1. 引言
肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是全球范围内最常见的原发性肝癌类型，占所有肝癌病例的约75%至85% [1]。HCC的高发病率和高死亡率使其成为全球重大公共健康问题。尽管近年来的筛查和治疗手段有所进步，但由于HCC的复杂病因和异质性，整体预后仍较差。手术切除、局部消融、射频消融和肝移植等治疗手段在早期HCC中显示出一定疗效，但大多数患者在确诊时已经是晚期，因此失去了治愈性手术的机会[2]。PI3K/AKT/mTOR通路对癌症患者的细胞运动、生长、存活和代谢至关重要[3]。YAP1基因编码的是Yes-Associated Protein 1，其在Hippo信号通路中扮演关键角色，该通路主要调节细胞生长、增殖和凋亡[4]。本文将通过生物信息学和部分细胞实验来分析并验证YAP1基因可能通过参与PI3K/AKT信号通路，并对细胞功能产生影响。
2. 材料与方法
2.1. 实验材料
本研究所需主要试剂及材料均位于下方表格中，其中细胞系的选取由生物信息学筛选后选取。
2.1.1. 细胞系培养
购置的人肝癌细胞系SNU-398细胞来自北京中生奥邦生物科技有限公司。
SNU-398细胞的培养是使用含10%胎牛血清、1%青霉素–链霉素混合液的1640完全培养基进行培养，培养环境为37℃、95% O2、5% CO2 (相对湿度95%)的恒温恒湿孵箱。传代操作依据细胞密度按1:2比例进行，传代周期约2~3天；当细胞完全贴壁并形成致密单层时，采用胰酶消化处理，最终选取状态良好的对数生长期细胞用于后续实验。
2.1.2. 实验试剂、仪器及耗材
见表1、表2、表3及表4。
Table 1. siRNA sequences
表1. SiRNA序列
Si-RNA名称 |
序列(5’-3’) |
YAP1-human-440 |
正义链CUGCCACCAAGCUAGAUAATT |
反义链UUAUCUAGCUUGGUGGCAGTT |
YAP1-human-19 |
正义链GGUCAGAGAUACUUCUUAATT |
反义链UUAAGAAGUAUCUCUGACCTT |
YAP1-human-99 |
正义链GACGACCAAUAGCUCAGAUTT |
siRNA阴性对照 |
反义链AUCUGAGCUAUUGGUCGUCTT 正义链GUAUGACAACAGCCUCAAGTT 反义链CUUGAGGCUGUUGUCAUACTT |
Table 2. Primer sequences
表2. 引物前体
引物 |
序列(5’-3’) |
YAP1-human-Primer |
F GACCAATAGCTCAGATCCTTTCC |
|
R GACACTGTAGCTGCTCATGCTTA |
Table 3. Major reagents
表3. 主要实验试剂
主要实验试剂 |
生产公司 |
1640培养基 |
北京中生奥邦生物科技有限公司 |
青霉素–链霉素溶液(双抗) |
北京中生奥邦生物科技有限公司 |
0.25%胰蛋白酶 |
北京中生奥邦生物科技有限公司 |
胎牛血清(FBS) |
武汉普诺赛生命科技有限公司 |
细胞快速冻存液(无血清) |
上海雅酶生物医药科技有限公司 |
Lipo 3000 |
北京聚合美生物科技有限公司 |
CCK-8试剂盒 |
北京聚合美生物科技有限公司 |
反转录试剂盒 |
北京聚合美生物科技有限公司 |
荧光定量试剂盒 |
北京聚合美生物科技有限公司 |
总RNA提取试剂盒 |
北京聚合美生物科技有限公司 |
基质胶–高浓度含酚红 |
北京兰博利德商贸有限公司 |
HRP标记二抗 |
上海雅酶生物科技有限公司 |
Anti-Phospho-YAP1(Ser127)Rabbit mAb |
上海雅酶生物科技有限公司 |
Anti-AKT1/2/3 Rabbit mAb |
上海雅酶生物科技有限公司 |
GAPDH兔多克隆抗体 |
上海雅酶生物科技有限公司 |
SC79 |
碧云天生物技术研究所 |
Tris碱 |
北京博奥拓达科技有限公司 |
SDS |
北京博奥拓达科技有限公司 |
脱脂奶粉 |
北京博奥拓达科技有限公司 |
Table 4. Major instruments and consumables
表4. 主要仪器和耗材
名称 |
生产厂家 |
37℃二氧化碳细胞培养箱 |
美国Thermo公司 |
微量分光光度计 |
美国Thermo公司 |
倒置相差荧光显微镜 |
奥林巴斯(深圳)工业有限公司 |
生物安全柜 |
益世科上海企业发展有限公司 |
电热恒温鼓风干燥箱 |
上海浦东荣丰科学仪器有限公司 |
电热恒温水浴锅 |
上海博迅实业有限公司 |
高压灭菌锅 |
日本SANYO公司 |
制冰机 |
斯科茨曼制冰系统(上海)有限公司 |
低速离心机 |
北京医用离心机厂 |
高速低温离心机 |
湖南湘仪实验室仪器开发有限公司 |
酶联免疫分析仪 |
北京领宇科技有限公司 |
超纯水制造系统 |
密理博(中国)有限公司 |
电子微量天平 |
上海精科天平仪器厂 |
磁力搅拌器 |
上海医用仪器厂 |
涡旋混合器 |
杭州旌斐仪器科技有限公司 |
0.1 ml八联排PCR管 |
美国Corning公司 |
Eppendorf管(EP管) |
美国Corning公司 |
100 mm细胞培养皿 |
美国Corning公司 |
移液枪 |
德国Eppendorf公司 |
细胞计数板 |
上海求精生化试剂仪器有限公司 |
15 ml、50 ml无菌离心管 |
北京兰杰柯科技有限公司 |
10 ml移液管 |
北京兰杰柯科技有限公司 |
6/24/96孔板 |
美国Corning公司 |
10/200/1000 μl无菌无酶枪头 |
北京兰杰柯科技有限公司 |
Qtower3荧光定量基因扩增仪 |
耶拿分析仪器(北京)有限公司 |
Transwell小室 |
美国Corning公司 |
2.2. 方法
本研究通过生信筛选并提出假设，通过细胞实验验证生信所提出的相关假设。
2.2.1. 生物信息学方法
常见肿瘤的STAR-counts数据及相应临床信息来源于TCGA数据库(https://portal.gdc.cancer.gov)，数据下载后先提取TPM格式文件，筛选出具备RNAseq数据与临床信息的样本，共33个样本纳入后续分析。在KM生存分析框架下，针对上述两组的生存数据，采用logrank检验方法进行组间比较，进而评估两组研究对象在生存时间分布上的差异是否具有统计学意义，先通过logrank检验得出评估生存差异显著性的p值，再通过单变量Cox回归分析获取危险比(HR)，同时计算该HR值对应的95%置信区间(CI)。先获取目标通路中包含的所有相关基因并进行整合，再使用R软件的GSVA包开展后续分析，通过将参数method指定为"ssgsea"，来实施单样本基因集富集分析(ssGSEA)。之后，通过斯皮尔曼相关性分析来研究基因表达与通路得分的相关性。GTEx数据来源于V8版本，详细信息可在GTEx官方网站(https://gtexportal.org/home/datasets)查看。通过临床生信之家(https://www.aclbi.com/)在线生信分析，并在TISCH下载对应单细胞数据LIHC_GSE146115.h5格式文件和注释结果，使用R软件MAESTRO和Seurat对单细胞数据进行处理和分析，采用t-SNE方法重新进行细胞聚类分群。我们使用版本为v4.0.3的R软件进行统计分析。当P值小于0.05时，认为结果具有统计学意义。
2.2.2. 人肝癌细胞的选择与转染
以SNU-398为例人肝癌细胞系为研究对象，将细胞分为NC-siRNA组和YAP1-siRNA组，每组细胞数量相同。NC-siRNA组加入Lipo-3000和无意义序列的siRNA (即NC-siRNA)，YAP1-siRNA组(YAP1-1 group, YAP1-2 group, YAP1-3 group)加入Lipo-3000分别将三条人工合成的不同序列(YAP1-1, YAP1-2)，YAP1-转染至SNU-398人肝癌细胞中。为选取敲低效果最佳的YAP1-siRNA进行后续实验，转染成功后通过RT-qPCR检测每组细胞中mRNA表达水平，选取相对表达量最低的一组。
2.2.3. CCK-8细胞增殖实验
使用上述方法对细胞进行转染。以0 h、24 h、48 h、72 h为时间点，CCK-8法检测细胞增殖活性，观察转染对细胞增殖的影响，绘制相对增殖曲线，重复3次以避免误差。
2.2.4. Transwell细胞侵袭实验
实验前将基质胶置入4℃冰箱过夜融化，并将细胞进行饥饿处理24 h。在制胶，液化完成后，向小室的下室内注入600 μl完全培养基，上室加入200 μl无血清细胞悬液，将小室放入细胞培养箱中培养48小时。48小时后取出小室，依次进行PBS清洗、4%多聚甲醛溶液固定、0.1%结晶紫溶液染色步骤。用棉签轻轻去除上室的细胞后，将小室置于显微镜下，开展细胞拍照与计数工作。
2.2.5. RT-qPCR实验
实验所需主要材料说明：实验所需试剂盒为北京聚合美生物科技有限公司的总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒及荧光定量试剂盒。实验所需其他产品均来源于表1及表2。实验前准备：实验前需将细胞转染完毕，通过总RNA提取试剂盒，依据说明书规范操作，提取总RNA，提取后的样本需经分光光度计校准以确定样本纯度是否满足后续实验。测定样品260 nm和280 nm的吸光度，重复三次。吸光度260/280比值在1.8~2.0之间表明RNA纯度合格。所需冷冻保存的试剂及分装稀释好的引物放置于冰上解冻，将提取出的样本依据后续试剂盒的说明书规范操作，得到实验结果。
2.2.6. Western Blot实验
样品制备：收集细胞，依据试剂说明，加入蛋白裂解液，提取总蛋白，用BCA法定量。完成制胶后，加样电泳。向提前标记好的泳道内加入2.5 µl marker，然后依照事前标记好的泳道内加入不同组蛋白，每个泳道上样量为4.5 µg。组装后倒入1 × 电泳缓冲液，盖上槽盖，接通电源，将参数调制90 V、30 min电泳，待marker蛋白电泳分散后(形成多色条带)，再将设定改为120 V，1 h。根据点用好的凝胶大小裁剪好PVDF膜，在PVDF膜的凸面上角标记好A，B以作为区分。依据操作说明，以甲醛激活PVDF膜。转膜参数为210 mA，60 min。转膜后室温摇床封闭1小时，TBST清洗PVDF膜，加入一抗。4摄氏度过夜，使用TBST摇床清洗，加入二抗，2小时后清洗，清洗后使用ECL化学发光试剂盒，进行显影，得到实验条带。
2.2.7. 统计学方法
本研究的统计学分析借助SPSS 27.0软件完成，实验图片的处理采用Image J软件，实验图表通过GraphPad Prims 10绘制；实验数据以“均数 ± 标准差(x̄ ± s)”形式呈现。其中，CCK-8实验结果采用单因素方差分析进行统计检验，其余实验结果均通过两样本t检验分析差异，当P值小于0.05时，认定实验结果具有统计学意义。
3. 实验结果
首先对33种常见癌类进行差异表达分析如图1所示，其中胆管癌、肾嫌色细胞癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤中正常细胞相较于肿瘤细胞YAP1的表达量高，与之相反，肝细胞癌、直肠腺癌、结直肠癌、食管癌、宫颈鳞状细胞癌、乳腺浸润性癌、胃腺癌等其他多种常见癌类中正常细胞相较于肿瘤细胞YAP1的表达量低。肿瘤组织中QUANTISEQ免疫浸润评分与YAP1基因表达的相关性分析热图见图2，横坐标为不同肿瘤组织，纵坐标为各种免疫细胞；其中可见M2型巨噬细胞在肝细胞癌中有明显相关性，且颜色深度大于M1型，则YAP1与M2型巨噬细胞的相关性大于M1型，同时也与多种免疫细胞相关，图3所示为不同肿瘤组织中免疫检查点相关基因的表达热图，其中横坐标为各类免疫检查点基因，纵坐标为不同肿瘤组织类型。可见YAP1在肝细胞癌中与多种免疫检查点均有关，其可能是协助发生免疫逃逸的因素。两图*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001为显著性水平的标识。
Figure 1. Pan-cancer analysis
图1. 泛癌分析
Figure 2. Correlation between tumor cells and immune cells
图2. 肿瘤细胞与免疫细胞之间的相关性
Figure 3. Heatmap of immune checkpoint-related gene expression in different tumor tissues
图3. 不同肿瘤组织中免疫检查点相关基因的表达热图
在发现YAP1基因在肝细胞癌的正常与病理组织中有差异性后，对该基因进行了后续分析，如图4所示，通过富集分析，分析了该基因可能的促癌机制，图4(A)中颜色越靠近红色则其相关性越高，圆点面积越大则其错误发生率越低，结果越可靠，横坐标则为不同参与调解方式及其代谢通路，具体的由此可见在信号转导通路中，上皮–间质转化及PI3K/AKT通路相关性较显著，B通过不同数据库再次印证，通过Z-score标准分数，表达不同通路的丰度值，在得到该基因可能会涉及PI3K/AKT通路后，如图4(C)所示，其颜色越深则相关度越高，通过TCGA数据库再次验证该基因与通路中核心蛋白的相关性，得到的结果表明AKT1，AKT2，AKT3及MTOR均有较强的相关性。
Figure 4. Enrichment analysis and correlation of core pathway proteins
图4. 富集分析及通路核心蛋白相关性
发现YAP1可能涉及到影响信号转导通路后，对其预后分析和重要临床指标进行分析，图5(A)中通过cutpiont函数，选取最佳截断值，B中绘制KM生存曲线，p < 0.05，对生存有影响，高表达预后差而低表达预后可，而后又对YAP1高低表达与Child分级及AFP表达量进行差异分析，其中B表示YAP1的高低与child分级尤其是A与B、C之间存在差异性，这对患者手术耐受存在一定指导意义，而AFP又是传统肝癌筛查指标，可见正常组与升高组之间存在差异，对此绘制ROC诊断曲线，发现曲线下面积为0.706，证明YAP1对肝细胞癌存在诊断价值，有一定诊断敏感性。单细胞细胞聚类t-SNE图，不同颜色代表不同类型的细胞见图6(A)。YAP1基因在上述A中各种细胞表达分布t-SNE图，不同颜色代表表达其丰度，颜色越亮代表细胞中该基因的表达高参照图6(B)。不同细胞中所选基因表达丰度柱状图见图6(C)。由此可见，在LIHC_GSE146115.h5数据中，恶性细胞表达YAP1的含量最高。
为继续明确该基因是否与肝细胞癌有关，在图7中，A为RT-qPCR，其中siRNA-YAP1-440敲低效果佳，后续所有模型塑造均使用该试剂；B为WB实验结果，其中YAP1蛋白表达降低，表明造模达到预期效果，随后进行C、D两步实实验，分别为CCK-8增殖实验及transwell侵袭实验，结果表示是将YAP1基因表达敲低后，肝癌细胞的增殖及侵袭能力降低。为进一步验证YAP1可能作用到PI3K/AKT通路中，对其通道核心蛋白AKT及p-AKT进行WB实验，并通过通道激活剂SC79，对通道进行挽救实验，结果如图8所示，A为WB结果，B、C仍分别为CCK-8增殖实验及transwell侵袭实验，但通过挽救实验，其细胞功能并未得到有区别的恢复。
Figure 5. Clinical impact of YAP1 on hepatocellular carcinoma
图5. YAP1对肝细胞癌的临床影响
Figure 6. Single-cell clustering map
图6. 单细胞细胞聚类图
Figure 7. Cell experiments
图7. 细胞实验
Figure 8. Rescue experiments
图8. 挽救实验
4. 讨论
肝癌作为我国目前常见的癌症，其病理演化多经过乙肝–肝硬化–原发性肝癌，这一经典阶段，肝癌多以症状不明显，发病多出现于癌症中后期为典型，这造成了疾病发现往往错过最佳治疗窗口的事件经常发生[5]。YAP1作为一种Hippo信号通路的核心蛋白，其致癌作用也多研究与Hippo通路有关[4]。在通过图1的泛癌分析中，初步发现在正常组织和肝细胞癌组织中，YAP1表达量明显不同，这样的差异表达使得YAP1可能是肝细胞癌的促癌因素，在这样的前提下，又进行了图2、图3的免疫分析，可以发现M2型巨噬细胞相关性强，这说明有可能是YAP1诱导M2型巨噬细胞活化或激活，通过M2型巨噬细胞调节肿瘤免疫微环境，抑制免疫或帮助肿瘤细胞增殖迁移等作用[6]。而图3的免疫检查点，在肝细胞癌中有多个位点具有相关性，这将为研发免疫治疗药物提供新思路。而图6中，对肝细胞癌的单细胞数据LIHC_GSE146115进行tsne图分类，由此可以进一步验证YAP1的高表达，更多的集中在肿瘤细胞中。
对YAP1进行功能富集，有两个有显著相关性的通路，一个是上皮–间质变通路，另一条是PI3K/AKT通路。同时图4里又进行了PI3K/AKT通路核心蛋白的相关性分析，结果也同样提示有明显相关性，所以可以推断YAP1可能是在PI3之后，AKT之前或生成之中参与通路。PI3K/AKT/mTOR通路对恶性肿瘤患者细胞的功能至关重要[3]。PIP3作为一个重要的第二信使，招募带有PH结构域的信号蛋白如AKT到细胞膜[7]。活化的AKT调节多种下游效应，包括mTORC1以促进蛋白合成，及抑制GSK-3β以调节代谢和细胞周期[8]。PI3K/AKT通路在多种癌症中发挥着关键作用，该信号通路涉及细胞生长、增殖、存活和代谢的调控，其异常激活与肿瘤发生、发展密切相关[9]。在肝细胞癌中，PI3K/AKT通路常常被过度激活。这种激活可能由于几种因素导致，如PI3K或AKT基因的突变、抑制其负调控因子的基因(如PTEN)的突变或缺失，以及受体酪氨酸激酶(如EGFR)的过度表达[9]。这些基因和分子变化会促进细胞无控制地生长，并抑制凋亡，从而推动癌变。而除了这些核心基因，其他基因的突变也可能导致该通路的过度激活，而YAP1此前被证明与Hippo通路相关，而无文章报道是否参与PI3K/AKT通路，而YAP1表达量的高低又影响着肝细胞癌患者的预后及临床相关指征，所以进一步研究该基因，或许可以为日后的免疫治疗及靶向治疗提供新的思路。
通过TCGA数据库，整理的临床信息与YAP1进行差异分析，可以推断出图5中，YAP1的高表达，对患者预后是负面影响，同时也会影响child分级。Chlid分级作为临床上肝功能评判的一大准则，在原发性肝癌的患者中，对于患者能否耐受肝切除术，术后的康复及并发症的影响均是至关重要的[10] [11]。同样AFP对原发性肝癌的诊断至今仍有很高的特异性和敏感性，而YAP1的变化也与AFP的增高有关，但这也有可能是因为原发性肝癌的发生导致AFP与YAP1分别增高[12]。
为进一步研究并验证生物信息学中提供的可能，后续进行了细胞实验，图7中，AB两图证明了从转录到翻译层面上，YAP1的表达均下降的模型创建，同时WB实验提示肝细胞癌中敲低YAP1会导致AKT及p-AKT的降低，这也说明YAP1可能参与或调节PI3K/AKT通路。同时C、D两图为细胞功能学实验，两图也证明YAP1敲低后，肿瘤细胞的增殖和侵袭能力是降低的，也表明YAP1可以促进肝细胞癌的增殖和侵袭能力。
为完善实验中可能存在的缺陷，通过SC79，一种AKT蛋白激活剂，对该信号转导通路进行挽救实验，重复上述实验，图8(A)中在蛋白水平，AKT及p-AKT得到一定恢复，而细胞水平上，尤其是细胞功能学实验图8(B)、图8(C)中，细胞的增殖和侵袭功能并未得到恢复，这证明了YAP1的敲低抑制了不止一条信号通路，干扰的细胞功能是多样的，同时PI3K/AKT通路也可能并未完全恢复，或恢复后仍不能缓解基因敲低所带来的其他功能抑制的影响。
综上所述，YAP1在肝细胞癌中高表达且高表达YAP1的肝细胞癌患者生存预后较差。敲低YAP1可以抑制肝癌细胞的增殖与侵袭能力。YAP1可能通过PI3K/AKT信号通路导致肝癌的发生与发展。
NOTES
*通讯作者。