1. 引言
心脑血管疾病严重影响着我国人民的健康水平，特别是中老年人群的健康，是目前一个重大社会医疗和健康问题。我国患有心脏病，中风，以及高血脂、高血糖和高血压的人群大约有2亿多人，心脑血管疾病的发病率和死亡率都远居榜首[1] 。探讨心脑血管疾病的发病机理，避免和减少心脑血管疾病的风险，预防和治疗心脑血管疾病，研发安全、有效的健康产品和药物，供广大人群应用，促进我国人民心脑血管健康水平是非常急迫的任务。
心脑血管是一个相互依赖的统一系统，如果血管出现问题，必然会影响心脏和脑，心脏出现问题，也必然影响血流和脑，同样，脑出现问题也必然影响心脏和血流。在这一系统中，血管是向心脏和脑乃至全身提供血液的连接器官，如果血管出现问题，就会影响向心脏和脑乃至全身血液供应，导致营养和氧气供应不足或者过量，进而产生一系列问题。而由三高(高血脂、高血压和高血糖)引起的冠状动脉粥样硬化是造成血管损伤的关键因素，产生冠状动脉粥样硬化的一个极为重要的因素是自由基氧化高血脂中的低密度脂蛋白造成的[2] 。
一氧化氮是内皮细胞松弛因子，在血压的调节和心血管的健康中发挥着重要作用。如果发生心肌缺血，血管就会增加一氧化氮产生，松弛血管，增加血流量，保证心肌的供血[3] 。但是，心肌缺血再灌注会同时产生氧自由基，一氧化氮就会与之反应生成过氧亚硝基，导致心肌细胞更严重的损伤。我们在研究利用天然抗氧化剂保护心肌和脑组织缺血再灌注损伤时，发现天然抗氧化剂可以清除缺血再灌注损伤时产生的氧自由基，调节和促进一氧化氮自由基产生，保护心肌和脑组织，防止缺血再灌注损伤[4] [5] 。而且，天然抗氧化剂可以降低氧化应激引起的血脂和血糖的升高[6] [7] 。经过试验，我们对一氧化氮和天然抗氧化剂进行了合理的搭配，形成了一个一氧化氮和天然抗氧化剂的合理搭配组合，并发现在细胞体系和动物组织体系中，该组合既可以产生一定量的一氧化氮，又可以清除氧自由基保护细胞和组织，防止氧化应激和缺血再灌注引起的损伤[8] 。
本文研究了这个一氧化氮和天然抗氧化剂合理的搭配组合对kkay小鼠血脂、血糖和大鼠血压的影响，发现这个搭配组合可能是通过清除氧自由基减少血管损伤和保护血管的。
2. 材料和方法
2.1. 材料
L-精氨酸，黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶、DMPO购自Sigma Chemical公司。山楂提取物、知母提取物和虾青素购自西安清乐生物科技有限公司。
2.2. 仪器
ESR波谱仪(Brucker 200 D-SRC德国)，无创血压仪BP98-RCP-S型(北京吉安得尔科技有限公司)，1920血糖仪(ARKRAY Factory, Shiga, Japan)。
2.3. 动物
2.3.1. 动物和喂养
8周龄kkay、C57BL/6J小鼠和雄性4周龄SD大鼠(体重180~200 g)购自维通利华公司(北京)。适应性喂养7天，一组喂食基础生长饲料，一组喂食高脂饲料(15%饱和脂肪酸，1%胆固醇，84%基础生长饲料)。各组动物饲养在清华大学动物房，SPF (无特异病原微生物)环境下，室温为20℃~26℃，湿度40%~70%，14/10小时的昼夜循环，自由饮食和饮水。
2.3.2. 高血脂和血糖模型的建立
利用kkay小鼠建立高血脂和高血糖模型，随机分为2组，一组喂食基础生长饲料，一组喂食高脂饲料。30天后称重，把喂食高脂饲料与喂食基础生长饲料体重有显著差异，作为判断肥胖模型的建立[6] [7] 。将确认的18只kkay小鼠肥胖随机分为：高脂饲料+双蒸水组；高脂饲料+一氧化氮和天然抗氧化剂搭配组合低剂量组(低剂量：2 mg/10 g/day)，高脂饲料+高剂量一氧化氮和天然抗氧化剂组(高剂量：8 mg/10 g/day)；同时将基础饲料喂养同龄C57BL/6J小鼠6只(基础饲料+双蒸水组)作为正常对照(对照组)，每日测量动物饮食重量和体重。给药一个月，用乌拉坦麻醉动物, 空腹取肝，称取肝脏重量，计算脏体比，取血，用于血脂和血糖测试。
2.4. 血脂四项的测定
动物血清血脂四项的检测按照文献的方法并稍微改进[7] ，用分光光度计法分析和定量样品甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白含量，实验由清华大学医院测定。
2.5. 血糖的测定
空腹血糖、随机血糖、餐后2小时血糖和糖耐量测定按照文献的方法并稍微改进[6] ，实验由清华大学医院测定，利用快速血糖仪京都1920血糖仪测定。
2.6. 高血压模型的建立和测定
SD大鼠(日龄体重大小均一)在喂食基础生长饲料适应环境7天后, 随机分为两组(期间大鼠测一次尾动脉收缩压，每个时点测3次，取平均值血压)。7~67天：一组8只喂食基础生长饲料，一组24只喂食高脂饲料。60天后测尾动脉收缩压，判断高血压模型的建立，标准为血压 > 120 mmHg。67~97天：高脂组随机分为3组，模型组和两个给药组(高剂量组400 mg/kg制剂、低剂量组100 mg/kg制剂)，每组8只，每笼2只，每天灌胃，第4、8、10、12周末时，在干燥、通风、安静的环境中，将大鼠置于恒温加热箱中预热10~15 min后，利用动物无创血压仪测试，取尾动脉收缩压。
2.7. 对超氧阴离子自由基的清除作用的测定
利用黄嘌呤(10 mmol/L)/黄嘌呤氧化酶(0.1 U/L)产生超氧阴离子自由基，将自旋捕捉剂DMPO (100 mmol/L)和不同浓度样品或蒸馏水，迅速混匀，吸入石英毛细管中，描记ESR波谱。ESR测试条件：X波段，微波功率20 mW，调制频率100 kHz，调幅0.1 mT，中心磁场324.5 mT，室温下检测[9] 。用波谱信号第一峰的峰对峰高度h (mm)表示自由基的相对浓度按下式计算清除率。
清除率(%) = [(样品峰高 − 对照峰高)/对照峰高)] × 100%
2.8. 对羟基自由基的清除作用的测定
利用Fenton反应产生羟基自由基，将DMPO捕捉剂，硫酸亚铁(25 mmol/L)、H2O2 (0.1%)和不同浓度的样品，迅速混匀，吸入石英毛细管中，反应1 min时描记ESR波谱。ESR测试条件、测量和计算清除率同上[9] 。
2.9. 统计分析
采用T检验，两两比较，数据结果以x ± SE表示，用t检验对数据进行分析，P < 0.05定义为有显著统计差异。
3. 结果
3.1. 一氧化氮和天然抗氧化剂搭配组合对体重、肝重和血脂四项的影响
血脂分析对于心血管病的危险评估和防治具有重要意义，除了测量体重和肝重外，我们对kkay小鼠进行了血脂四项的测试，结果如图1~图6所示。喂食高脂饲料导致易肥胖kkay小鼠体重显著增加，而灌胃一氧化氮和天然抗氧化剂搭配组合后可以显著减少由高脂饲料引起的kkay小鼠体重的增加(图1) (低剂量和高剂量分别减少9%和12.5%)，明显降低高脂引起的肝脏增生(图2) (肝脏系数低剂量和高剂量分别减少17.8%和20.2%)。一氧化氮和天然抗氧化剂搭配组合能明显降低总胆固醇含量(图3) (低剂量和高剂量分别减少11.0%和15.6%)，显著降低甘油三脂含量(图4) (低剂量和高剂量分别减少29.8%和35.5%)，还能显著降低低密度脂蛋白(图5) (低剂量和高剂量分别减少24.6%和25.4%)，但却升高高密度脂蛋白(图6) (低剂量和高剂量分别升高4.8%和18.9%)。这些结果表明这个搭配组合可以降低高脂食物喂养引起kkay小鼠血脂四项的升高。一氧化氮和天然抗氧化剂搭配组合对基础饲料喂养C57BL/6J小鼠的血脂四项没有明显影响。
Figure 1. Reduction effect of suitable formula of nitric oxide and natural antioxidants on body weight of kkay mouse fed with high lipid food. #p < 0.05 vs control, *p < 0.05 vs high lipid control
图1. 一氧化氮和天然抗氧化剂搭配组合对高脂食物诱导kkay小鼠体重升高有明显降低作用。#p < 0.05与对照组比较，*p < 0.05与高脂肪食物组比较
Figure 2. Reduction effect of suitable formula of nitric oxide and natural antioxidants on liver weight/body weight of kkay mouse fed with high lipid food. #p < 0.05 vs control, *p < 0.05 vs high lipid control
图2. 一氧化氮和天然抗氧化剂搭配组合对高脂食物诱导kkay小鼠脏脏系数升高有明显降低作用。#p < 0.05与对照组比较，*p < 0.05与高脂肪食物组比较
Figure 3. Reduction effect of suitable formula of nitric oxide and natural antioxidants on total cholesterol of kkay mouse fed with high lipid food. #p < 0.05 vs control, *p < 0.05 vs high lipid control
图3. 一氧化氮和天然抗氧化剂搭配组合对高脂食物诱导kkay小鼠总胆固醇水平升高的降低作用。#p < 0.05 与对照组比较，*p < 0.05与高脂肪食物组比较
Figure 4. Reduction effect of suitable formula of nitric oxide and natural antioxidants on triglyceride of kkay mouse fed with high lipid food. #p < 0.05 vs control, *p < 0.05 vs high lipid control
图4. 一氧化氮和天然抗氧化剂搭配组合对高脂食物诱导kkay小鼠甘油三酯水平升高的降低作用。#p < 0.05与对照组比较，*p < 0.05与高脂肪食物组比较
Figure 5. Reduction effect of suitable formula of nitric oxide and natural antioxidants on low density lipid proteins of kkay mouse fed with high lipid food. #p < 0.05 vs control, *p < 0.05 vs high lipid control
图5. 一氧化氮和天然抗氧化剂搭配组合对高脂食物诱导kkay小鼠低密度脂蛋白水平升高的降低作用。#p < 0.05与对照组比较，*p < 0.05与高脂肪食物组比较
Figure 6. Increase effect of suitable formula of nitric oxide and natural antioxidants on high density lipid proteins of kkay mouse fed with high lipid food. #p < 0.05 vs control, *p < 0.05 vs high lipid control
图6. 一氧化氮和天然抗氧化剂搭配组合对高脂食物诱导kkay小鼠高密度脂蛋白水平降低的升高作用。#p < 0.05与对照组比较，*p < 0.05与高脂肪食物组比较
3.2. 一氧化氮和天然抗氧化剂搭配组合降血糖影响
一氧化氮和天然抗氧化剂搭配组合对高脂饲料喂养诱导易患二型糖尿病kkay小鼠血糖的测试结果如图7~图9所示。由图可以看出，高脂饲料喂养诱导了易患二型糖尿病kkay小鼠血糖的显著大幅度升高，灌胃一氧化氮和天然抗氧化剂搭配组合后，可以显著降低kkay小鼠的空腹血糖(低剂量和高剂量分别降低36.2%和44.1%，图7)、随机血糖(低剂量和高剂量分别降低47.6%和56.7%，图8)、和餐后2-小时血糖(低剂量和高剂量分别降低33.1%和44.1%，图9)。糖耐量受损是2型糖尿病的前期必然阶段，测量结果还显示高脂诱导的kkay小鼠糖耐量受损，调节血糖的能力降低，指示胰岛素抵抗，而给予一氧化氮和天然抗氧化剂搭配组合后的kkay小鼠糖耐量受损明显减轻。一氧化氮和天然抗氧化剂的合理搭配对基础饲料喂养C57BL/6J小鼠的血糖没有明显影响。
3.3. 一氧化氮和天然抗氧化剂搭配组合的降血压影响
喂食一氧化氮和天然抗氧化剂搭配组合对血压作用的测试结果如图10所示。喂食高脂饲料，诱导了
Figure 7. Reduction effect of suitable formula of nitric oxide and natural antioxidants on fasting blood glucose of kkay mouse fed with high lipid food. #p < 0.05 vs control, *p < 0.05 vs high lipid control
图7. 一氧化氮和天然抗氧化剂搭配组合对高脂食物诱导kkay小鼠空腹血糖水平升高的降低作用。#p < 0.05与对照组比较，*p < 0.05与糖尿病组比较
Figure 8. Reduction effect of suitable formula of nitric oxide and natural antioxidants on random blood glucose of kkay mouse feed with high lipid food. #p < 0.05 vs control, *p < 0.05 vs high lipid control
图8. 一氧化氮和天然抗氧化剂搭配组合对高脂食物诱导kkay小鼠随机血糖水平升高的降低作用。#p < 0.05与对照组比较，*p < 0.05与糖尿病组比较
Figure 9. Reduction effect of suitable formula of nitric oxide and natural antioxidants on 2-hourblood glucose of kkay mouse fed with high lipid food. #p < 0.05 vs control, *p < 0.05 vs high lipid control
图9. 一氧化氮和天然抗氧化剂搭配组合对高脂食物诱导kkay小鼠餐后2小时血糖水平升高的降低作用。#p < 0.05与对照组比较，*p < 0.05与糖尿病组比较
Figure 10. Reduction effect of suitable formula of nitric oxide and natural antioxidants on blood press of SD rats fed with high lipid food. #p < 0.05 vs control, *p < 0.05 vs high lipid control
图10. 一氧化氮和天然抗氧化剂搭配组合对高脂食物诱导大鼠血压升高的降低作用。#p < 0.05与对照组比较，*p < 0.05与糖尿病组比较
大鼠收缩压大幅度升高(大约73%)，灌胃一氧化氮和天然抗氧化剂搭配组合后一个月，可以显著降低大鼠的血压(低剂量和高剂量分别降低大约12%和18%)。而且喂食高脂的大鼠体重比对照组也明显增加(由15.7 g增加到21.9 g)，喂食一氧化氮和天然抗氧化剂搭配组合，低剂量和高剂量组明显使体重分别降低8%和15.5%。一氧化氮和天然抗氧化剂的合理搭配对基础饲料喂养大鼠的血压没有明显影响。
3.4. 一氧化氮和天然抗氧化剂搭配组合对氧自由基的清除作用
为了探讨一氧化氮和天然抗氧化剂搭配组合减少高脂饲料引起动物体重的增加、血脂、血糖和血压升的机理，我们测试了一氧化氮和天然抗氧化剂组合对羟基和超氧阴离子自由基的清除作用。试验结果表明，一氧化氮和天然抗氧化剂合理的搭配组合对Fenton反应产生羟基自由基的清除作用是很强的，清除率达50%的浓度为V50 = 0.55μg/ml (图11(a))；对黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶系产生超氧阴离子自由基也很强，清除率达50%的浓度为V50 = 7.15μg/ml (图11(b))。另外，我们以前的研究表明，这个组合可以明显提高一氧化氮的产生能力 [8] 。
(a) (b)
Figure 11. Scavenging effects of suitable formula of nitric oxide and natural antioxidants on free radicals. (a) hydroxyl free radical, (b) super oxide free radical
图11. 一氧化氮和天然抗氧化剂搭配组合对自由基的清除作用。(a) 对羟基自由基的清除作用，(b) 对超氧阴离子自由基的清除作用
4. 结论
通过动物模型实验，可以看出高脂饲料引起动物体重的增加，血脂、血糖和血压的明显升高。一氧化氮和天然抗氧化剂搭配组合喂养一个月后，能够明显减少高脂饲料引起动物体重的增加、血脂、血糖和血压升高。不仅如此，试验表明一氧化氮和天然抗氧化剂搭配组合对羟基、超氧阴离子自由基也具有很强的清除作用。
5. 讨论
代谢综合症是高血压、血糖异常、血脂紊乱和肥胖症等多种疾病在人体内集结的一种状态，严重时可以直接导致心血管疾病的发生，并造成死亡，被称为21世纪主要健康杀手。高体重、高血压、高血脂、高血糖、高脂肪酸、高尿酸、高血粘、高胰岛素抗体，这八高若有其中两高，就可以称为代谢综合征。美国20岁以上成年人代谢综合症的发生率为24%，其中包括60%的肥胖患者[10] [12] 。而据中华医学会糖尿病学会的调查，目前在中国城市20岁以上的人群中，代谢综合症的患病率为14%~16%。代谢综合症随着年龄的增高而增加，在50至70岁人群中达到发病高峰，其中女性患者多于男性。据预计，患有代谢综合症的病人，在未来7年里，每8个人就会有1人因代谢综合症死亡，其中因糖尿病导致的心血管疾病发生数量是血糖正常者的4.5倍[12] [13] 。
一氧化氮是一种无色气体，是一种典型的小分子气体自由基。八十年代中期开始，一氧化氮的生物功能才开始逐渐被认识。一氧化氮在生物体内承担着重要的生物功能，作为内皮细胞松驰因子舒张血管调节血压[5] [14] 。在体内一氧化氮由一氧化氮合酶催化L-精氨酸产生。
山楂的果实、叶子、花都可入药，包含多种化学成分，如黄酮类物质，原花青素类，有机酸类，三萜酸类，甾酮类等。山楂提取物可以治疗早期充血性心衰，心绞痛，心律不齐，高血压，高脂血症等。现在药理试验表明，山楂提取物可能通过抑制磷酸二酯酶活性，增加冠状动脉血流量和心脏的血液输出，减少心脏的耗氧量，保护心脏免受缺血再灌注损伤[5] [15] 。
虾青素属类胡萝卜素，是存在于鱼、虾和藻类中的一种强抗氧化剂，其抗氧化活性大于beta-胡萝卜素和维生素E很多倍[16] 。近年对虾青素功能的研究对其生物活性有了更多的认识。体外实验显示，在神经细胞模型中，虾青素可以降低6-羟基多巴胺诱导的氧化应激、线粒体损伤和细胞凋亡。在大脑缺血动物模型中，虾青素通过抑制氧化应激、减少谷氨酸释放和细胞凋亡降低大脑的自由基损伤、神经退化和脑梗塞[17] [18] 。
知母的有效成分知母宁，是含有四个酚羟基的多酚类物质，具有清热泻火，滋阴润燥，退热消炎，抑菌杀菌，降血糖等作用，最近人们建议把它用于治疗心脏病。知母宁对氧自由基有很强的清除作用，它对大鼠心肌缺血再灌注损伤过程产生的一氧化氮自由基和氧自由基有清除作用以及对心肌缺血再灌注损伤有保护效应[19] [20] 。
我们将L-静氨酸和天然抗氧化剂山楂提取物、知母宁山楂提取物及虾青素进行合理搭配以后，发现在细胞体系和组织体系中，该组合既可以产生一定量的一氧化氮[8] ，又可以清除氧自由基，有一定的协同作用。一氧化氮作为内皮细胞松驰因子舒张血管调节血压[5] [15] ，说明一氧化氮和天然抗氧化剂组合可能是通过清除氧自由基和促进一氧化氮产生防止高脂饮食和基因引起的血管损伤，用于对血管的调节和保护作用。另外，一些天然抗氧化剂本身就可以防止高脂饮食和基因引起的血脂和血糖的升高[6] [7] 。
另外，一氧化氮和天然抗氧化剂能够通过T淋巴细胞提高机体的免疫作用，特别是对T-淋巴细胞免疫有调节作用[20] [21] 。一氧化氮和天然抗氧化剂还可能参与其他生物功能，如增加循环中的网状红细胞、白细胞和中性粒细胞，一氧化氮是NK(natural killer)细胞杀伤靶细胞的调节剂，可以调节NK细胞的功能，提高或抑制肥大细胞和中性粒细胞的活化[22] -[25] 。本研究也为研制和开发保护血管，防治高血压、高血脂、高血糖及代谢综合症的健康食品和药物提供了有价值的参考。