广州市某水产市场水产品药物残留筛查

Screening of Drug Residues of Aquatic Products in Guangzhou

摘要: 应用建立的QuEChERS样品前处理，四级杆–飞行时间质谱筛查，三重四极杆串联质谱确证的方法，对广州市某大型水产市场的42种52个水产样品进行了7类59种药物残留的筛查。结果表明，被抽查的样品中，有5类12种药物被检出，阳性检出率为50.0%，不合格率为38.5%，其中黄鳝样品检出恩诺沙星2229 μg•kg−1、甲氧苄啶228 μg•kg−1，桂花鱼检出隐性孔雀石绿400 μg•kg−1，宝石斑鱼检出氢化可的松45.3 μg•kg−1，花斑鱼检出醋酸氢化可的松22.3 μg•kg−1，白贝检出土霉素21.8 μg•kg−1。在一定范围内反映了广州水产品安全方面的有用信息。

Abstract: Based on the method that samples were pretreated by QuEChERS sample preparation, then screened with quadrupole tandem time-of-flight mass spectrometry, and confirmed using triple quadrupole mass spectrometry, an investigation of veterinary residues related to 59 compounds was carried out to 52 aquatic products from Guangzhou aquaculture market. The stastics indicated that the positive samples accounted for 12 kinds from 5 species, and the positive rate was 50.0%, while 38.5% samples within these exceeded the range of the national standard, agricultural standards or trade standards. The detective content of several remarkable positive samples was given as follows: 2229 μg•kg−1 for enrofloxacin and 228 μg•kg−1 for trimethoprim in mud eel, 400 μg•kg−1 for leucomalachit green in Chinese perch, 45.3 μg•kg−1 for hydrocortisone in jade perch, 22.3 μg•kg−1 for hydrocortisone acetate in Epinephelus maculates, and 21.8 μg•kg−1 for oxytetra-cycline in Monetaria moneta (Linnaeus). This survey gave us some useful information about aquatic products security of Guangzhou in some way.

1. 引言

为了保障食用的水产品的安全，各国对水产品的药物残留都制定了相应的标准。国际食品法典委员会(CAC)CAC/MRL 2-2011 [1] 兽药残留项规定达到36种，欧盟(EC)No.37/2010 [2] 最高残留限量做出规定的药物达到635种、禁用药物10种，美国食品药品监督管理局(FDA)和联邦法规(CFR)第21卷《食品药品化妆品法》 [3] 对兽药残留项的规定在2011年达到94种，日本的肯定列表[4] 对兽药残留项达到111种。中国农业部235号公告[5] 是国内目前对动物源产品的兽药残留做出规定的最全面的法律文件，涉及水产品中最高残留限量的有19种，禁用药31种。日本和欧盟制定的标准更为严格，也是中国水产品重要的出口贸易国，这对中国是很大的挑战。

尽管国内外对水产品中的药物残留限量做了严格的规定，但水产养殖业中仍存在违规使用各种药物的问题。近年来的报道显示，水产品中药物残留问题依然严峻。

我们在前期研究工作[6] 中建立了四级杆飞行时间串联质谱(Q-TOF MS)高通量筛查鱼肉中的药物残留，用液相色谱–三重四级杆串联质谱(LC-QqQ MS)确证阳性样品的方法。本文应用该方法，以广州某大型水产市场的常见的42种水产品为样本，筛查了7类59种药物，对阳性样品进行确证，发现这些水产品的阳性检出率为50.0%，超出国家标准、行业标准或进出口标准的不合格样品达到38.5%。

2. 材料与方法

2.1. 试验仪器与试剂

Agilent 6540B LC/Q-TOFMS 四级杆飞行时间液相色谱质谱仪(美国安捷伦公司)；Agilent 1200 SL Series RRLC/6410B Triple Quad MS快速高效液相色谱/串联四极杆质谱联用仪(美国安捷伦公司)；TDZ5-WS离心机(湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司)；DC12H 水浴式氮吹仪(上海安谱科学仪器有限公司)；XW-80A快速混匀器(海门市麒麟医用仪器厂)。

59种标准品：孕激素类：孕酮，17α-羟孕酮，甲羟孕酮，醋酸氯地孕酮，醋酸甲地孕酮，醋酸甲羟孕酮；雄激素类：睾酮，甲基睾酮，诺龙，丙酸睾酮，苯丙酸诺龙；糖皮质激素类：可的松，醋酸氟轻松，地塞米松，醋酸地塞米松，氢化可的松，醋酸可的松，泼尼松，氢化泼尼松，醋酸氢化可的松，纯度均大于96.8%，购于德国Dr. Ehrenstorfer公司和美国Sigma Aldrich公司。四环素、土霉素、金霉素、强力霉素购于中国药品生物制品检定所；依诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、洛美沙星、丹诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星、司帕沙星、磺胺醋酰、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲异恶唑、磺胺嘧啶、磺胺甲基异恶唑、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺吡啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺苯吡唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺地索辛、磺胺索嘧啶、磺胺喹沙啉、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺脒、磺胺间甲氧嘧啶、甲氧苄氨嘧啶、孔雀石绿、隐性孔雀石绿、结晶紫、隐性结晶紫，购于德国Dr. Ehrenstorfer公司。

甲醇、乙腈(色谱纯，德国Merck 公司)、N-丙基乙二胺吸附剂(PSA)、十八烷基键合硅胶吸附剂(C18)(美国Agela科技公司)、无水硫酸镁(分析纯，上海阿拉丁试剂)、柠檬酸(C₆H₈O₇·H₂O)、乙二胺四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)、Na₂HPO₄·12H₂O、氯化钠、氢氧化钠(分析纯，广州化学试剂厂)、甲酸、乙酸铵(色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司)、实验用水为自制双蒸水。

0.1 mol/L Na₂EDTA-Mcllvaine缓冲溶液：称取2.1 g的柠檬酸用水定容成100 mL，此浓度为0.1 molžL⁻¹；称取2.84 g磷酸氢二钠定容到100 mL，此浓度为0.2 molžL⁻¹；将62.5 mL的0.2 molžL⁻¹的磷酸氢二钠溶液与100 mL的新配制的柠檬酸溶液混合，用NaOH调节pH为4，再加入6.05 g的乙二胺四乙酸二钠，摇匀。

2.2. 标准溶液的配制

准确称量0.005 g的标准样品，用甲醇溶解，配制成质量浓度为500 mgžL⁻¹的储备液，置于−18℃的冰箱中，临用时取出，待其恢复至室温时，再稀释成工作液。

2.3. 样品的前处理

2.3.1. 样品信息

将从广州某大型水产批发市场购买的42种52个水产品列表整理如表1，采样时间为2014年10月28日。

2.3.2. 提取

称取2 g样品于50 mL聚四氟乙烯离心管，加入提取试剂5 mL Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液，涡旋2 min匀质，然后加入15 mL乙腈；涡旋提取2 min，加入盐析试剂(4 g无水MgSO₄和1 g NaCl)，迅速混匀放入冷水中，使其冷却。

2.3.3. 净化

取上清液8 mL于15 mL离心管中，加入净化试剂(200 mg无水MgSO₄，100 mg PSA，50 mg C18)，快速涡旋2 min，4000 ržmin⁻¹离心5 min，取上清液于N₂下吹干，然后以1 mL 10 mmolžL⁻¹的乙酸铵−30%乙腈复溶，超声30 s，过0.22 μm有机滤膜，待上机分析。

2.4. Q-TOF MS筛查条件

电喷雾离子源(ESI)；正离子扫描模式；全扫描方式，扫描范围m/z 150~550；干燥气温度：325℃；干燥气流速：8 Lžmin⁻¹；雾化气压力：275.8 kPa；鞘气温度：400℃；鞘气流速：11 Lžmin⁻¹。

Table 1. 42 aquatic products

表1. 42种水产品

a，b为分别购自不同的鱼档。

流动相A：0.1%甲酸-10 mmolžL⁻¹乙酸铵，流动相B：0.1%甲酸–乙腈；毛细管电压：4000 V；喷嘴

电压：1000 V；碎裂电压：120 V；锥孔电压：65 V；进样量20 μL。

2.5. LC-QqQ MS确证条件

2.5.1. 激素类药物的测定条件 [7]

色谱条件：ZORBAX Extend-C18色谱柱(100 mm × 2.1 mm, 3.5 μm)；柱温：30℃；流速：0.3 mLžmin⁻¹；进样量：5 μL；流动相：A为水，B为乙腈；梯度洗脱程序：0~3 min，30%~53% B；3~4 min，53%~57% B；4~6 min，57%~62% B；6~6.01 min，62%~90% B；6.01~7 min，90%~95% B；7~7.1 min，95%~30% B，保持3 min。

质谱条件：电喷雾离子源(ESI)；正离子扫描模式：多反应监测(MRM)采集方式；干燥气温度：350℃；干燥气流速：10.0 Lžmin⁻¹；雾化气压力：275. 8 kPa (40.0 psi)；毛细管电压：5000 V；分辨率：MS1，MS2均为unit。

2.5.2. 磺胺类、喹诺酮类、四环素类及三苯甲烷类药物的测定条件 [8]

色谱条件：BDS Hypersil C8色谱柱(100 mm × 2.1 mm, 2.4 μm)；柱温：30℃；流速：0.3 mLžmin⁻¹；进样量：5 μL；流动相：A为0.4% (V/V)甲酸 + 10 mmolžL⁻¹乙酸铵溶液，B为0.4%(V/V)甲酸–乙腈；梯度洗脱程序：0~10 min，10%~80% B；10~11 min，80%~100% B；11~13 min，100% B；13~13.1 min，100%~10% B；13.1~16 min，10% B。

质谱条件：电喷雾离子源( ESI)；正离子扫描模式；动态多反应监测采集方式；干燥气温度：350℃；干燥气流量：10.0 Lžmin⁻¹；雾化气压力：276 kPa；毛细管电压：4 kV；MS1及MS2均为unit。

3. 结果与讨论

3.1. 总体检出情况

对52个水产样品按照2.3部分处理，用Q-TOF MS筛查，然后将阳性样品按照文献[7] [8] 经QqQ MS确认。结果表明，阴性样品有26个，占全部样品的50%。阳性样品的检测结果见表2，阳性样品检出率按式(1)计算，经计算全部样品的阳性率为50.0%；不合格样品按式(2)计算，有38.5%超出国家标准或进出口行业标准规定的MRL，全部合格样品占61.5%。图1是阳性的禾顺鱼的TOF的质谱图和QqQ的多反应监测(MRM)图。

对不合格样品的判定依据，首先以中国农业部235号公告[5] 的规定为准，其次参照国家标准检测方法(GB/T)、农业部标准或公告、进出口行业标准(SN/T)的规定进行判断。农业部235号公告对兽药残留的规定有4种情况：1) 允许动物源食品使用，不需要规定最高残留限量(MRL)；2) 允许动物源食品使用，但需要制定MRL；3) 允许动物源食品使用，但不允许检出；4) 禁止动物源食品使用。氢化可的松属于

(a)(b)

Figure 1. (a) Mass spectra of Erythroculter ilishaeformis by TOF mass spectrometry; (b) MRM chromatogram of Erythroculter ilishaeformis by QqQ mass spectrometry

图1. (a)禾顺鱼的TOF MS图；(b) 禾顺鱼的QqQ MRM图

Table 2. Detection results of positive aquatic products

表2. 水产品阳性样品的检测结果(单位：μgžkg⁻¹)

注：“-”表示未检出。

第一种，但是仅作外用；倍他米松、地塞米松、丹氟沙星、恩诺沙星、双氟沙星、土霉素、金霉素、四环素、强力霉素、磺胺二甲嘧啶、甲氧苄啶为规定最高残留限量的药物，属于第二种情况；苯丙酸诺龙、丙酸睾酮允许做治疗使用，但不允许检出，为第三种情况；氯霉素、己烯雌酚、醋酸甲孕酮、孔雀石绿、甲基睾丸酮、群勃龙禁止使用，不得检出，为第四种情况。

Table 3. Drug category distribution and unqualified rate of positive samples

表3. 阳性样品中检出的药物类别分布及不合格率情况

^a沙拉沙星；^b恩诺沙星、丹氟沙星；^c双氟沙星；^d甲氧苄啶。

阳性样品中检出的药物类别分布及不合格率总体情况见表3。在筛查的7类59种药物中，有2类药

物未检出，未检出药物数为47种；检出药物有12种，占全部检出药物的20.3%。5类检出的药物中，检出种数最多的是喹诺酮类药物，有5种药物被检出；检出种数最少的是四环素类，有1种药物被检出。而且，在5类药物中，喹诺酮类药物仍然是阳性样品个数最多的，有14个样品；磺胺类药物是检出个数最少的类别，有3个样品。5类药物中，不合格率最高的是糖皮质激素和喹诺酮类；四环素是检出的药物中不合格率最低的(0)。

(1)

(2)

3.2. 不同类别药物的检出情况

在筛查的7类59种药物中，有两类药物未见检出：孕激素和雄激素类药物。在检出的5类药物中，喹诺酮类药物的阳性检出率最高，其次为糖皮质激素和三苯甲烷类的药物，四环素和磺胺类药物的阳性率居后；不合格样品的统计情况是，糖皮质激素类和三苯甲烷类药物的不合格率最高，其次为喹诺酮类药物，磺胺类药物不合格率较低，四环素类全部合格。在检出的12种药物中，有3种药物的检出的样品个数占到全部阳性样品的84.6%，它们是：恩诺沙星有13个样品，氢化可的松和结晶紫各有8个样品。

糖皮质激素药物检出的是氢化可的松和醋酸氢化可的松。氢化可的松是该类药物中阳性样品数最高药物，检出8个样品，含量范围是7.7~45.3 μgžkg⁻¹，阳性率为15.4%，最高检出含量是宝石斑鱼，检出氢化可的松为45.3 μgžkg⁻¹。醋酸氢化可的松只有1个样品花斑鱼检出，含量为22.3 μgžkg⁻¹，阳性率为1.9%。比235号公告的0.75 μgžkg⁻¹的MRL高，属于不合格样品，不合格率为17.3%。

喹诺酮类药物检出5种药物，分别是沙拉沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星。恩诺沙星是该类药物中阳性样品数最高药物，检出13个样品，含量为6.1~2229 μgžkg⁻¹，阳性率为25.0%，含量特别高的几个样品是：黄鳝的含量为2229 μgžkg⁻¹，超过限量值21倍，白鳝-2含量为229 μgžkg⁻¹，鲈鱼-2的含量为140 μgžkg⁻¹，黄骨鱼-2含量为138 μgžkg⁻¹。环丙沙星检出4个样品，含量范围为4.7~495 μgžkg⁻¹，阳性率为7.7%，最高检出是黄鳝，含量为495 μgžkg⁻¹。诺氟沙星检出3个样品，含量为3.5~5.1 μgžkg⁻¹，阳性率为5.8%。沙拉沙星检出1个钳鱼样品，含量为29 μgžkg⁻¹，阳性率为1.9%。氧氟沙星检出1个黄鳝样品，含量为4.2 μgžkg⁻¹，阳性率为1.9%。农业部235号公告规定沙拉沙星的MRL为30 μgžkg⁻¹，丹氟沙星、恩诺沙星的MRL为100 μgžkg⁻¹，双氟沙星的MRL为300 μgžkg⁻¹。不合格的样品是黄骨鱼-2，白鳝-2，鲈鱼-2，黄鳝(有两个不合格项恩诺沙星和环丙沙星)，据此判定喹诺酮的总体不合格率为7.7%。

三苯甲烷类检出2种药物，即隐性孔雀石绿和结晶紫。结晶紫是该类药物中阳性样品数最高药物，检出8个样品，含量值0.5~7 μgžkg⁻¹，阳性率为15.4%。隐性孔雀石绿检出2个样品，黄骨鱼-2检出99 μgžkg⁻¹，超过限值197倍，桂花鱼400 μgžkg⁻¹，超过限值799倍，阳性率为3.8%。GB/T 19857-2005 [9] 液相色谱–串联质谱方法规定三苯甲烷类药物的检出限0.5 μgžkg⁻¹，有9个样品超出，235号公告三苯甲烷类为不得检出，不合格率为17.3%。

四环素类药物有1种药物检出。有4个样品检出土霉素，检出含量为5.0~21.8 μgžkg⁻¹，阳性率为7.7%。低于GB/T 21317-2007 [10] 的50 μgžkg⁻¹的检出下限，且235号公告对四环素类药物的MRL限定为100 μgžkg⁻¹，故全部合格。

磺胺类药物检出2种药物为磺胺嘧啶和甲氧苄啶。草鲩鱼-1检出磺胺嘧啶的含量3.1 μgžkg⁻¹，阳性率为1.9%。2个样品检出甲氧苄啶，分别是黄鳝228 μgžkg⁻¹、白鳝37.05 μgžkg⁻¹，阳性率为3.8%。GB/T 22951-2008 [11] 规定的磺胺类药物的检出限为5 μgžkg⁻¹，235号公告对磺胺类药物的动物源食品中的MRLs的限定为100 μgžkg⁻¹，而磺胺增效剂甲氧苄啶在鱼肉中的MRL为50 μgžkg⁻¹，故此判定磺胺类药物的不合格率为1.9%。

3.3. 从水产品的分类分析检出结果

淡水产品此次抽检26个样品共检出21个阳性样品，阳性率40.4%，不合格率为28.8%，海水水产品26个样品共检出5个阳性样品，阳性率9.6%，不合格率9.6%。淡水水产品的阳性率要高于海水水产品。淡水鱼中价格较高的如白鳝、鲈鱼和桂花鱼都有药物检出，特别是黄鳝居然有6项药物检出，还是比较触目惊心的。市民餐桌的常见海鲜白贝、濑尿虾则仅有1项或2项药物检出，没有超标。因此，淡水水产品的阳性和不合格率更为突出。

4. 结论

通过已经建立的Q-TOF MS高通量筛查QqQ MS确证的技术，对广州某水产市场的各类水产品涉及5类52种水产品进行了7类59种药物进行了残留筛查，本次调研有5类12种药物被检出，阳性率为50.0%，不合格率为38.5%。恩诺沙星、氢化可的松和结晶紫是被检出来样品数最多的药物。

应该说明的是，本次抽检结果只是针对广州某水产市场小范围内实施的一次药物残留筛查，其主要目的是对前期研究的应用，可以为评价水产市场的药物残留提供参考价值；如果要评价广州水产市场的整体情形则需要扩大样本范围。

基金项目

感谢广东省科技厅科技计划重点项目(2012A020100002)资助。