1. 引言
精神病是一组由生物、心理及社会环境等多重因素共同作用所引发的临床综合征[1] [2]，其核心特征为大脑的结构性与功能性紊乱，具体表现为个体的认知、情绪、意志及行为等基本心理过程出现显著异常。由《柳叶刀》精神病学子刊近期刊载的中国精神卫生调查数据显示，我国精神病患病率已高达9.32%左右，且全球患者数量也呈上升趋势[3] [4]。精神病作为中枢神经系统疾病的主要类型之一，病程长，复发率高，需要长期服药[5]，现有上市的抗精神病长效注射剂，其最长给药周期已达六个月[6]，该方案目前已广泛应用于临床并得到了医生与患者的共同肯定。依匹哌唑最早由Otsuka和Lundeck公司联合开发，对多巴胺受体、部分5-HT1A受体发挥激动作用，并拮抗5-HT2A受体，是一种新型多靶点抗精神病药物[7] [8]，目前仅有普通口服片剂在国内外上市。原位凝胶是一类新型的长效植入式给药系统。其特性在于，制剂在初始时以液态形式被施用，随后能在给药部位迅速发生相转化，形成一种半固体的凝胶结构[9]-[11]。本研究拟使用可生物降解聚合物聚乳酸–羟基乙酸共聚物(PLGA)为主要载体材料，以依匹哌唑为模型药物，制成长效可注射原位凝胶，作为抗精神病药物的新型长效制剂，以替代普通口服片剂，同时也为抗精神病药物缓控释制剂的研究提供新的方向。
2. 仪器与试剂
Shimadzu LC-2010AT高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司)，MS603S型电子分析天平(瑞士梅特勒公司)，ZD-85型气浴恒温振荡器(金坛区指前镇旭日实验仪器厂)，ZNCL-S-10D型智能数显多点磁力搅拌器(重庆东悦仪器有限公司)，FE28-Standard型pH计(瑞士梅特勒公司)。
依匹哌唑原料药(Brexpiprazole，Bre，纯度质量分数99.7%，山东安弘制药有限公司，批号：3001L41U)；依匹哌唑对照品(Brexpiprazole，Bre，纯度质量分数99.7%，中国食品药品检定研究院，批号：430038-202301)；PLGA [型号5002A，固有黏度(Inv) = 0.2 dL/g，美国Ashland公司)；PLGA [型号7502A，固有黏度(Inv) = 0.12 dL/g，美国Ashland公司)；N-甲基吡咯烷酮(NMP，批号：K2126096，上海阿拉丁试剂有限公司)；硬脂酸(SA)；单硬脂酸甘油酯(GMS)；十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，上海阿达玛斯试剂有限公司)；甲醇(色谱纯，上海阿达玛斯试剂有限公司)；无水磷酸氢二钠(分析纯，重庆川东化工集团有限公司)；磷酸(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；磷酸二氢钾(分析纯，成都市科隆化学品有限公司)；氢氧化钠；水为纯化水。
3. 方法与结果
3.1. 原位凝胶的制备
精密称取处方量的PLGA及依匹哌唑原料药Bre，加入有机溶剂NMP中，在磁力搅拌器上室温搅拌至全部溶解，再加入适量的GMS，搅拌至形成澄清透明均一的原位凝胶溶液，避光保存备用。
3.2. 原位凝胶处方初步考察
3.2.1. 评价方法
凝胶溶液澄清度：凝胶前体溶液制备过程中，观察所形成原位凝胶溶液是否澄清无析出。固化效果：取约0.2 ml原位凝胶，将其缓慢注入适量释放介质(pH7.4 PBS + 0.1% CTAB, 37˚C)中，并于恒温振荡器中培养(100 rpm)，对聚合物的表观特征(如固化状态、骨架完整性及水相澄清度)进行观察。流动性：取约0.3 ml样品置于5 ml具塞离心管中，在30℃斜坡上记录其流至管口刻度的时间。
3.2.2. 凝胶基质载体材料考察
固定药物用量(3%, w/v)及聚合物PLGA浓度(25%, w/v)，系统评估不同型号PLGA对所制备原位凝胶的澄清度、流动性及固化行为的影响。结果表明，在此聚合物浓度下，两种PLGA型号(5002A与7502A)均表现出良好的流动性。相比之下，特性粘度较高(Inv = 0.2)的PLGA 5002A呈现出更优的固化效果。
3.2.3. PLGA用量考察
固定药物量为(3%, w/v)，并依据含药凝胶的制备方法，系统制备了PLGA (5002A, Inv = 0.2)浓度分别为20%、25%、30%、35%及40% (w/v)的原位凝胶，以评估聚合物含量对凝胶澄清度、固化效果及流动性的影响。结果表明，所有配方的凝胶均呈现澄清透明状。随着PLGA浓度的提高，凝胶的流动性呈现下降趋势，而固化程度则随之增强。然而，当浓度达到40% (w/v)时，凝胶流动性过差且推针阻力显著增大，故该聚合物的适宜用量范围仍需进一步探究。
3.2.4. 添加剂用量考察
固定药物量为3% (w/v)及PLGA (5002A, Inv = 0.2)浓度为25% (w/v)，系统制备了GMS含量为1%、1.5%、2%及2.5% (w/v)的原位凝胶，以评估GMS浓度对凝胶澄清度、固化行为及流动性的影响。结果显示，当GMS浓度在1%至2%范围内时，所制备的凝胶均能形成澄清透明的溶液，并表现出良好的流动性与固化特性。然而，当GMS含量增至2.5%时，样品在常温避光条件下静置24小时后出现了少量颗粒析出。
3.3. 体外释放含量测定方法的建立
3.3.1. 色谱条件
采用Shim-pac GIST C18色谱柱(150 mm × 4.6 mm, 5 μm)进行分离，流动相为甲醇-pH 6.74磷酸盐缓冲液(75:25, v/v)，流速设定为1.0 mL/min，检测波长为214 nm，柱温箱温度维持在35℃，进样量为20 μL。
3.3.2. 溶液配制
对照品溶液：精密称定依匹哌唑对照品50 mg于250 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度线，摇匀即得依匹哌唑对照品储备溶液(200 μg/ml)。移取适量对照品储备溶液，用释放介质作为稀释液，稀释定容为对照品溶液(20 μg/ml)。
供试品溶液：精密称取依匹哌唑原位凝胶前体约0.02 g，置25 ml小烧杯中，加入1 ml乙腈使原位凝胶完全溶解，再加入9 ml无水乙醇沉淀PLGA，用超声波细胞粉碎机超声5 min形成均质溶液，精密移取上清液1 ml至10 ml离心管中，加入9 ml释放介质，超声混合充分，12,000 r/min离心5 min，取上清液过0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。
空白辅料溶液：精密称取空白原位凝胶前体约0.02 g，后续步骤参照上述供试溶液制备法。
3.3.3. 方法学验证
Figure 1. Chromatograms of blank excipient solution (A), reference substance solution (B), and test solution (C)
图1. 空白辅料溶液(A)、对照品溶液(B)和供试品溶液(C)色谱图
如图1所示，空白辅料(A)、对照品(B)及凝胶供试品(C)色谱图表明，主成分依匹哌唑(保留时间约10分钟)的峰处无显著干扰，证明该方法具有良好的专属性。在0.1至20 μg/mL的浓度范围内，以依匹哌唑峰面积(y)对样品浓度(x)进行线性回归，得到标准曲线方程y = 166841.266x − 6091.823，相关系数R2 = 0.99992，证实了优异的线性关系。准确度验证结果显示，在0.4、2与10 μg/mL三个浓度水平下，测得值与理论值的回收率介于97.86%至98.06%之间(n = 3)，且所有RSD值均低于2%，符合测定要求。
3.4. 原位凝胶体外释放影响因素研究
3.4.1. 不同释放方法对释放的影响
目前，还没有一种最优的体外释放方法来确保吸收条件、样品的重复性以及体内释放的真实预测，通过文献调研，原位凝胶常用体外释放方法有直接注入法、透析袋法、流通池法等，由于释放介质中含有表面活性剂CTAB，采用流通池法可能会出现堵塞、压力高、不好取样等情况，因此本研究拟在直接注入法(样品分离法)、透析袋法中筛选考察较为适宜的体外释放方法。
直接注入法：精密吸取0.1 ml原位凝胶注入80 ml PBS (pH = 7.4，含0.1%CTAB)中，振荡温度：37℃，振荡速度：100 rpm/min。于设定时间点取样1 ml (取出后迅速补加等体积同温度新鲜释放介质)，经0.22 μm微孔滤膜过滤后，进样检测。
透析袋法：精密吸取0.1 ml原位凝胶注入经处理好的透析袋(截留分子量为3000 Da)中，透析袋两端用透析夹夹紧，防止漏液，放入200 ml PBS (pH = 7.4，含0.1%CTAB)中，并保证透析袋完全浸泡于释放介质中，振荡温度：37℃，振荡速度：100 rpm/min。于设定时间点取样1 ml (取出后迅速补加等体积同温度新鲜释放介质)，经0.22 μm微孔滤膜过滤后，进样检测。
暂以药物量3% (w/v)，25% (w/v) PLGA 5002A，考察原位凝胶两种常用体外释放方法(直接注入法、透析袋法)的释放差异，结果见图2。
Figure 2. The effects of different release methods on the release process
图2. 不同释放方法对释放的影响
从图2中可以看出，两法的释放速度有所差异，透析袋法释放速度非常缓慢，7 d内仅释放不到10%，这可能是由于依匹哌唑的溶解度较差，透析袋对药物的扩散有限制，导致释放延迟；相比之下直接注入法则显示出较为理想的体外释放趋势，且该法更能模拟原位凝胶皮下注射这一过程，但实验过程中发现，直接注入法在取样时可能会导致凝胶制剂受到破坏，从而导致样品的释放结果重复性差，综合考虑下本研究采用直接注入法为后续体外释放方法。
3.4.2. 不同型号PLGA及浓度对释放的影响
暂以药物量3% (w/v)，尝试两种不同的载体材料[PLGA (7502A, Inv = 0.12)；PLGA (5002A, Inv = 0.12)]以及不同浓度载体材料(20%~35%, w/v)对原位凝胶体外释放的影响，结果见图3(A)、图3(B)。
Figure 3. The effects of different types of PLGA (A) and different concentrations of PLGA (B) on the release process
图3. 不同型号PLGA (A)及不同浓度PLGA (B)对释放的影响
从图3(A)中可以看出，PLGA (7502A, Inv = 0.12)释放较PLGA (5002A, Inv = 0.12)缓慢，24 h突释较小，但是PLGA (7502A, Inv = 0.12)组释放过程中凝胶骨架有破损、释放液有轻微浑浊现象。相比之下，PLGA (5002A, Inv = 0.12)释放过程中，原位凝胶骨架较稳定，释放液澄清，综合考虑，选择PLGA (5002A, Inv = 0.12)作为载体材料。
从图3(B)中可以看出，当控制处方中载药量不变时，随着PLGA5002A用量的增加，原位凝胶的体外释放速率有所降低，且24 h突释也有所降低，当使用20% (w/v) PLGA时，原位凝胶的流动性及通针性较好，但同时24 h突释最大(可能导致体内实验的血药浓度突破安全阈值)，因此初步拟定将PLGA 5002A用量控制在25%~35% (w/v)。
3.4.3. 载药量对释放的影响
暂以PLGA (5002A, Inv = 0.20) 25% (w/v)，考察不同药物量1%、2%、3% (w/v)对原位凝胶体外释放速率的影响，结果见图4。
从图4中可以看出，随着载药量的增加，原位凝胶的24 h突释率及平均释放率均有所降低，并且从制剂的安全性方面考虑，载药量越高制剂所需注射的体积越小，辅料和有机溶剂的注射量越小，制剂的安全性也随之提高，因此综合考虑，初步拟定药物量为3%(w/v)。
3.4.4. 添加剂及浓度对释放的影响
根据前述得知的较优处方用量范围，尝试向其中加入固体脂质(SA或GMS)以制备性能更好的原位凝胶溶液，以凝胶溶液是否澄清无析出、24 h突释率为指标，筛选出较好的固体脂质，结果见图5(A)、图5(B)。
Figure 4. The influence of different drug loading amounts on release
图4. 不同载药量对释放的影响
Figure 5. The influence of different additives (A) and their concentrations (B) on the release process
图5. 不同添加剂(A)及添加剂浓度(B)对释放的影响
当向处方中加入适量固体脂质(SA或GMS)后，均能形成澄清透明无析出的凝胶溶液。从图5(A)中可以看出，向其中加入固体脂质后，原位凝胶的24 h突释及平均释放均有明显降低，其中GMS调节释放速率较SA更好，图5(B)显示，适当地增大GMS的质量浓度，凝胶的24 h体外突释率会进一步降低，从制剂的安全性方面考虑，这可能会降低体内较高血药浓度风险，综合考虑下，初步拟定GMS的用量为2% (w/v)。
3.5. 星点设计–响应面法优选最优处方
3.5.1. 星点设计方案
由前期试验结果得知，载体材料PLGA浓度(A)、GMS浓度(B)、载药量(C)对原位凝胶的体外释放度有较大的影响，而体外释放度是原位凝胶质量评价的重要指标，可用于预测和评价制剂的体内释放，因此，选择以上三种为响应面法设计的因素，并以更低24 h爆发释放(Y)为评价指标，运用Design-expert软件进行优化，筛选出最优处方。因素及水平表见表1、实验设计及结果见表2。
Table 1. Factor level table
表1. 因素水平表
因素 |
水平(w/v%) |
−1 |
0 |
1 |
PLGA量(A) |
25 |
30 |
35 |
GMS量(B) |
1 |
1.5 |
2 |
载药量(C) |
1 |
2 |
3 |
Table 2. The results of optimizing the in-situ gel formulation using the response surface method
表2. 响应面法优化原位凝胶处方结果
序号 |
A (w/v%) |
B (w/v%) |
C (w/v%) |
24 h爆发释放-Y (%) |
1 |
25 |
1 |
2 |
16.03 |
2 |
35 |
1 |
2 |
7.82 |
3 |
25 |
2 |
2 |
10.03 |
4 |
35 |
2 |
2 |
6.97 |
5 |
25 |
1.5 |
1 |
14.36 |
6 |
35 |
1.5 |
1 |
8.66 |
7 |
25 |
1.5 |
3 |
9.53 |
8 |
35 |
1.5 |
3 |
6.17 |
9 |
30 |
1 |
1 |
11.89 |
10 |
30 |
2 |
1 |
9.56 |
11 |
30 |
1 |
3 |
7.59 |
12 |
30 |
2 |
3 |
6.22 |
13 |
30 |
1.5 |
2 |
8.24 |
14 |
30 |
1.5 |
2 |
8.98 |
15 |
30 |
1.5 |
2 |
7.63 |
16 |
30 |
1.5 |
2 |
9.08 |
17 |
30 |
1.5 |
2 |
7.54 |
3.5.2. 模型拟合
运用Design-Expert 13.0对实验结果进行二次项回归拟合，拟合结果如下：Y = 8.29 − 2.54A − 1.32B − 1.87C + 1.29AB + 0.5850AC + 0.24BC + 1.39A2 + 0.5267B2 − 0.0057C2 (R2 = 0.9657 > 0.9, p < 0.05)。由方差分析结果表3可知，所建立的模型p < 0.001，结果显著；失拟项p > 0.05，说明该二次项模型拟合较好，可用来进行响应值预测。
3.5.3. 优选结果
根据拟合方程，绘制Y随各因素(A/B/C)变化的效应面三维图，见图6。通过Design-Expert 13.0中的Optimization功能，以更低的24 h初期释放指标，筛选出依匹哌唑原位凝胶前体溶液的适宜配方为：PLGA用量为33.781%，API用量为2.92%，GMS用量为1.552% (w/v)。
Table 3. Analysis of variance results
表3. 方差分析结果
来源 |
平方和 |
自由度 |
均方 |
F |
P |
模型 |
111.50 |
9 |
12.39 |
21.88 |
0.0003 |
A-PLGA量 |
51.66 |
9 |
51.66 |
91.22 |
<0.0001 |
B-GMS量 |
13.91 |
1 |
13.91 |
24.57 |
0.0016 |
C-载药量 |
27.98 |
1 |
27.98 |
49.40 |
0.0002 |
AB |
6.63 |
1 |
6.63 |
11.71 |
0.0111 |
AC |
1.37 |
1 |
1.37 |
2.42 |
0.1640 |
BC |
0.2304 |
1 |
0.2304 |
0.4068 |
0.5439 |
A2 |
8.16 |
1 |
8.16 |
14.40 |
0.0068 |
B2 |
1.17 |
1 |
1.17 |
2.06 |
0.1941 |
C2 |
0.0001 |
1 |
0.0001 |
0.0002 |
0.9879 |
残差 |
3.96 |
7 |
0.5663 |
|
|
失拟项 |
1.86 |
3 |
0.6212 |
1.18 |
0.4215 |
纯误差 |
2.10 |
4 |
0.5252 |
|
|
总离差 |
115.46 |
16 |
|
|
|
Figure 6. Three-dimensional graph of the effect of Y on various factors
图6. Y随各因素变化的效应面三维图
3.5.4. 处方验证
根据筛选出的最优处方，平行制备3批原位凝胶前体溶液，按体外释放度方法进行体外释放，并测定其24 h初期释放以及观察后续长期释放情况，3批样品30 d平均累积释放度达80%左右，后期释放较为平稳，且所测得的24 h初期释放实际值与模型预测值近似，进一步表明模型拟合较可靠，见表4、图7。
Table 4. Optimal prescription verification results
表4. 优选处方验证结果
评价指标 |
预测值(%) |
实际值(%, n = 3) |
RSD (%) |
24 h初期释放(%) |
6.147 |
6.283 ± 0.041 |
0.67 |
Figure 7. Optimal prescription in situ gel 30-day in vitro cumulative release curve (n = 3)
图7. 优选处方原位凝胶30 d体外累计释放曲线(n = 3)
3.6. 依匹哌唑原位凝胶体外释放机制的初步研究
为探究优选处方的释药机理，本研究采用Origin 2021软件，将其体外释放度结果与以下几个释放动力学模型进行拟合。通过比较各模型的拟合优度(以相关系数R2为判据)，初步阐明了该原位凝胶的体外释放规律。如表5所示，该制剂的累积释放曲线与一级释放模型和Weibull分布模型具有更好的相关性，这说明该制剂可能具有一种以扩散为主导，但可能伴随一定延迟或结构变化的释放机制。
Table 5. The fitting results of the optimal in vitro release model
表5. 最佳处方体外释放模型拟合结果
模型 |
拟合结果 |
R2 |
零级释放 |
y = 5.596 + 0.11142x |
0.97213 |
一级释放 |
y = 112.96 * (1−e−0.00164x) |
0.98518 |
Higuchi释放 |
y = 2.948x1/2 − 5.922 |
0.96284 |
Weibull释放 |
y = 292.446 * (1−e−(0.0014(x−3.453))^0.81101) |
0.98789 |
4. 讨论
截至目前，全球超10亿人有精神健康问题，尽管已有除口服以外的其他剂型上市，但当下主要的治疗手段仍以口服药物治疗为主，存在依从性差的潜在问题。本文制备了以PLGA为基质材料的依匹哌唑原位凝胶植入剂，用于精神病患者的长期治疗，以期提高患者的用药依从性。本文考察了PLGA浓度、载药量、添加剂种类及浓度对体外释放的影响，并对其进行了星点设计–效应面优选处方研究。不同PLGA浓度、载药量、添加剂种类及浓度的药物释放行为存在差异，且后续长期体外释放行为表明其具有开发为长效制剂的潜力，与普通依匹哌唑口服片剂(目前仅有口服片剂上市)相比可显著提高患者用药依从性。但目前体外释放的方法尚不足以准确地给出制剂突释情况的信息，且该制剂的体内效果也有待进一步的动物实验验证，后续需要更加深入的研究以准确地指导处方开发。总之，本研究为依匹哌唑长效注射剂的研究提供了一定的参考价值，未来可在本研究的基础上进行优化，使依匹哌唑长效制剂的临床应用成为可能。
NOTES
*第一作者。
#通讯作者。