摘要:
玉米赤霉烯酮是镰刀霉毒素的代表，广泛存在于霉变的玉米、高粱、小麦、燕麦、大麦等谷物及其制品中。玉米赤霉烯酮污染食品和饲料后，将会带来严重的食品安全问题，威胁人类健康。近年来发展了很多分析检测玉米赤霉烯酮的方法，主要有薄层色谱法、(超)高效液相色谱法、高效液相色谱–质谱联用法、气相色谱法、毛细管电泳法、酶联免疫吸附测定法、胶体金免疫层析法和时间分辨荧光免疫分析法。本文概述了这些检测方法的特点及应用，并分析了现有检测方法存在的问题和挑战。
Abstract:
Zearalenone is the representative of fusarium, which widely presents in moldy corn, sorghum, wheat, oats, barley and their products. The food and feed contaminated by zearalenone will lead to serious food security issues and threat to human health. In recent years, several determination methods of zearalenone have been developed, mainly including thin layer chromatography, (ultra) high performance liquid chromatography, high performance liquid chromatography—coupled with mass spectrometry, gas chromatography, capillary electrophoresis, enzymatic linked immu-nosorbent assay, colloidal gold immune chromatography and time-resolved fluorescence immu-noassay. This article outlines the features and applications of these determination methods, and analyzes the problems and challenges of the existing determination methods of zearalenone.
1. 引言
玉米赤霉烯酮(Zearalenone, ZEN)是污染粮食最广泛的真菌毒素之一，在谷物及其制品中都可检测到ZEN的存在 [1] 。ZEN作为镰刀霉毒素的代表，不仅影响食物安全，而且通过食物链在人或动物体内富集，危害机体。ZEN不仅可直接污染谷类等作物，进而进入人或动物体内，还可通过被污染的肉、奶等动物性食品进入人体，危害人和动物的健康，造成巨大的经济损失。同时，ZEN本身具有分布广、繁殖快、耐热、代谢产物多、毒性大、残留时间长、难处理等问题，正在引起全世界的关注。各国都制定了谷物或谷物制品中玉米赤霉烯酮含量严格的限量标准，澳大利亚规定黑麦中不得超过0.06 mg/kg，意大利规定谷物和谷物产品中不得超过0.05 mg/kg，巴西规定玉米中不得超过0.2 mg/kg，法国规定谷物和食用油中不得超过0.02 mg/kg [2] ，罗马尼亚规定所有食品中不得超过0.02 mg/kg [3] ，我国规定人食用谷物中不得超过0.06 mg/kg [4] ，饲料中不得超过5 mg/kg [5] 。因此，对玉米赤霉烯酮的分析检测具有重要的意义。
文献报道的检测方法主要有理化法和免疫法，包括薄层色谱法[6] [7] 、(超)高效液相色谱法[8] -[15] 、高效液相色谱-联用质谱法[16] -[19] 、气相色谱法[20] [21] 、毛细管电泳法[22] 、酶联免疫吸附测定法[23] -[27] 、胶体金免疫层析法[28] -[31] 和时间分辨荧光免疫分析法[32] 。表1中汇总了以上主要检测方法的实例。本文将对以上检测方法进行简要叙述。
2. 玉米赤霉烯酮的理化性质和危害
2.1. 理化性质
玉米赤霉烯酮，又称F-2毒素，白色晶体，是1962年由Stob等首次从霉变的玉米中分离得到的，1966年Urry首次阐明其结构，为一种酚的二羟基苯甲酸的内酯结构，化学名称为6-(10-羟基-6-氧基-十一碳烯基)β-雷锁酸内酯，英文名称为Zearalenone或[S-(E)]-3,4,5,6,9,10-Hexahydro-14,16-dihydroxy-3- methyl-1H-2-benzoxacyclotetradecin-1,7(8H)-dione，分子式为C18H22O5，结构式如图1所示，其耐热性较强，110℃下处理1小时以上才能被完全破坏。由于玉米赤霉烯酮是一种内酯的结构，因此在碱性环境的条件下可以将酯键打开，当碱的浓度下降时酯键可恢复。其熔点为 164℃~165℃，闪点6℃，不溶于水、二硫化碳和四氧化碳，溶于碱性水溶液、乙醚、苯、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯和酸类，微溶于石油醚，在紫外光照射下其甲醇溶液呈现明亮的蓝绿色荧光。
2.2. 危害
玉米赤霉烯酮是由禾谷镰刀菌和其他镰刀菌产生的一种雌激素类真菌毒素，广泛存在于玉米、小麦、高粱等谷物及其制品中，具有很强的生殖发育毒性和致畸作用，导致家禽和牲畜的生长缓慢和免疫抑制等，并能够通过食物链进入人体，产生血液和免疫毒性，并且其具有致癌活性可导致肿瘤，对人类健康带来巨大危害[33] -[35] 。因此，开发有效快速的分析检测方法显得至关重要。
Figure 1. The chemical structure of zearalenone
图1. 玉米赤霉烯酮的化学结构式
Table 1. Determination methods of zearalenone in grain
表1. 谷物中玉米赤霉烯酮的检测方法
3. 谷物中玉米赤霉烯酮的检测方法
3.1. 薄层色谱法
薄层色谱法是最早建立的一种检测方法，特点是简便、成本低、对检测人员和仪器设备要求低，但是其灵敏度也较低，适合定性或半定量检测ZEN。原理是选择适合的提取溶剂对玉米赤霉烯酮等霉菌毒素进行提取，经过柱层析净化，在薄层板上层析展开、分离，利用霉菌毒素的荧光特性，根据荧光强弱与标准对比测定其含量。罗雪云等建立薄层色谱法于2005年被选作国标检测方法[6] 。样品用乙酸乙酯等提取，振荡2小时，然后用氢氧化钠液–液萃取净化，三氯甲烷–甲醇或甲苯–乙酸乙酯–甲酸为展开剂，其检出限可降低到50 ng/g左右。此方法中提取过程比较复杂耗时，但简化了之前薄层色谱法，不需要使用硅胶柱净化，并且灵敏度也比之前的薄层色谱法有所提高。
3.2. (超)高效液相色谱法
高效液相色谱法是国际上检测ZEN最常用的定量检测方法，原理是在合适的流动相条件下，采用固相萃取柱将霉菌毒素进行分离检测后，再通过测量色谱峰的面积计算含量。该方法的特点是灵敏度高、定量准确、结果稳定，但是所需仪器设备昂贵，不适合大批样品的筛选，为降低检出限和减少感染，通常需结合免疫亲和柱。免疫亲和柱–高效液相色谱法的检出限低，但是成本大大增加。免疫亲和柱净化原理是基于毒素与特异性抗体之间的相互作用，对ZEN具有高度专一的吸附特性。曾红燕等采用甲醇–水提取，C18小柱净化，反相高效液相色谱法测定了玉米、面粉、小麦样品中的玉米赤霉烯酮及其代谢物，该方法灵敏准确、稳定性好，对玉米赤霉烯酮的检出限为0.5 µg/kg [8] 。杨福江等报道的反相高效液相色谱法测定玉米和小麦中玉米赤霉烯酮含量，无需使用免疫亲和柱，降低了成本，并且检测效率并未降低，其最低检测限为3.0 µg/kg，低于大多数国家的限量标准，可以满足检测需要[9] [10] 。
超高效液相色谱法具有超高分离度、超快速度、超高灵敏度的特点，适用于微量快速分析。谢刚等人报道的利用超高效液相色谱法快速检测粮食中的玉米赤霉烯酮含量，其检出限为5 pg，从样品的前处理到分析整个过程小于45分钟，简便快速、灵敏度高、重现性好、溶剂用量少，适用于粮食中微量玉米赤霉烯酮的快速测定[11] 。
3.3. 高效液相色谱–质谱联用法
由于高效液相色谱–联用质谱法的检测灵敏度高、重现性好、准确可靠、定性定量兼顾和多组分同时检测等优点，近年来被广泛用于玉米赤霉烯酮等真菌毒素的检测。曾宪远等报道了用高效液相色谱–质谱联用法测定了包括玉米赤霉烯酮在内的五种真菌霉素[16] 。此工作中利用甲醇–水对样品进行提取，采用真菌毒素免疫亲和柱净化并采用电喷雾负离子和多反应监测模式进行检测，目标物在C18色谱柱上实现了有效分离，6分钟完成一个样品的分析，对玉米赤霉烯酮的检出限为0.5 µg/kg。采用高效液相色谱–质谱联用法的分析检测过程中涉及到高效液相色谱条件的优化和质谱条件的优化两个部分。徐飞等报道利用液相色谱–联用质谱法建立的粮食中玉米赤霉烯酮检测方法的检出限为0.08 µg/kg [17] 。
3.4. 气相色谱法
气相色谱法具有灵敏、高选择性、准确性和精确性等优点。但也存在如下问题：标准曲线线性关系不佳、样品进样的滞留、记忆效应以及基质干扰的存在。气相色谱法不及液相色谱法快速，检测费昂贵，技术和操作要求也高，所以在霉菌毒素检测方面的应用较少。陈必芳等将样品经甲醇–氯化钠水溶液提取，减压浓缩，提取液经弗罗里硅土层析柱净化和衍生化后，用气相色谱仪进行分析，最低检出限为50 ng [20] 。李楠等报道的气相色谱法检测ZEN的检出限为1.5 × 10−8 g [21] 。
3.5. 毛细管电泳法
毛细管电泳是一种新型的液相分离技术，与目前应用的高效液相色谱法相比，毛细管电泳法具有快速、灵敏、需样量少等优点，但由于毛细管的特性限制和检测技术上的难度，其稳定性和重现性有待于进一步提高。文献中关于用毛细管电泳法检测谷物中玉米赤霉烯酮含量的报道比较少。曾红燕等建立了粮食样品中玉米赤霉烯酮及其代谢物的毛细管电泳检测方法，他们将样品经过液–液超声提取，C18小柱净化后，利用胶束电动毛细管电泳进行测定，玉米赤霉烯酮的检出限为8.4 mg/mL [22] 。
3.6. 酶联免疫吸附测定法 (ELISA)
酶联免疫吸附测定法采用竞争ELISA原理，在酶标板微孔条上预包被二抗，样品中的毒素和该毒素的酶标抗原竞争抗体，同时抗体与二抗结合，经四甲基联苯胺底物显色，样本吸光值与其含有的毒素成负相关，与标准曲线比较再乘以稀释倍数，即得出样品中毒素的含量。酶联免疫吸附测定法具有准确、可靠、快速、灵敏度高和特异性好的特点，适合大批量样品的快速检测，无需昂贵的大型仪器设备。酶联免疫吸附测定试剂盒需在低于4 °C条件下保存，且保存时间通常为几个月，保存不当或超过保存期限将影响试剂盒的稳定性和检测结果。戚红卷等报道了利用酶联免疫吸附测定法检测米面中的真菌毒素(包括ZEN)，其最低检测限为41 µg/kg，并且检测速度快，标准曲线线性良好，检测结果准确性高[23] 。
3.7. 胶体金免疫层析法
胶体金免疫层析法是将免疫胶体金技术与层析技术结合起来建立的一种快速免疫学检测技术，具有操作简便、快速、无需复杂仪器、特异性强、稳定性较好、成本低、分析结果易于判定等特点，适用于大批样品的现场快速检测。玉米赤霉烯酮胶体金免疫层析试纸主要由底板、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫和吸水垫组成。利用膜的毛细效应，将特异性抗原(或抗体)固定于膜上作为检测带，胶体金标记物在玻璃纤维的结合释放垫上，其一端连接膜，一端连接样品垫，当加入样品后，样品通过扩散作用向前移动通过含标记物的玻璃纤维，与胶体金标记物反应，之后继续向前移动至检测线，这样标记物与待测物的反应产物就会被检测线捕获，呈现明显的可观测结果。Anna等报道的利用胶体金层析法在10分钟内有效检测出样品中的玉米赤霉烯酮，检出限为100 µg/kg [27] 。牟钧等利用胶体金免疫层析法对玉米和小麦中的玉米赤霉烯酮进行了快速测定，最低检出限为60 µg/kg，他们同时用酶联免疫吸附测定法进行对比，发现检测结果与酶联免疫法基本一致[28] 。
3.8. 时间分辨荧光免疫分析法
时间分辨荧光免疫分析属于超微量检测领域中一项新兴的检测技术。原理是以荧光强度高且衰变时间长的三价稀土离子为标志物来延缓测量时间，等样品中短寿命的自然荧光衰变后再测稀土离子的荧光，可消除自然荧光的干扰，可测范围可以达到0.01~100 μg/L，既可以满足低浓度的限量要求，也可以满足较宽范围的定量检测要求，是一种简便、快速、经济的可进行大批量样品筛查的方法。屠蔷等采用时间分辨荧光免疫分析法建立了高灵敏的ZEN间接竞争免疫分析法，以玉米赤霉烯酮人工抗原包被96孔板为固相抗原，与样品中的ZEN共同竞争有限的抗ZEN单抗，用稀土Eu3+离子标记羊抗鼠抗体进行失踪，该方法的灵敏度为0.01 μg/L [31] 。时间分辨荧光免疫分析法的灵敏度、可测范围和稳定性均好于现有的ELISA。
4. 结论与展望
综上所述，目前文献报道的谷物中玉米赤霉烯酮的定量分析检测方法各有利弊。常用的高效液相色谱法和高效液相色谱–质谱联用法灵敏度高、结果稳定，但是所需仪器设备昂贵，不适合大批样品的现场快速检测。基于免疫学的测定方法简便快捷、无需大型检测仪器和标准品，通常在数分钟内就能得到检测结果，适用于大批样品的现场快速检测，但灵敏度高和结果稳定性不如高效液相色谱法和高效液相色谱–质谱联用法，存在假阳性的情况，需要进一步的研究来完善此类方法。对于玉米赤霉烯酮等霉菌毒素的检测方法的发展趋势是绿色检测技术，现有的检测技术大多要以霉菌毒素标准品来建立标准曲线，对检测的安全带来了很大隐患，此外检测过程中的提纯和分离需要用到大量的有机溶剂，对环境污染很大。绿色检测技术的标准是高灵敏度、高特异性、绿色、经济和快速便捷。