摘要: 目的：利用网络药理学与分子对接技术探讨岑连口服液治疗病毒性呼吸道感染(VRTI)的主要活性成分、潜在作用靶点及机制。方法：本研究以网络药理学为基础，借助中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)及PubMed等数据资源，分析岑连口服液中潜在的有效成分及其相应靶标；接着，通过GeneCards数据库和OMIM数据库检索VRTI相关的疾病靶点，并确定成分与疾病之间的共同靶点集合；接着，利用STRING数据库搜集蛋白质相互作用信息，并应用Cytoscape3.8.0软件绘制蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络以及药物–成分–靶点关系图；再采用RStodio工具包进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集研究，以识别潜在的作用机制通路；最后，使用AutoDock软件对关键活性成分与核心靶点进行分子对接验证实验。结果：共筛选出岑连口服液141个活性成分、1900个成分靶点；VRTI相关的疾病靶点12491个，与岑连口服液的交集靶点共有243个；其中主要活性成分包括槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、木犀草素(luteolin)、汉黄芩素(wogonin)、异微凸剑叶莎醇(7-O-methylisomucronulatol)等，核心靶点包括肿瘤蛋白p53 (TP53)、JUN、雌激素受体1 (ESR1)、蛋白激酶B1 (AKT1)、热休克蛋白90α家族A类成员1 (HSP90AA1)、肿瘤坏死因子(TNF)等；涉及脂质与动脉粥样硬化(Lipid and atherosclerosis)、人类巨细胞病毒感染(Human cytomegalovirus infection)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)等通路；分子对接结果显示，5个主要活性成分与关键靶点均有不同程度的对接效果，其中槲皮素对接效果最好，以氢键结合为主。结论：岑连口服液通过多成分、多靶点、多通路协同作用介导对VRTI的治疗效应，体现中药整体调节的药理特征。
Abstract: Objective: To explore the main active ingredients, potential therapeutic targets, and mechanisms of Cenlian Oral Liquid in the treatment of Viral Respiratory Tract Infections (VRTI) using network pharmacology and molecular docking techniques. Methods: Based on network pharmacology, potentially effective components and their corresponding targets in Cenlian Oral Liquid were analyzed using data resources such as the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP) and PubMed. Subsequently, VRTI-related disease targets were retrieved from the GeneCards and OMIM databases, and the intersection targets between the components and the disease were identified. Protein-Protein Interaction (PPI) information was collected using the STRING database, and Cytoscape 3.8.0 software was used to construct PPI networks and drug–component–target relationship diagrams. The RStudio toolkit was employed for Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment analyses to identify potential mechanism-related pathways. Finally, AutoDock software was used to perform molecular docking validation between key active components and core targets. Results: A total of 141 active components and 1900 component targets were identified in Cenlian Oral Liquid, and 12,491 VRTI-related disease targets were retrieved, with 243 overlapping targets between the two. The main active components included quercetin, kaempferol, luteolin, wogonin, and 7-O-methylisomucronulatol. The core targets included Tumor Protein p53 (TP53), JUN, Estrogen Receptor 1 (ESR1), protein kinase B1 (AKT1), Heat Shock Protein 90α family class A member 1 (HSP90AA1), and Tumor Necrosis Factor (TNF). The enriched pathways included lipid and atherosclerosis, human cytomegalovirus infection, and the PI3K-Akt signaling pathway. Molecular docking results indicated that the five main active components exhibited varying degrees of binding affinity with the key targets, with quercetin showing the best docking effect, mainly through hydrogen bonding. Conclusion: Cenlian Oral Liquid exerts its therapeutic effect on VRTI through the synergistic action of multiple components, multiple targets, and multiple pathways, reflecting the holistic regulatory pharmacological characteristics of traditional Chinese medicine.
1. 引言
病毒性呼吸道感染(Viral Respiratory Tract Infection, VRTI)是由多种病毒引起的鼻腔、咽喉及肺部等呼吸道急性感染性疾病。ARIs引起患者的临床症状主要为发热(>37.5℃)伴咳嗽、咽喉痛、呼吸急促和(或)流鼻涕等[1]。
以网络药理学为代表的数据挖掘技术，依托多源数据库资源并结合统计学方法，可高效预筛中药的主要有效成分及其对应作用靶点。该技术通过构建药物–疾病–靶点–通路的复杂网络模型，系统呈现各要素间的相互作用关系，在中药复方活性成分、作用靶点及相关通路的预测研究中具有显著优势。本研究拟整合网络药理学与分子对接技术，系统揭示岑连口服液干预病毒性呼吸道感染(VRTI)的潜在作用机制及分子基础，为岑连口服液的临床合理应用及后续实验研究提供理论支撑[2]。
2. 资料与方法
2.1. 岑连口服液化学成分筛选及潜在靶点预测
基于TCMSP数据库，我们对金银花、黄芪、黄芩、板蓝根及连翘的主要活性组分与相应靶点进行了筛选。活性成分的筛选设定如下标准：其口服生物利用度(OB)不低于30%，且类药性(DL)大于等于0.18。为进一步分析，从该库中获取的蛋白质靶点均在UniProt数据库中进行了核查与规范，最终均校正为以Homosapiens为物种的标准基因名[3]。
2.2. 疾病靶点及交集靶点的获取
从GeneCards数据库中检索关键词“Viral Respiratory Tract Infection”，记录与该疾病相关的所有靶点。然后通过Jvenn在线工具对岑连口服液成分靶点与上述疾病靶点进行映射，绘制韦恩图来直观展示两者的交集靶点[4]。
2.3. 蛋白质–蛋白质互作网络构建(Protein-Proteininteractions, PPI)
将前述步骤获得的共同靶点导入STRING平台，将物种限定为“Homosapiens”，并将相互作用置信度的阈值设置为0.9，同时启用隐藏孤立节点功能，以此生成一个高置信度的蛋白质互作(PPI)网络。最终，将该网络数据以TSV文件格式导出，并后续在Cytoscape3.8.0中实现可视化呈现[5]。
2.4. “药物–成分–靶点”网络的构建
借助Cytoscape 3.8.0软件，构建相应的成分–靶点相互作用网络拓扑图，清晰呈现岑连口服液中活性成分与靶点间的关联，在此基础上，将活性成分和基因靶点分别按Degree值进行排序，选取Degree值排名前5的活性成分作为关键活性组分，以及Degree值位居前6的基因靶点作为核心靶点，进而推断它们在治疗VRTI中的关键作用[6]。
2.5. 基因本体(GO)功能及京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析
将前述获得的交集靶点提交至Metascape平台，在设定物种为“Homosapiens”的基础上，完成基因本体(GO)功能注释与KEGG通路富集分析。最终，各项富集结果均通过RStudio软件实现可视化[7]。
2.6. 活性成分与靶点的分子对接
基于分子对接方法，对筛选自PPI网络的6个核心靶点与5个活性成分间的结合亲和力进行验证。相关结构均从专业数据库获取。在对接前，使用Pymol对蛋白质进行了构象预处理，继而在AutoDock Vina中完成对接，其结合模式通过Pymol和Discovery Studio 2019实现可视化[8]。
3. 结果
3.1. 岑连口服液活性成分及其作用靶点
通过TCMSP数据库检索筛选，共得到岑连口服液141个中药活性成分，其中，板蓝根39个，黄芪20个，黄芩36个，金银花23个，连翘23个。同时检索活性成分相关的作用靶点，经去除重复并标准化后共得到1900个靶点[9]。
3.2. 疾病靶点及交集靶点的获取
自GeneCards数据库检索获得VRTI相关靶标共12491个。将其与岑连口服液的活性成分所对应靶点进行映射，并绘制韦恩图，最终筛选出243个共同作用靶点，这些被视为该口服液干预VRTI的潜在作用靶标[10]。
3.3. PPI网络及“药物–活性成分–靶点”网络
注：蓝色表示疾病基因，红色代表板蓝根成分，绿色代表黄芩成分，紫色代表连翘成分，深蓝色代表金银花成分，浅蓝色代表黄芪成分，多色代表共有成分。
Figure 1. Network diagram of the interaction between active ingredients and potential targets of Cenlian oral liquid
图1. 岑连口服液活性成分–潜在靶点相互作用关系网络图
将筛选得到的交集靶点导入STRING网络平台，采用Cytoscape 3.8.0进行可视化和拓扑学分析，构建PPI网络图，结果共涉及105个节点、1419条边。采用所有组方中药的活性成分及作用靶点绘制活性成分–靶点网络图，见图1 (右侧蓝色表示疾病基因，红色代表板蓝根成分，绿色代表黄芩成分，紫色代表连翘成分，深蓝色代表金银花成分，浅蓝色代表黄芪成分，右侧为靶点成分)。使用cytoHubba计算Degree值，其中Degree值较高的成分依次为槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、木犀草素(luteolin)、汉黄芩素(wogonin)、异微凸剑叶莎醇(7-O-methylisomucronulatol)。Degree值排名前6位的靶点基因为TNF (P01375)、JUN (P05412)、TP53 (P04637)、AKT1 (P31749)、HSP90AA1 (P07900)、ESR1 (P03372)，推测为岑连口服液治疗VRTI的关键成分和核心靶点[11]。
3.4. GO功能及KEGG通路富集分析
Figure 2. KEGG pathway enrichment analysis of potential target groups of Cenlian oral liquid in the treatment of VRTI
图2. 岑连口服液治疗VRTI潜在靶点群的KEGG通路富集分析
基于从Metascape获得的富集结果，对靶点进行了GO富集(包括BP、CC、MF)与KEGG通路分析。GO富集图中数据按P值由小至大的顺序呈现，选择居前10位的生物过程，采用RStudio绘制气泡图。结果显示，BP主要与对异种生物刺激的反应(response to xenobiotic Stimulus)、对肽类激素的反应(response to peptide hormone)、对细菌来源分子的反应(response to molecule of bacterial origin)等生物过程密切相关[12]。CC主要包括膜筏(membraneraft)、膜微区(membrane microdomain)、突触膜(synaptic membrane)、突触后膜(postsynaptic membrane)、囊泡(vesicle lumen)等部位。MF主要涉及DNA结合转录因子结合(DNA-binding transcription factor binding)、RNA聚合酶II特异性(RNA polymerase II-specific)、DNA结合转录因子结合(DNA-binding transcription factor binding)等[13]。KEGG通路富集分析结果显示，脂质与动脉粥样硬化(Lipid and atherosclerosis)、人类巨细胞病毒感染(Human cytomegalovirus infection)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)等与VRTI相关性较强，可能作为岑连口服液干预治疗VRTI的重要通路，按照P值从小到大进行排序，筛选出高度相关的前30条通路，绘制气泡图，详见图2。
3.5. 分子对接验证
选取排名前6位的核心靶点TNF (P01375)、JUN (P05412)、TP53 (P04637)、AKT1 (P31749)、HSP90AA1 (P07900)、ESR1 (P03372)作为小分子配体，分别与活性成分槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、木犀草素(luteolin)、汉黄芩素(wogonin)、异微凸剑叶莎醇(7-O-methyl isomucronulatol)进行分子对接，若结合自由能<−4.5 kcal/mol (−18.83 kJ/mol)，表明小分子配体与受体蛋白有结合可能性，结合自由能越小，代表结合能力越强。5个主要活性成分与关键靶点均有不同程度的对接效果，见图3。其中，槲皮素与HSP90AA1的结合能为−9.469 kcal/mol (−39.61kJ/mol)，对接效果最好，将其进行可视化处理，见图4，可以看出结合以氢键为主[14]。
注：结合能越低，颜色越深，亲和力越强。
Figure 3. Thermogram of docking binding energy of-VRTI target molecule, the main active ingredient of Cenlian oral liquid
图3. 岑连口服液主要活性成分-VRTI靶点分子对接结合能热图
Figure 4. Molecular docking binding pattern of HSP 90AA1 target protein and quercetin
图4. HSP90AA1靶蛋白与槲皮素的分子对接结合模式
4. 讨论
本研究以网络药理学为基础，通过成分-靶点相互作用关系图，分析出岑连口服液用于VRTI治疗的核心药效成分，主要是槲皮素、山柰酚、木犀草素、汉黄芩素以及异微凸剑叶莎醇。再经过分子对接验证以证明上述成分均能与关键靶标稳定结合的可靠性[15]。
本研究识别出岑连口服液与VRTI交互作用中的关键靶点蛋白，包括TP53、JUN、ESR1、AKT1及HSP90AA1。TP53作为重要抑癌基因，在病毒侵袭时被迅速动员，通过介导细胞周期停滞、程序性死亡或衰老以遏制病毒扩增，然而其过度活化也可能引起气道黏膜细胞大量凋亡，从而加重组织破坏[16]。JUN是转录因子AP-1的核心组成，广泛参与细胞增殖、分化及死亡过程，病毒感染后其活性迅速上调，进而推动多种炎症因子转录，成为炎症级联反应的重要枢纽。ESR1除参与生殖生理外，亦在免疫调节中发挥作用，可通过非基因组机制快速抑制NF-κB转录活性，实现对炎症反应的负向调控，这或许部分解释了呼吸道病毒感染易感性及预后存在的性别差异[17]。AKT1作为PI3K/AKT通路的关键激酶，其磷酸化可促进细胞存活并抑制凋亡，同时在病毒触发的干扰素产生及先天免疫中发挥复杂作用，适度调控AKT1有助于维持免疫稳态，防止炎症过度[18]。HSP90AA1作为分子伴侣，对多种病毒复制所依赖的宿主因子及病毒蛋白的折叠与稳态至关重要，抑制其功能可使这些客户蛋白失稳，进而有效抑制多种呼吸道病原体的繁殖[19]。
综上，我们通过结合网络药理学与分子对接方法，初步证明了岑连口服液通过多种活性成分协同调控核心靶点等，进而对病毒复制、炎症反应、细胞凋亡及免疫调节等多条信号途径的影响作用，从而发挥对VRTI治疗作用的潜在机制[20]。凸显了中药复方多组分、多靶标、多通路整合作用的特点，为岑连口服液的后续药理学探索与临床推广提供了理论支撑[21]。
5. 展望与实验验证建议
为验证本研究网络药理学预测结果的可靠性，建议后续开展体外细胞实验进行功能验证。具体设计如下：构建病毒感染的细胞模型(如流感病毒A/PR/8/34或呼吸道合胞病毒(RSV)感染人肺上皮细胞A549)，给予不同浓度的岑连口服液或其含药血清处理[22]。通过CCK-8法检测细胞活力，评估药物对病毒所致细胞病变的保护作用。进一步利用蛋白质免疫印迹(Western Blot)或实时定量PCR (qPCR)技术，检测核心靶点(如AKT1，TP53，JUN)的表达水平及其磷酸化状态，以及相关通路关键蛋白(如PI3K，p-AKT，NF-κB p65)的变化，从而在实验层面证实岑连口服液通过调控这些靶点与通路发挥抗病毒与抗炎作用的预测机制。