1. 引言
皮肤黑色素瘤(SKCM)是一种起源于黑色素细胞的侵袭性恶性肿瘤，虽然SKCM仅占所有皮肤癌的一小部分，但却是全球皮肤癌相关死亡的主要原因[1]。过去几十年，其发病率持续上升。早期黑色素瘤可通过手术切除有效治疗，如果在区域或远处转移前发现，5年生存率可超过90% [2]。然而，晚期和转移性黑色素瘤仍然具有高度致命性，在免疫检查点阻断(ICB)和靶向治疗出现之前，患者的中位生存期不足一年。BRAF/MEK抑制剂和免疫检查点抑制剂(例如抗PD-1和抗CTLA-4抗体)的引入显著改善了患者的预后，但仍有相当一部分患者治疗无效或最终复发[3]，因此有必要寻找可靠的生物标志物和深入了解黑色素瘤免疫调控机制。
SKCM的肿瘤微环境(TME)是一个复杂且动态的生态系统，由恶性细胞、基质成分和多种浸润的免疫细胞组成[4]。这些成分之间的相互作用深刻影响着肿瘤的生长、转移和治疗反应[5]。特别是，细胞毒性CD8⁺ T细胞、自然杀伤(NK)细胞、抗原呈递树突状细胞(DC)和免疫抑制性巨噬细胞的密度和功能取向决定了免疫激活和免疫耐受之间的平衡[6]。黑色素瘤的显著特征是其免疫浸润的异质性，既包括具有丰富干扰素(IFN)信号和T细胞浸润的“炎症”表型，也包括以免疫排斥为特征的“非炎症”或“冷”肿瘤[7]。了解塑造这种免疫微环境的分子决定因素对于预测免疫检查点阻断(ICB)的疗效以及设计能够将免疫冷肿瘤转化为免疫热肿瘤的合理联合治疗策略至关重要[8] [9]。
CXCL10，又称干扰素-γ诱导蛋白-10 (IP-10)，是一种趋化因子。它与活化的T细胞和NK细胞上的CXCR3受体结合，引导这些细胞向炎症组织和肿瘤部位迁移[10]。在癌症中，CXCL10通过促进效应细胞募集和增强免疫监视，参与构建抗肿瘤免疫微环境[11]；同时，其表达也与多种恶性肿瘤对免疫疗法的反应性提高相关[12]。然而，CXCL10在皮肤黑色素瘤中的预后价值、免疫相关性和细胞来源仍未完全阐明。本研究系统分析了CXCL10在人类癌症中的表达，并重点探讨了其在黑色素瘤中的生物学和临床意义。通过将来自TCGA的批量RNA-seq数据与多个队列的单细胞转录组数据集整合，我们旨在阐明CXCL10在SKCM中的预后影响、免疫背景关联、通路特征和细胞来源，从而为黑色素瘤的干扰素驱动的免疫景观提供新的见解。
2. 方法
2.1. 数据来源与总体设计
本研究综合利用公开可得的转录组与单细胞测序数据，系统探讨CXCL10在皮肤黑色素瘤(SKCM)中的表达特征、临床意义及免疫微环境关联。RNA-seq表达数据与对应的临床信息来源于TCGA (The Cancer Genome Atlas)数据库项目。所有表达矩阵均经统一基因注释与标准化处理，仅保留蛋白编码基因以确保跨队列可比性。单细胞转录组数据则选取了两个独立的免疫治疗相关黑色素瘤队列，分别为GSE115978，GSE123139，和GSE120575。整体分析流程依次包括：CXCL10的泛癌表达与预后分析、在SKCM中的临床与分期分层比较、免疫相关性与炎症程序富集分析，以及单细胞水平的表达定位与细胞来源验证。
2.2. 免疫相关性与微环境评分分析
所有TCGA与GTEx原始测序数据在统一注释后采用TPM (Transcripts Per Million)格式，并以log2 (TPM + 1)进行标准化处理。肿瘤与正常组织间的表达差异通过可视化箱线图展示，以评估跨癌种及SKCM内部的分布特征。为探究CXCL10与总体生存(OS)的关系，在每个癌种中均采用单变量Cox比例风险模型评估表达水平对生存结局的影响，并在SKCM内根据CXCL10表达中位数将患者划分为高表达组与低表达组，绘制Kaplan-Meier生存曲线及风险表以直观显示生存差异。随后将CXCL10表达与病理分期进行比较，以评估其随疾病进展的变化趋势。所有统计分析与可视化均在R软件中完成，主要使用survival、survminer与ggplot2 R包。
2.3. 免疫相关性与微环境评分分析
为了评估CXCL10与免疫活化特征之间的关联，我们在TCGA全癌及SKCM样本中计算其与多种免疫功能基因的Spearman相关系数。分析的基因模块包括：趋化因子轴(CXCL9/10/11及主要CCL家族成员)、细胞毒与活化标志(CD8A, GZMB, PRF1, IFNG)、抗原呈递分子(HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA等)以及共刺激与免疫检查点分子(CD27、CD40、PDCD1、CTLA4等)。相关结果以热图形式呈现，以直观反映CXCL10在免疫通路中的网络位置。进一步地，利用ESTIMATE算法计算每个样本的免疫得分(ImmuneScore)、基质得分(StromalScore)和综合得分(ESTIMATEScore)，并分析CXCL10与这些指标之间的相关性，从而评价其与免疫浸润水平和组织成分的关系。热图与散点相关分析的可视化在R中通过ESTIMATE、pheatmap和ggplot2实现。
2.4. 差异表达与通路富集分析
为了明确CXCL10高表达与低表达肿瘤之间的分子差异，我们在TCGA-SKCM队列中以CXCL10表达中位数为分界进行样本分层。两组间的差异表达分析使用limma包进行线性建模和贝叶斯统计调整，选取显著上调和下调基因绘制热图以展示代表性变化。随后基于全基因排名列表进行基因集富集分析(GSEA)，基因集来源于KEGG和Reactome数据库，用以识别与CXCL10高表达相关的信号通路。富集结果显示干扰素信号、细胞因子–受体互作、抗原加工与呈递、造血细胞分化等免疫相关通路显著富集。为进一步归纳这些功能模块，我们使用clusterProfiler对显著基因进行GO生物过程富集，并利用igraph与ggraph构建功能网络，聚焦于T细胞趋化调控、内皮细胞活化及炎症反应等主题，从而揭示CXCL10所关联的核心免疫炎症程式。
2.5. 单细胞转录组分析与细胞来源验证
单细胞层面的分析基于TISCH (Tumor Immune Single-cell Hub, https://tisch.comp-genomics.org)数据库中整理的黑色素瘤免疫治疗相关数据集，包括GSE115978、GSE120575和GSE123139。根据注释UMAP和CXCL10表达量的UMAP确定CXCL10在多种细胞内的表达情况。
3. 结果
3.1. CXCL10在皮肤黑色素瘤中的预后和临床意义
我们基于TCGA数据库中肿瘤患者的RNA-seq数据，研究了CXCL10在人类癌症中的表达情况，并使用单变量Cox模型评估了其预后意义。结果显示，CXCL10与预后之间的关联因肿瘤类型而异，但在SKCM中，较高的CXCL10表达水平与更长的总生存期一致，Kaplan-Meier生存曲线(以表达中位数为界)也证实了这一点(图1(A)~(B))。进一步探究CXCL10在SKCM中的表达水平，我们比较了多种肿瘤组织和匹配或参考正常组织中的CXCL10表达水平，结果显示肿瘤间差异显著，且SKCM中CXCL10的表达模式呈广泛且高度分散的分布(图1(C))，这与免疫浸润较强的特征相符。在SKCM中，CXCL10表达水平随着病理分期的进展而降低，早期病变中CXCL10表达水平最高(图1(D))。综合来看，这些结果表明CXCL10是黑色素瘤中免疫活性表型的标志，其表达水平越高，生存期越长，而随着疾病进展，其表达水平会降低。
3.2. SKCM中CXCL10与肿瘤免疫微环境以及免疫激活相关分子的关系
由于CXCL10是一种IFN诱导的CXCR3⁺ T细胞和NK细胞趋化因子，我们接下来研究了其转录水平是否反映了黑色素瘤中炎症性肿瘤微环境的变化。在各种癌症中，尤其是在皮肤黑色素瘤中，CXCL10与包含CXCL9/CXCL11和多个CCL家族成员的广泛趋化因子模块密切相关(图2(A))。它还与T/NK细胞活化和细胞毒性标志物(CD8A, GZMB, PRF1, IFNG)、抗原呈递标志物(HLA基因)、共刺激标志物(CD27/CD40)以及免疫检查点标志物(PDCD1、CTLA4等)相关，表明其与适应性免疫激活相一致(图2(B))。CXCL10表达始终与组织水平反卷积评分中较高的免疫含量一致，并且与基质含量的关系较弱，这表明CXCL10具有作为SKCM中免疫浸润水平的指标(图2(C))。
3.3. CXCL10高表达的SKCM中富集干扰素及炎症相关基因
基于CXCL10的免疫与免疫炎症之间的高相关性，我们根据CXCL10的丰度对TCGA-SKCM所有患者进行分层。根据CXCL10表达量的中位数将患者分为高表达患者和低表达患者。并用limma R包计算了两组间的差异表达基因。结果显示CXCL10高表达的肿瘤表现出干扰素刺激的趋化因子(例如CXCL11)、细胞毒性T/NK细胞标志物(CD8A, NKG7, GZMB, PRF1)、抗原呈递基因(HLA I/II类)以及多种共刺激/检查点分子的协同增加，而CXCL10低表达的肿瘤则富集了黑色素细胞谱系和色素沉着相关的转录本(例如MITF、PMEL、TYRP1) (图3(A))。基因集富集分析进一步突显了与抗原加工和呈递、细胞因子–受体相互作用、造血细胞谱系以及免疫相关疾病模块相关的通路(图3(B))。互补的本体网络将CXCL10与T细胞趋化性和内皮细胞活化/形态发生等过程联系起来，从而支持有利于淋巴细胞募集的微环境(图3(C))。因此可见，CXCL10在SKCM中的表达与更高的T细胞浸润、抗原呈递和T细胞激活相关，这也解释了CXCL10表达较高的患者预后较好的原因。
(A) TCGA泛癌队列中CXCL10表达与总体生存的风险比森林图。(B) 在SKCM队列中按CXCL10表达中位数分组的Kaplan-Meier生存曲线。(C) CXCL10在多癌种中肿瘤与正常组织间的表达差异比较。(D) CXCL10在不同黑色素瘤病理分期(I~IV)中的表达分布。
Figure 1. Prognostic and clinical relevance of CXCL10 in skin cutaneous melanoma (SKCM)
图1. CXCL10在皮肤黑色素瘤中的预后与临床相关性
(A) CXCL10与多种趋化因子基因的相关性热图。(B) CXCL10与T/NK细胞活化标志物、细胞毒分子、抗原呈递及免疫检查点相关基因的相关性热图。(C) CXCL10与ESTIMATE算法计算的免疫、基质及总体得分的相关性图。
Figure 2. Immune contexture and molecular correlations of CXCL10 in melanoma
图2. CXCL10与黑色素瘤免疫微环境及免疫激活相关分子的关系
3.4. 黑色素瘤中CXCL10的单细胞定位
为了直接界定CXCL10的产生细胞，我们在3个独立的黑色素瘤免疫治疗队列上进行单细胞层面的特征图谱绘制。结果表明3个队列在各自多例样本/多簇结构上均呈现高度一致的空间分布：CXCL10主要集中于单核/巨噬细胞，树突状细胞簇也有部分表达，在内皮细胞与成纤维细胞中仅见零星信号，恶性肿瘤细胞几乎不表达，T/NK细胞则基本缺乏产生信号(图4(A)~(F))。这种在不同研究、不同样本层面重复出现的模式，明确了CXCL10在黑色素瘤微环境中的主导来源为髓系细胞(以巨噬/单核细胞为核心，伴随DC)，并强化了其作为“免疫炎症–髓系轴”的生物学功能。
(A) CXCL10高低表达肿瘤之间差异表达基因的热图。(B) GSEA富集分析显示CXCL10高表达组富集的免疫及干扰素相关通路。(C) CXCL10相关的GO生物过程网络图，突出T细胞趋化与内皮细胞活化等功能。
Figure 3. Interferon and inflammation-associated transcriptional programs in CXCL10-high melanoma
图3. CXCL10高表达黑色素瘤中的干扰素及炎症相关转录程序
4. 讨论
本研究通过整合bulk与单细胞转录组数据，对干扰素诱导性趋化因子CXCL10在皮肤黑色素瘤(SKCM)中的生物学及临床意义进行了系统性解析。结果表明，CXCL10不仅是黑色素瘤中一个良好的预后标志物，还是一个反映炎症性、免疫活性表型的转录指标。在多个数据集中，较高的CXCL10表达始终与患者总生存期延长、干扰素相关及细胞毒性基因程序富集以及免疫细胞浸润增强相关，而其表达水平则随肿瘤进展逐渐下降。这些发现提示，CXCL10反映了持续存在的抗肿瘤免疫激活状态，该状态在黑色素瘤演进过程中逐渐减弱。
(A, C, E) 三个黑色素瘤单细胞数据集(GSE115978, GSE120575, GSE123139)的UMAP谱系图，展示主要免疫与基质细胞群。(B, D, F) 对应的CXCL10特征表达图，显示其在不同细胞群中的表达强度。CXCL10主要富集于单核/巨噬细胞和树突状细胞簇，在内皮及成纤维细胞中零星表达，而在恶性细胞与T/NK细胞中几乎不表达。
Figure 4. Single-cell localization and cellular sources of CXCL10 in melanoma
图4. 黑色素瘤中CXCL10的单细胞定位与细胞来源
在机制层面，CXCL10通过招募并维持CXCR3⁺效应T细胞与NK细胞在肿瘤微环境中的存在，参与塑造黑色素瘤的免疫格局。CXCL10与T细胞活化、抗原呈递及免疫检查点相关基因之间的正相关性表明，CXCL10标志着一个协调的干扰素驱动的免疫模块，而非单一的趋化因子轴[13]。这一特征正是所谓“热”黑色素瘤的典型表现，该类肿瘤对免疫检查点阻断疗法具有更好的应答率[14]。值得注意的是，CXCL9、CXCL10和CXCL11这三个经典的IFN-γ诱导配体的共表达进一步支持了“CXCL9/10/11-CXCR3轴是炎症性黑色素瘤亚型标志”的观点，该类亚型具有更强的免疫原性与T细胞杀伤潜能。
在细胞层面，我们对三个独立的队列(来源于TISCH数据库的GSE115978、GSE120575和GSE123139)进行的单细胞分析提供了有力证据，表明CXCL10主要由肿瘤相关髓系细胞(包括巨噬细胞和树突状细胞)产生，而非T细胞或恶性细胞。这一以髓系细胞为核心的来源强调了先天免疫感知与干扰素信号在建立趋化因子梯度、进而招募效应淋巴细胞过程中的关键作用[15]。CXCL10转录本在不同数据集及治疗背景下均稳定定位于髓系细胞群，凸显了其作为跨队列免疫生物标志物的稳健性。既往研究已提示髓系来源的CXCL10产生与抗原呈递能力增强及PD-1阻断治疗反应改善相关[16]，因此我们的发现进一步表明CXCL10在黑色素瘤中连接了先天免疫激活与适应性效应细胞招募。
然而，本研究也存在一定局限性。尽管CXCL10表达与免疫激活相关，相关分析本身无法直接推断因果关系。未来研究需结合多重成像、细胞因子定量及功能性扰动模型，以确定增强CXCL10信号是否能够改善免疫细胞浸润并提高治疗效果。综上所述，本研究确立了CXCL10作为黑色素瘤中干扰素驱动免疫激活的可靠指标，并揭示其髓系起源是塑造免疫炎症型肿瘤微环境的关键决定因素，为利用CXCL10-CXCR3轴优化SKCM免疫治疗策略提供了理论依据。
NOTES
*通讯作者。