红水河草鱼线粒体D-Loop和Cyt b基因序列的对比分析

Comparison of Mitochondrial D-Loop and Cyt b Sequences of Ctenopharyngodon idellus

摘要: 研究了红水河野生草鱼Ctenopharyngodon idellus上游、中游和下游3个群体29个个体的线粒体控制区(D-loop)和细胞色素b (Cyt b)基因序列，通过PCR扩增与测序，分别获得了长度为846 bp和1083 bp的D-loop和Cyt b基因片段。分析表明，D-loop序列共定义了9个单倍型，存在10个多态位点，发生转换4次，插入/缺失6次。Cyt b序列共定义了9个单倍型，存在9个多态性位点，发生转换1次，插入/缺失8次。两序列分析结果表明，群体间和群体内遗传距离较小，遗传变异的分子变异等级不显著。上、中、下游均有共享单倍型，3个群体间遗传分化不大。

Abstract: Sequences of mitochondrial D-loop and Cyt b gene of 24 individuals of Ctenopharyngodon idellus which were sampled from three populations in Hongshui River were determined. Using PCR am-plification and sequencing, 846 bp of D-loop partial sequences and 1083 bp of Cyt b partial se-quences were obtained. In D-loop sequences, a total of 10 polymorphic sites were defined; 9 distinct haplotypes, 4 transitions, and 6 insert/lacuna loci were found. In Cyt b sequences, 9 polymorphic sites and 9 haplotypes were defined; 1 transition and 8 insert/lacuna loci were found. Two-sequence analysis showed that, within groups and between groups, the genetic distance is small, and the genetic variation of molecular variation level is not significant. Upper, middle and lower reaches are shared haplotypes, and the genetic differentiation among three populations is little.

1. 引言

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)属鲤形目鲤科雅罗鱼亚科草鱼属。广西俗称鲩鱼，体长而扁圆，背部茶黄色，腹部呈银白色，无须、眼较小，天然生长的最大个体可达50 kg以上，池塘养殖亦可达10~15 kg，主食水生和陆生植物，尤以禾本科植物为多，兼食昆虫等动物性食料，常游弋在水的中上层觅食。

线粒体DNA控制区(control region, CR)，又称D-环区(displacement loop region, D-loop)，是线粒体DNA中的一段非编码区，位于tRNA Pro和tRNA Phe基因之间，分为3个区段：终止序列区、中央保守区和保守序列区，是线粒体DNA序列和长度变异最大的区域，也是线粒体基因中进化最快的部分，适用于种群水平差异的检测和种间分析[1] 。细胞色素b基因(Cytochrome b gene, Cyt b)是线粒体DNA上的蛋白质编码基因，其进化速度适中，适于种群水平差异的检测和种内群体遗传分化程度标记[2] 。长江流域已开展的四大家鱼线粒体DNA研究较多，对不同江段的四大家鱼遗传多样性进行了对比分析，可见报道的有长江中下游四大家鱼线粒体DNA多样性的分析[3] ，长江中游汉江和湘江水系鲢和草鱼群体的mtDNA遗传变异对比分析[4] ，赣州江段四大家鱼遗传多样性分析等[5] 。本文作者在红水河流域选择3个被水利工程相互分隔的区域，对四大家鱼进行了遗传多样性状况和群体遗传结构调查，为红水河流域物种的多样性保护提供数据支持。在本文中主要论述草鱼的遗传多样性分析结果。

2. 材料与方法

2.1. 材料

采集3个草鱼群体共29条，分别为上游岩滩水库群体(shang)、中游百龙滩水库群体(zhong)和下游来宾市区江段群体(xia)，三个群体采样区域有大坝分隔，大坝无过鱼设施，可认为群体间无遗传交流。每尾个体取0.1 g背部肌肉新鲜样品，于无水乙醇中保存。

2.2. 测序方法

通过液氮研磨、裂解液裂解、有机溶剂抽提，使进入水相的蛋白质与核酸分层，在RNA酶的作用下，降解RNA，得纯度较高的DNA样品并进行PCR测序。D-loop [3] 和Cyt b [6] 引物序列同有关文献报道。反应总体积50 μL，其中10 × Taq Buffer 5 μL，Taq Polymer-ase 0.5 μL (5 U∙μL⁻¹)，dNTPs (2.5 mmol∙L⁻¹) 4 μL，Mg²⁺ (25 mmol∙L⁻¹) 2.5 μL，引物1和2 (10 umol∙L⁻¹)各μL，模板DNA 50 ng，无离子超纯水35.5 μL。经94℃预变性2 min后，再进行35个循环，每一循环包括：94℃ 45 s，58℃ 45 s，72℃ 1 min；最后72℃延伸7 min。每次PCR反应均设空白对照。扩增产物经1.5% TBE琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色，紫外灯光下检测、拍照。

2.3. 分析方法

测序获得序列经SeqMan II软件拼接并人工校对后，用CLUSTAL-X程序比对[7] ，DAMBE软件统计单倍型并作图，检测转换、颠换是否达饱和。单倍型多样性(Haplotype diversity, H)和核苷酸多样性(Nucleotide diversity, π)由ARLEQUIN统计软件计算[8] ，分化指数(F-statistics, F_st) [9] 计算使用ARLEQUIN，群体间的基因流由公式N_m = [(1/F_st) − 1]/2 [10] 计算得出，群体遗传变异的分子方差分析(AMOVA) [11] 在ARLEQUIN中完成。用MEGA4.1软件统计DNA序列的碱基组成[12] ，转换/颠换、插入/缺失位点数，单突变位点，简约信息位点；利用Kimura双参数模型计算个体间、群体内和群体间的遗传变异率；用NJ法进行聚类分析，构建聚类关系树。利用Network4610软件构建单倍型网络关系图。

3. 结果

3.1. D-Loop和Cyt b基因序列信息

由表1可见，在29个846 bp的D-loop基因序列中共检测出9个单倍型。检测到2个单突变位点，8个简约信息位点数；在10个突变位点中：转换位点4个，颠换位点0个，插入/缺失位点6个，转换高于颠换。基因片段中，A + T的含量(66.3%)明显高于C + G的含量(33.7%)。24个1083 bp的Cyt b基因序列中共检测出9个单倍型，检测到6个单突变位点，3个简约信息位点；在9个突变位点中：转换位点1个，颠换位点0个，插入/缺失位点8个，A + T的含量(58.2%)高于C + G的含量(41.8%)。对比分析可知：Cyt b单突变位点百分比为0.55%，大于D-loop的0.24%，而多态位点百分比和简约信息位点百分比分别为0.83%和0.28%，小于D-loop的1.18%和0.94%。

3.2. D-Loop和Cyt b基因序列的遗传变异分析

由表2可见，D-loop序列中，红水河3个草鱼群体内的遗传距离分别为0.0046、0.0050和0.0056。上游群体与中游群体间遗传距离为0.0042，上游群体与下游群体间遗传距离为0.0041，中游群体和下游群体间遗传距离为0.0040。Cytb基因序列中，群体内的遗传距离分别为0.0013、0.0020、0.0006。上游群体与中游群体间遗传距离为0.0015，上游群体与下游群体间遗传距离为0.0009，中游群体和下游群体间遗传距离为0.0012。群体间遗传距离和群体内遗传距离接近。D-loop序列得到的遗传距离高于Cytb基因序列得出的遗传距离。

3个群体的D-loop和Cyt b序列的单倍型多样性H、平均核苷酸变异数K、和核苷酸多样性π见表3，下游群体的Cyt b序列H值较低，k值和π值也低于其他群体的Cyt b序列分析结果。值得注意的是，上游采集到的样本较多，D-loop和Cyt b序列得到的单倍型数也相同，均为7个单倍型，而中游和下游样本较少，单倍型数则有所不同。

群体间的群体间的F_st和N_m值见表4，群体间的遗传变异的分子变异等级分析(AMOVA)见表5，从分析结果可见，3个群体间D-loop和Cyt b序列遗传差异不显著(F_st = −0.14867或−0.10346，p > 0.05)。

Table 1. Composition and variability of the analyzed mtDNA of C. idellus

表1. 草鱼线粒体D-loop及cyt b碱基组成及变异分析

Table 2. The intrapopulation, interpopulation and overall mean genetic distances of C. idellus in Hongshui River based on D-loop and Cyt b gene

表2. 红水河草鱼D-loop和Cyt b基因序列群体内和群体间遗传距离

注：上面的代表D-loop，下面的代表Cyt b (下同)。

Table 3. Indexes of genetic diversity in the 3 populations of C. idellus

表3. 3个草鱼群体相关遗传多样性指标

Table 4. Three population pairwise Fst and Nm values

表4. 3个草鱼群体间的F_st和N_m

Table 5. Analysis of molecular variance (AMOVA) of 3 populations

表5. 3个草鱼群体间的遗传变异的分子变异等级分析(AMOVA)

3.3. 分子系统树

以草鱼D-loop和Cyt b基因序列为外群，用NJ法构建分子系统树，其拓扑结构见图1。可见，3个群体的个体混杂在一起，群体间未表现出聚类关系。

4. 讨论

单倍型多样性(H)、平均核苷酸差异数(K)和核苷酸多样性(π)是反映物种遗传变异水平的3个重要参数，本文的分析结果表明红水河3草鱼个群体的遗传多样性差别不大，群体间遗传距离较小，遗传变异的分子变异等级分析结果为不显著。29个样本分属9个单倍型，上、中、下游均有共享单倍型，NJ系统树也显示3个群体并未聚集为独立的分支．由于线粒体DNA为母系遗传，一般不发生重组，表明3个群体间遗传分化不大。本文作者对红水河鲢群体进行的研究与此有相似之处，即总体上群体间遗传分化均较小，但也有一些不同之处，鲢群体内两序列遗传距离均表现为上游高于中游，中游高于下游，而草鱼的两序列遗传距离表现不同，D-loop序列遗传距离为下游最高，Cyt b序列则为下游最低。

红水河综合利用规划实施后，红水河流域形成了9个首尾衔接的梯级水库，流水生境绝大部分已经萎缩，天然河道和库区流水江段大为缩短，产漂流性卵的鱼类需要流速0.2 m/s以上，在库区已不具备形成自然种群条件，笔者在红水河上游龙滩坝下调查时，禁渔期前，也即3月底采集到的四大家鱼均已性成熟，但在6月采集到的四大家鱼则可发现卵因无法产出而退化的现象。近十年来，针对产漂流性卵鱼类资源下降的问题，各地政府大力开展了增殖放流活动，由于其他土著性鱼类人工繁育技术成熟度相对较低，苗种获得不易，四大家鱼的放流数量占了各地放流比例的90%以上。但在调查中，除上游采集野生四大家鱼较为容易，样本获得量相对较多外，中游和下游都很难采集到草鱼样本，鲢在中游尚可，下游同样难以采集样本，可见，野生群体的资源量仍然偏低。

本文调查的草鱼3个群体间遗传分化不大，可能有两种可能，第一种可能是水库建成时为三十年以内，原本连通的群体分隔后尚未产生显著遗传分化。第二种可能，则是各地增殖放流的草鱼来源接近，流域原有的群体因繁殖环境丧失，已经完全被放流群体取代。由于缺乏红水河流域梯级开发前，草鱼的遗传多样性分析数据，笔者所在的研究团队拟开展红水河流域草鱼捕捞群体和各地放流群体间的遗传多样性对比分析，以明确红水河草鱼遗传多样性特征的形成机理。

5. 总结

对红水河上游、中游和下游3个野生草鱼群体的29个个体的D-loop和Cyt b基因序列分析表明，D-loop序列和Cyt b序列均定义9个单倍型，D-loop序列存在10个多态位点，而Cyt b序列为9个。群体

Figure 1. The molecular phylogenetic tree of C. idellus in Hongshui River by NJ method based on D-loop (left) and Cyt b (right)

图1. 红水河3个草鱼群体D-loop (左)和Cyt b (右)基因序列的NJ分子系统树

间和群体内遗传距离较小，遗传变异的分子变异等级不显著。上、中、下游均有共享单倍型，3个群体间遗传分化不大。需进一步对草鱼放流群体的遗传多样性进行调查分析，以明确群体间遗传分化不大的具体原因。

基金项目

社会公益研究项目(CXIF-2014-006)；自治区直属公益性科研院所基本科研业务专项资金项目(编号：GXIF-2014-006)。