摘要: 目的：运用网络药理学与分子对接，研究肾炎方对早期肾小球肾炎(GN)的潜在作用机制。方法：在TCMSP数据库中提取五味药材活性成分，通过uniprot和SwissTargetPrediction数据库预测药物活性成分靶点，DrugBank、GeneCards、OMIM和TTD数据库收集GN疾病靶点，药物与疾病靶点取交集；利用STRING软件构建PPI网络，CytoNCA插件筛选核心靶点，Cytoscape软件进行“药物–活性成分–交集靶点–疾病”网络拓扑分析；R语言对交集靶点做GO和KEGG富集分析；AutoDock Vina软件做分子对接，PyMOL软件将结合模式可视化。结果：筛选到186个活性成分，预测到358个成分靶点，并与1157个疾病靶点取交集得到118个交集靶点；网络拓扑锁定IL6、TNF、STAT3、JUN等9个核心靶点以及排名前十位的核心成分；富集指向AGE-RAGE、TNF、IL-17等炎症信号。对接显示二氢丹参酮I对SRC亲和力最高(−9.9 kcal/mol)，槲皮素、山奈酚、木犀草素均以氢键锚定SRC，而二氢丹参酮I-TP53靠疏水接触稳定。讨论：肾炎方可能通过调控SRC/STAT3等核心靶点干预GN早期炎症反应，为后续实验验证提供方向。
Abstract: Objective: To investigate the potential mechanism of Shenyan Formula in the treatment of early glomerulonephritis (GN) using network pharmacology and molecular docking. Method: Active components of five medicinal materials were extracted from the TCMSP database. The drug active component targets were predicted through the uniprot and SwissTargetPrediction databases. The GN disease targets were collected from the DrugBank, GeneCards, OMIM and TTD databases, and the intersection of drug and disease targets was taken. The STRING software was used to construct the PPI network, and the CytoNCA plugin was used to screen the core targets. The “drug-active component-intersection target-disease” network topology analysis was performed using Cytoscape software. The R language was used to perform GO and KEGG enrichment analysis on the intersection targets. Molecular docking was performed using AutoDock Vina software, and the binding mode was visualized using PyMOL software. Results: 186 active components were screened, and 358 component targets were predicted. The intersection of these with 1157 disease targets yielded 118 intersection targets. Network topology identified 9 core targets including IL6, TNF, STAT3, and JUN, as well as the top ten core components. Enrichment analysis pointed to inflammatory signaling pathways, such as AGE-RAGE, TNF, and IL-17. Docking studies revealed that dihydrotanshinone I exhibited the highest affinity for SRC (−9.9 kcal/mol), while quercetin, kaempferol, and luteolin were anchored to SRC via hydrogen bonds, and dihydrotanshinone I-TP53 was stabilized by hydrophobic interactions. Discussion: The Nephritis Formula may intervene in the early inflammatory response of GN by regulating core targets such as SRC/STAT3, providing direction for subsequent experimental validation.
1. 引言
肾小球肾炎(GN)表现为肾小球炎症的异质性病变，临床可见血尿、蛋白尿、高血压及肾功能减退等表征，重症者常进展为慢性肾病(CKD)乃至终末期肾病(ESRD) [1]。当前，免疫学与分子生物学进展推动着病理认知深化，其分类模式正逐步由形态学导向转向病因免疫病理学体系[2]。但需清醒认识到，现代医疗在GN诊疗领域虽获突破，仍深陷多重困境：治疗响应不足、药物副反应突出、复发率居高不下[3]。此种现实困境使探索安全疗法具有迫切临床价值，尤以传统医学为关键方向。
传统医学在肾病治疗领域凭借经验传承展现独特优势。其所具的多组分协同、多靶向调节的特征，与GN复杂病理网络高度契合[4]。由黄芪、甘草、玉米须、山药及紫丹参组成的经验方肾炎方，临床成效已获反复验证。黄芪功擅补气固表，主含黄芪多糖与皂苷类物质，实验证实其可协同调控免疫、抑制炎变、改善肾功[5]；甘草则以甘草酸/次酸为核心，通过遏制氧化应激与免疫亢进抑制肾小球炎性进程[6]；玉米须所含黄酮类组分兼具利尿、降压及抗炎三重效应，直接保护肾小球结构[7]；山药多糖及皂苷通过清除自由基庇护肾小管上皮；紫丹参中丹参酮与丹酚酸组分更具改善微循环、阻滞纤维化进程的明确功效[8]。
本研究整合网络药理学与分子对接技术，聚焦肾炎方干预早期肾病的深层机制。网络药理学作为交叉学科工具，通过建立“药物–活性物–靶点–疾病”四维关联，揭示复方核心物质群及作用靶标；基于GO与KEGG富集结果，解析其干预的生物学进程与信号路径；分子对接技术则直观验证关键成分–靶点结合效能。这种多维度研究方法不仅为中医方剂理论提供现代诠释，更将为肾脏病创新疗法开辟路径。
2. 材料与方法
2.1. 药物活性成分筛选及靶点预测
基于TCMSP数据库(https://www.tcmsp-e.com/)，对肾炎方中的黄芪、甘草、玉米须进行活性成分信息筛选。设定：口服生物利用度(OB) ≥ 30%、类药性(DL) ≥ 0.18作为初筛标准，并与uniprot (https://www.uniprot.org/)数据库中已验证过的人类基因靶点数据对照，将活性成分的“Gene name”转换成统一的“Gene symbol”。鉴于TCMSP对丹参极性酚酸、山药多糖等水煎关键成分的成药性预测普遍偏低，易将其误判为非活性，本研究遂以药典结合文献回溯方式补足丹参、山药的水溶部分。丹参水溶性成分以2020版《中国药典》含量测定指标丹酚酸B [9]为必纳对象，并扩展引用Hu et al. (2005)经LC-MS-MS确证的11个酚酸峰[10]，形成涵盖法定指标与水煎物质基础的代表性成分群。至于山药，依据许蕊蕊等(2025) Q-marker研究[11]，选取含量可测且网络连接度高的尿囊素作为补充指标，确保与临床用法一致(见表1)。补充成分均通过PubChem获取SMILES号，经SwissTargetPrediction (probability ≥ 0)及UniProt映射，获得官方“Gene symbol”，与TCMSP数据合并后进行后续网络构建。
Table 1. Supplemented representative compounds from decoction in the literature
表1. 文献补充水煎代表成分
药材 |
成分名 |
PubChem CID |
丹参 |
Danshensu |
11600642 |
Protocatechuic acid |
72 |
Protocatechualdehyde |
8768 |
Caffeic acid |
689043 |
Rosmarinic acid |
5281792 |
Salvianolic acid A |
5281793 |
Salvianolic acid B |
6451084 |
Salvianolic acid D |
75412558 |
Salvianolic acid E |
86278266 |
Salvianolic acid F |
10903113 |
Lithospermic acid |
6441498 |
山药 |
Allantoin |
204 |
注：丹参成分源自Hu et al. (2005)确证的11个酚酸峰；山药成分取自许蕊蕊等(2025) Q-marker研究。
2.2. 疾病靶点及交集靶点筛选
在DrugBank (https://go.drugbank.com/)、GeneCards (https://www.genecards.org/)、OMIM (https://www.omim.org/)及TTD (https://db.idrblab.net/ttd/)四大疾病靶点数据库中，以“Glomerulonephritis”为统一检索的关键词，获取到的疾病靶点合并去重后，得到肾小球肾炎相关靶点。将获得的疾病相关靶点与药物活性成分预测到的靶点进行Venny (https://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html)交集运算，并做可视化。最终获得的交集基因，作为肾炎方干预肾小球肾炎的潜在作用靶标。
2.3. PPI网络构建与核心靶点
将药物与疾病的交集靶点放入STRING (https://cn.string-db.org/)平台中，筛选物种为“Homo sapiens”，设定combined score ≥ 0.900，隐藏孤立节点(Degree = 0)，生成蛋白质–蛋白质之间相互作用网络(PPI)，同时下载可在Cytoscape(v3.8.0)软件中打开的TSV格式数据文件，将文件导入Cytoscape软件中，对PPI功能枢纽网络进行美化。并使用Cyto NCA插件中的介数中心性(betweenness)、接近中心性(Closeness Centrality)、度中心性(Degree Centrality)、特征向量中心性(Eigenvector)、局部平均连通性(LAC)和网络中心性(Network)的各个中位数筛选出核心靶点，通过两次中位数筛选，得到9个核心靶点并构建网络图。
2.4. 成分–靶点–疾病网络图
根据所得到药物和疾病的数据，制作网络前置文件，将文件导入Cytoscape软件中，构建药物–活性成分–交集靶点–疾病网络。
2.5. GO和KEGG富集分析
将交集靶点数据的文件位置复制粘贴于Rstudio (4.4.3)软件中，利用R语言包“colorspace”、“stringi”和“ggplot2”进行GO与KEGG绘图。分别选取GO分析结果排名前10的条目和KEGG分析结果排名前30的通路进行可视化处理。
2.6. 分子对接
根据核心靶点子网络和药物–活性成分–交集靶点–疾病网络，分别选择Degree值排名前4的核心靶点和活性成分做分子对接。利用uniprot数据库，从已验证过的人类蛋白质中筛选，选择AlphaFold预测的蛋白三维结构，以PDB文件格式下载。通过TCMSP数据库，下载活性成分的MOL2格式。将蛋白结构的PDB文件在AutoDockTools (1.5.7)软件打开，去水加氢计算电荷后，设定为蛋白受体，pdbqt格式保存。同样，核心成分加氢计算电荷，设定小分子配体，设置旋转键，保存文件。此外，设置对接盒子，覆盖结合位点，“exhaustiveness”设置20，“energy_range”设置5，通过AutoDock vina (1.1.2)做分子对接。选取结合能最低的对接构象，采用PyMOL (3.1.3.1)进行对接可视化处理。
3. 结果
3.1. 肾炎方活性成分及其作用靶点筛选
初筛获得各中药活性成分分别有：甘草88种，黄芪17种，玉米须9种，丹参69种，山药13种。对合并后的活性成分进行跨药材的去重处理，发现存在8种共有的活性成分(见表2)。合并去重后最终得到唯一活性成分186种，得到活性成分靶点3638个。剔除重复靶点，最终获得358个靶点基因。
3.2. 肾小球肾炎相关靶点挖掘及交集靶点筛选
运用DrugBank、GeneCards、OMIM、TTD数据库，共识别到1157个与GN病理紧密关联的人类靶标基因(见图1(a))，为锁定肾炎方作用的核心靶点群，应用Venny分析工具，对1157个GN靶点与358个肾炎方潜在作用靶点进行系统性韦恩交集计算，分析结果得到118个交集靶点(见图1(b))。
Table 2. Common active components of the drugs
表2. 药物共同活性成分
MOLID |
Common active ingredient |
Herbs |
MOL000006 |
luteolin |
DS1, YMX3 |
MOL000354 |
isorhamnetin |
GC5, HQ4 |
MOL000417 |
Calycosin |
GC16, HQ11 |
MOL000422 |
kaempferol |
GC1, HQ1 |
MOL000098 |
quercetin |
GC2, HQ2 |
MOL000239 |
Jaranol |
GC11, HQ10 |
MOL000449 |
Stigmasterol |
SY1, YMX2 |
MOL000392 |
formononetin |
GC6, HQ5 |
Figure 1. Venn diagram of drug-disease related targets
图1. 药物–疾病相关靶点韦恩图
3.3. 蛋白互作网络构建及核心靶点识别
基于118个药物疾病交集靶点，利用STRING平台构建PPI网络图，获得显著互作关联的靶点网络初始框架(见图2)。为深度解析网络功能枢纽，将STRING原始数据导入Cytoscape生物网络分析平台(v3.8.0)，经可视化调试，共包含100个有效节点与326条互作边的PPI骨干网络(见图3(a))。采用Cytoscape的CytoNCA插件运算出拓扑参数的筛选阈值：Betweenness > 13.646、Closeness > 0.549、Degree > 8、Eigenvector > 0.164、LAC > 3.750、Network > 4.910 (见表3)，筛选得到9个核心靶点，所示节点尺寸、色深与度值呈正比。按Degree值从高到低排序分别是IL6、TNF、STAT3、JUN、TP53、MAPK1、IL1B、AKT1及IFNG (见图3(b))。
3.4. 成分–靶点–疾病交互网络
使用Cytoscape构建“药物–活性成分–交集靶点–疾病”多层网络(见图4)，共有288个节点、1494条互作边。图中红色六边形是为药物，椭圆形为活性成分，黄色菱形为药物共同含有的活性成分，绿色
Table 3. Threshold criteria of topological parameters for core target screening
表3. 核心靶点筛选拓扑参数阈值标准
name |
Betweenness |
Closeness |
Degree |
Eigenvector |
LAC |
Network |
IL6 |
91.34244579 |
0.7 |
16 |
0.304407567 |
5.875 |
11.71942502 |
TNF |
112.7909501 |
0.7 |
16 |
0.286435843 |
5.375 |
11.83614164 |
STAT3 |
57.35845788 |
0.682926829 |
15 |
0.315187454 |
6.4 |
10.79424187 |
JUN |
55.60573838 |
0.651162791 |
14 |
0.302107602 |
6 |
9.192196692 |
TP53 |
40.88685481 |
0.595744681 |
13 |
0.23860009 |
5.230769231 |
8.620093795 |
MAPK1 |
42.34283576 |
0.622222222 |
12 |
0.234300658 |
5.333333333 |
8.330699856 |
IL1B |
24.64928454 |
0.608695652 |
12 |
0.239983305 |
5.833333333 |
9.050721501 |
AKT1 |
18.67207041 |
0.608695652 |
10 |
0.212654233 |
5 |
6.277777778 |
IFNG |
22.82684815 |
0.583333333 |
10 |
0.199878067 |
5 |
7.178571429 |
Figure 2. Interaction network of shared targets between the nephritis formula and glomerulonephritis
图2. 肾炎方–肾小球肾炎交集靶点互作谱
(a) 拓扑重构PPI功能枢纽网络
(b) 肾炎方核心靶点调控子网络
Figure 3. PPI network analysis of the therapeutic targets of the nephritis formula
图3. 肾炎方治疗靶点PPI网络分析图
长方形为交集靶点。通过Degree值筛选发现，网络图中164个活性成分有41个(25%)连接 ≥ 10个靶点，其中排名前10位的是槲皮素、黄酮素、山奈酚、迷迭香酸、咖啡酸、柚皮素、丹酚酸A、丹参酮IIA、丹酚酸D、异黄酮苷、紫草酸。
注：红色六边形代表药物，椭圆形代表各药物活性成分，黄色的菱形代表共有活性成分，绿色长方形代表交集靶点，墨绿色倒三角代表疾病。
Figure 4. Drug-active ingredient-intersection target-disease network diagram
图4. 药物–活性成分–交集靶点–疾病网络图
3.5. 核心靶点的生物功能与通路富集分析
将118个交集靶点进行GO功能富集分析以及KEGG通路富集分析。GO功能富集分析获得显著富集2523个条目(P < 0.05)，其中生物过程(BP)有2297个，细胞组成(CC)有83个，分子功能(MF)有143个，并对排名前10位的富集功能进行可视化分析(见图5(a))。靶点显著富集于细菌分子应答、脂多糖应激、缺氧/低氧反应、氧化应激及炎症调控等免疫相关生物过程，主要定位于质膜外侧、膜筏微域及囊泡腔室等区域，并具备细胞因子受体结合、蛋白酶/整合素结合及丝氨酸肽酶活性等关键分子功能。KEGG通路富集分析共获得188条通路(P < 0.05)，排名前30条的通路，靶点显著富集于晚期糖基化终产物–受体(AGE-RAGE)信号通路、脂质与动脉粥样硬化通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、白细胞介素-17 (IL-17)信号通路、缺氧诱导因子-1 (HIF-1)信号通路、Toll样受体信号通路、Th17细胞分化通路、PI3K-Akt信号通路、NF-κB信号通路、C型凝集素受体信号通路、病毒性肝炎通路、胞外基质重构通路及代谢性肝病通路等(见图5(b))。
3.6. 关键成分与核心靶点分子对接验证
将4个核心成分(槲皮素、山奈酚、木犀草素、二氢丹参酮I)依次与STAT3、SRC、JUN、TP53进行半柔性对接。AutoDock Vina计算显示，全部16组复合物的结合能均优于−6.0 kcal/mol，其中SRC口袋亲和力最高：二氢丹参酮I以−9.9 kcal/mol居首，其次为山奈酚(−8.7 kcal/mol)与木犀草素(−8.6 kcal/mol)。TP53配体方面，二氢丹参酮I同样给出最低能量(−8.6 kcal/mol)，而STAT3与JUN在各配体间差距较小，最优值分别为−8.1 kcal/mol与−6.0 kcal/mol。
(a) GO功能富集分析
(b) KEGG信号通路富集分析
Figure 5. GO and KEGG analysis diagram
图5. GO和KEGG分析图
结合模式分析(图6)表明，除二氢丹参酮I-TP53复合物外，其余前五对的相互作用均依赖1~5条氢键固定。槲皮素嵌入SRC活性位点后，分别通过ARG-159 (2.7Å)、PRO-364 (2.4Å)、PHE-523 (2.2Å)及GLU-520 (2.5Å与3.3Å)形成氢键网络，实现多点锚定。山奈酚依托MET-344主链，构建2.2Å与2.0Å双氢键作用模式；木犀草素进一步将MET-344氢键距离缩短至1.9Å，呈现高亲和力单点锚定特征。值得注意的是，二氢丹参酮I-P53的结合模式以疏水相互作用为主，未观察到经典氢键；配体与LYS-291、ALA-353、LYS-292及ASP-352的侧链/主链原子距离介于3.5~3.8Å，提示上述残基通过范德华力参与复合物稳定，“疏水锁”模式可替代氢键发挥稳定作用。
Table 3. Molecular docking binding energy (kcal/mol) of key active components with core target proteins
表3. 关键活性成分与核心靶点蛋白的分子对接结合能(kcal/mol)
|
槲皮素 |
山奈酚 |
木犀草素 |
二氢丹参酮I |
STAT3 |
−7.2 |
−7.5 |
−7.4 |
−8.1 |
SRC |
−8.4 |
−8.7 |
−8.6 |
−9.9 |
JUN |
−5.7 |
−5.8 |
−5.5 |
−6.0 |
TP53 |
−7.6 |
−7.6 |
−7.4 |
−8.6 |
Figure 6. Molecular docking diagram of key active components with disease targets
图6. 关键活性成分与疾病靶点分子对接图
4. 讨论
本研究结合网络药理学与分子对接方法，首次阐明肾炎方调控早期肾小球肾炎(GN)的作用机制。蛋白质互作网络筛选的10个核心靶点中，STAT3 (Degree = 20)与SRC (Degree = 18)构成关键信号节点，这些靶点与GN病理高度相关：SRC激酶在免疫复合物介导的肾损伤中特异性活化，可能通过磷酸化作用破坏足细胞骨架。尤其值得注意的是，紫丹参独特组分二氢丹参酮I对SRC激酶域的结合能力显著(结合能−9.9 kcal/mol)优于其他组合[12]。其构象嵌入SRC肽底物结合口袋，空间占位模式与临床抑制剂KX2-391具有相似特征，提示复方可能通过竞争性抑制阻断SRC信号传导[13]。同时STAT3作为炎症核心转录因子，其磷酸化水平与肾组织炎症浸润程度显著正相关，而来源于黄芪和甘草的槲皮素(Degree值最高)和玉米须的山奈酚分别通过氢键结合SRC的ARG-159 (2.7Å)/PRO-364 (2.4Å)/GLU-520 (3.3Å, 2.5Å)/PHE-523 (2.2Å)与Met-344 (2.2Å, 2.0Å)。这种多点锚定可能抑制SRC向STAT3的磷酸化传递，从而缓解炎症级联[14]。
KEGG分析显示AGE-RAGE信号通路与TNF通路富集显著，其核心调控靶点经PPI网络验证，STAT3和JUN作为关键枢纽同时参与两条通路；槲皮素通过靶向STAT3、JUN等关键基因，经实验证实抑制NF-κB核转位，协同山奈酚等成分发挥抗糖基化损伤核心功能，并与玉米须山奈酚通过SOD1/PON1缓解氧化应激的功能形成氧化–炎症协同[15]；此外，木犀草素抑制ICAM-1表达和二氢丹参酮I阻断MAPK磷酸化通过协同干预TNF/IL-17通路节点，实现抗炎–抗纤维化互补调控[16]。
研究存在三个值得注意的局限：① 紫丹参水溶性成分未检索到，可能遗漏关键靶点；② 核心因子TP53与二氢丹参酮I经由疏水作用连接，但该因子既有抗炎又有促纤维化功能，净效应需进行模型验证；③ 槲皮素在网络中的核心地位与其口服利用率波动(3%~17%)的矛盾点需关注。针对上述问题，后续建议重点推进：采用足细胞特异性SRC敲除动物模型(如Cre-loxP体系)，验证二氢丹参酮I的保护作用是否基于SRC通路，并采用微流控肾脏芯片动态监测复方组分对足细胞–内皮屏障的保护时效。最终解析表明，紫丹参与黄芪黄酮的配伍构成核心体系，通过抑制SRC/STAT3炎症主线和抑制AGE-RAGE代谢损伤支线共同作用，为复方“清热化瘀、健脾利湿”的传统功效提供了现代科学诠释[17]。
NOTES
*通讯作者。