，使用Cytoscape 3.7.0软件进行可视化，图中包括349个节点和4712条边。使用其插件分析相关靶点拓扑参数，通过2轮筛选，得到1个包含10个节点和45条边的核心靶点PPI网络图，获得的核心靶点基因分别是AKT1、TNF、SRC、EGFR、CASP3、ESR1、HSP90AA1、MAPK3、PPARG和PTGS2，并记录核心靶点基因的拓扑参数(表2)。
Figure 2. PPI network of key targets in Baizhu-DKD interaction
图2. 白术-DKD关键靶点PPI网络
Table 2. Topological parameters of core target genes
表2. 核心靶点基因的拓扑参数
Rank |
Name |
Degree |
Subgragh |
Eigenvector |
Information |
LAC |
Betweenness |
1 |
AKT1 |
157 |
1.52E+22 |
0.18210812 |
13.179726 |
32.828026 |
9042.12 |
2 |
TNF |
154 |
1.31E+22 |
0.16906089 |
13.158602 |
29.454546 |
10034.13 |
3 |
SRC |
142 |
1.22E+22 |
0.16343974 |
13.066058 |
30.267605 |
10153.697 |
4 |
EGFR |
127 |
1.33E+22 |
0.17038317 |
12.928428 |
35.464565 |
3877.132 |
5 |
CASP3 |
123 |
1.27E+22 |
0.16631454 |
12.88669 |
35.13821 |
3070.552 |
6 |
ESR1 |
116 |
1.08E+22 |
0.15348579 |
12.807518 |
32.344826 |
5095.066 |
7 |
HSP90AA1 |
113 |
1.08E+22 |
0.15388414 |
12.770934 |
32.884956 |
3625.1665 |
8 |
MAPK3 |
108 |
8.94E+21 |
0.13976586 |
12.706014 |
28.537037 |
3970.6396 |
9 |
PTGS2 |
99 |
6.51E+21 |
0.11928521 |
12.574845 |
25.272728 |
4540.346 |
10 |
PPARG |
99 |
6.91E+21 |
0.12284748 |
12.574845 |
26.181818 |
3644.952 |
3.4. 白术活性成分–靶点网络构建
利用Cytoscape 3.9.1构建白术“活性成分–作用靶点–通路”网络(图3)，其中包含32个节点(7个活性成分 + 10个靶点)和83条边。拓扑分析显示，14-乙酰基各里光酰基-8-反式白术三醇与AGE-RAGE通路、TNF、AKT1、EGFR等多个核心靶点及通路高度连接，表明其可能通过多靶点协同调控抑制DKD进展。
3.5. GO与KEGG通路富集分析
将上述交集靶点进行GO功能富集分析，共获得42条生物过程(biological processes, BP)、40条细胞组分(cellular components, CC)、38条分子功能(molecular functions, MF)。分别选取各类排名前10位的条目进行可视化分析(图4)。GO分析结果显示，白术可通过调控蛋白质磷酸化、炎症反应等生物过程，在调节蛋白激酶活性中发挥作用，进而维持细胞功能的稳定性和完整性，这对糖尿病肾病的治疗具有重要意义。
Figure 3. Active component-target interaction network of Atractylodes macrocephala
图3. 白术活性成分–作用靶点网络
Figure 4. GO pathway enrichment bubble plot of Baizhu-DKD targets
图4. 白术-DKD靶点GO通路分析气泡图
经KEGG筛选出28条与DKD相关的通路(P < 0.01)，其中富集到关键通路包括AGE-RAGE信号通路(hsa04933, P = 2.73 × 10−13)、EGFR通路(hsa01521, P = 3.79 × 10−19)与内分泌抵抗通路(hsa01522, P = 1.74 × 10−16) (图5)，进一步验证了白术通过多途径干预DKD的潜在机制。
Figure 5. KEGG pathway enrichment analysis of Baizhu-DKD targets
图5. 白术-DKD靶点KEGG通路富集分析
3.6. 分子对接验证
为评估白术核心成分与白术治疗DKD核心靶点之间的结合能力及相互作用方式，本研究采用AutoDockVinav1.2.2软件进行分子对接分析。选择OB值排名前三位的核心活性成分为14-乙酰基各里光酰基-8-反式白术三醇(14-acetyl-12-senecioyl-2E,8E,10E-atractylentriol)、14-乙酰基-12-千里光酰基-8-顺式白术三醇(14-acetyl-12-senecioyl-2E,8Z,10E-atractylentriol)和12-千里光酰基-8-反式白术三醇(12-senecioyl-2E,8E,10E-atractylentriol)；前三位核心靶点AKT1、TNF和RAGE作为研究对象(图6)，选择的3个核心靶点(AKT1、TNF、RAGE)是通过蛋白互作网络(PPI)分析和KEGG通路富集共同确定的，AKT1与TNF在PPI网络中具有最高的degree值；而RAGE虽非PPI网络中连接最密集的节点，但作为AGE-RAGE信号通路的特异性受体，其与DKD病理机制的关联性最强。这种筛选策略既考虑了网络拓扑计算权重，又兼顾了靶点的生物学功能重要性。AutoDock Vina结果显示，白术核心成分与白术治疗DKD核心靶点结合能均小于−5 kcal/mol，其中14-乙酰基-12-千里光酰基-8-顺式白术三醇(14-acetyl-12-senecioyl-2E,8Z,10E-atractylentriol)与RAGE结合作用最强，其结合能为−7.1 kcal/mol (图7)，形成稳定的氢键(ALA-76、ALA-84、GLY-1)，说明对接结果良好且受体蛋白均能与配体分子进行自发地结合。
4. 讨论
糖尿病肾病发病机制复杂，涉及遗传因素、代谢紊乱(糖脂代谢异常)、氧化应激及炎症反应等多因素相互作用，导致肾脏微循环障碍和组织结构损伤[7]。当前西医治疗仍以控制血糖、血压、血脂等对症疗法为主，但存在药物选择有限及不良反应等问题[8]。白术作为健脾益气要药，其复方制剂在糖尿病肾病治疗中展现出多成分、多靶点的优势，但其具体作用机制亟待阐明[9]。网络药理学与中医整体观相契合，
Figure 6. 3D molecular docking structures of 14-acetylatractylodin-8-trans-atractylenolide III, 14-acetyl-12-senecioyl-8-cis-atractylenolide III, and 12-senecioyl-8-trans-atractylenolide III
图6. 14-乙酰基各里光酰基-8-反式白术三醇、14-乙酰基-12-千里光酰基-8-顺式白术三醇、12-千里光酰基-8-反式白术三醇的分子对接三维结构
为系统解析白术治疗糖尿病肾病的复杂机制提供了新思路。
本研究通过TCMSP数据库筛选获得白术7种活性成分(主要为倍半萜类、多炔类及芳香族化合物)，构建的“成分–靶点”网络显示白术具有多成分协同作用的特点。网络分析表明苍术酮、白术内酯I、II、III等成分连接靶点较多，提示它们可能是白术干预糖尿病肾病的核心活性物质。分子对接验证发现AKT1、TNF、RAGE等靶点具有良好的结合活性，其中TNF等炎症因子已被证实可通过促进肾小球硬化及肾小管上皮细胞凋亡加剧糖尿病肾病进展。实验研究表明，白术三醇能显著抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞NF-κB信号通路活化，降低TNF、IL-6等促炎因子释放[10]；同时可通过激活AKT1介导的PI3K/Akt信号改善胰岛素敏感性，并通过阻断AGE-RAGE通路抑制肾脏纤维化进展，与本研究的分子对接结果及网络药理学预测高度吻合[11] [12]。
GO功能分析显示，白术干预糖尿病肾病涉及蛋白质磷酸化、炎症反应等生物过程，与质膜、受体复合体等细胞器功能密切关联。KEGG通路分析揭示了多条关键信号通路：① AGE-RAGE信号通路作为糖尿病微环境的核心响应机制，其过度激活可加速晚期糖基化终末产物(AGEs)累积，直接导致肾脏足细胞损伤和肾小球基底膜增厚[13] [14]；② EGFR信号通路通过调控下游ERK1/2和STAT3磷酸化，参与肾小管上皮细胞转分化过程，抑制该通路可显著减轻糖尿病肾病的纤维化进展[15]；③ 内分泌抵抗通路与胰岛素信号转导障碍密切相关，其异常活化会加剧肾脏局部胰岛素抵抗，促进足细胞能量代谢紊乱和凋亡[16] [17]。分子对接结果显示，白术三醇类成分与RAGE、AKT1等靶点具有较强结合力，提示其可能通过调控上述通路发挥肾脏保护作用。
本研究共预测白术7个活性成分可能作用于349个潜在靶点，体现了中药“多成分–多靶点–多通路”的作用特点。值得注意的是，部分白术多糖类成分因ADME参数限制未能纳入分析。尽管通过String
Figure 7. Molecular docking binding energy results of 14-acetylatractylodin-8-trans-atractylenolide III, 14-acetyl-12-senecioyl-8-cis-atractylenolide III, and 12-senecioyl-8-trans-atractylenolide III
图7. 14-乙酰基各里光酰基-8-反式白术三醇、14-乙酰基-12-千里光酰基-8-顺式白术三醇、12-千里光酰基-8-反式白术三醇的分子对接结合能结果
数据库鉴定了10个核心靶点并进行通路验证，但后续仍需开展动物实验和细胞实验加以证实。此外，白术与其他健脾中药(如茯苓、黄芪)的协同作用机制值得进一步研究，以更好地指导临床应用。
基金项目
本研究由盐城市卫生健康委科研项目(YK2024116)和江苏大学医教协同创新基金项目(JDYY2023107)共同资助。
NOTES
*通讯作者。