1. 引言
【研究意义】漆酶(EC1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，属于蓝色氧化酶家族，漆酶广泛存在于植物和真菌中 [1] [2] 。目前有关真菌漆酶的研究与应用已有大量报道，但高等植物中有关漆酶的研究却相对较少。长期以来，植物细胞壁丰富的过氧化物酶被认为是催化木质素单体氧化聚合的首要酶。最近的研究表明，漆酶分泌到植物细胞次生壁，在有氧气存在时，可以催化同样的聚合反应。植物中的漆酶基因家族庞大，毛果杨(Populus trichocarpa Torr. & Gray)作为一种有代表性的模式植物，其基因组测序已经完成，因此，研究并确定毛果杨的中的漆酶基因序列对进一步研究并阐明漆酶基因在植物中的作用与功能具有重要的意义。【前人研究进展】近年来，有关漆酶基因克隆与表达的研究主要集中在真菌漆酶方面，而漆酶的异源表达大多数的研究集中于真核生物毕赤酵母的研究中，Yang J等 [3] 克隆了白腐真菌中的一个漆酶基因并在毕赤酵母GS115中成功实现异源表达；顾春娟等 [4] 在毛头鬼伞漆酶的研究中，在欲表达的漆酶氨基酸序列的N端加入10个氨基酸标签后在毕赤酵母KM71中成功表达并测得活性。真菌漆酶原核表达方面的研究相对较少，Salony等 [5] 首次在大肠杆菌中成功表达了真菌黑蛋巢菌布里尼的漆酶蛋白，随后Søren Brander等 [6] 将克劳氏芽孢杆菌的漆酶基因在大肠杆菌BL21中成功进行了表达。【本研究切入点】目前，有关漆酶原核表达的研究只在真菌漆酶中有过研究，而植物漆酶基因的原核表达的研究确鲜见报道。【拟解决的关键问题】以模式植物毛果杨为材料，克隆其漆酶基因，构建原核表达载体，研究植物漆酶基因能否在体外成功进行原核表达，为植物漆酶基因家族成员的鉴定及后续结构功能的研究提供一定的理论基础。
2. 材料与方法
2.2. 实验材料与主要试剂
实验材料毛果杨(Populus trichocarpa Torr. & Gray)无性系取自北京林业大学生物化学与分子生物学研究室。大肠杆菌(Escherichia coli)JM109及BL21(DE3)由本实验室保存。表达载体pET-30a(+)由本实验室保存。克隆载体PMD-18T，Ex Taq酶购自TaKaRa公司。植物总RNA提取试剂盒，反转录试剂盒，琼脂糖凝胶回收试剂盒与普通质粒小提试剂盒购自北京天根生物公司。T4-DNA连接酶，限制性内切酶Kpn I和BamH I购自promega公司。异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)购自Sigma公司。
2.2 实验方法
2.2.1. 毛果杨漆酶基因LAC-1的电子克隆与序列分析
根据同源克隆的原理，利用已经研究确定的拟南芥中的漆酶基因AtLAC4序列对毛果杨基因组数据库进行同源检索，找到与AtLAC4同源性较高的毛果杨中的疑似漆酶的基因序列，利用DNAMAN等软件分析LAC-1(基因登录号XP_002310245)的序列，获得分析结果。
2.2.2. 毛果杨漆酶基因LAC-1的进化分析
通过在NCBI网站上进行BLAST比对分析，得到大量毛果杨漆酶基因LAC-1具有相近进化关系的基因序列，这些基因大量存在于不同植物中，如欧亚槭(Acer pseudoplatanus)、白桦树(Betula platyphylla)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、棉花(Gossypium hirsutum)、野生大豆(Glycine soja)、欧洲云杉(Picea abies)、海岸松(Pinus pinaster)、可可树(Theobroma cacao)等。BLAST结果显示，这些相关的基因全部来自漆酶基因家族。然后将这些漆酶基因与LAC-1进行了进化分析，并利用MEGA6.0软件绘制了进化树。
2.2.3. 毛果杨漆酶基因LAC-1的克隆及LAC-1-pET
30a
(+)表达载体的构建
以生长健壮的毛果杨的组培苗的叶片为材料，根据北京天根生物公司的总RNA提取试剂盒的操作流程，提取毛果杨的总RNA。用1%的琼脂糖凝胶对提取的总RNA进行电泳检测。根据北京天根公司反转录试剂盒的操作步骤，以Oligo(dT)18为引物进行反转录得到毛果杨的cDNA序列。设计加入酶切位点的上游引物5’-GGGGTACCATTCTAGGATTCATTCCTTTTC-3’(划线部分为Kpn I的酶切位点)，加入酶切位点的下游引物为5’-CGGGATCCGCAAGGTGGAAGATCCTTAGGA-3’(划线部分为BamH I的酶切位点)。以cDNA为模板进行PCR扩增目的基因，25 µL的PCR体系包含：2 µL毛果杨cDNA(约100 ng)、上下游引物各1 µL (10 pm/µL)、2.5 µL (2.5 mmol/L)dNTP、2.5 µL 10 × Ex Taq buffer、0.5 µL Ex Taq酶(2.5 U/µL)、14.5 µL ddH2O。PCR条件为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2 min，共进行30个循环，最后72℃延伸10 min后保存于4℃。
PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带，将回收的产物与pMD-18T载体连接后转化大肠杆菌JM109感受态细胞，将转化产物涂布于含氨苄(100 mg/L)的LB培养基上后于37℃的培养箱中过夜培养。挑取单菌落扩大培养后，提取质粒进行PCR初步鉴定，将阳性个体送到北京六合华大基因公司进行测序鉴定。
对测序正确的阳性个体进行扩摇后，提取质粒，与质粒pET-30a(+)同时进行限制性内切酶(Kpn I和BamH I)的双酶切，酶切产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，回收酶切目的条带用T4-DNA连接酶进行连接。连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)后涂布于含卡那霉素(100 mg/L)的LB固体培养基上过夜培养，待长出单菌落后挑取单菌落于含卡那霉素(100 mg/L)的液体LB培养基中扩大培养，提取菌液的质粒后进行双酶切(Kpn I和BamH I)鉴定，获得LAC-1-pET30a(+)的重组原核表达载体。
2.2.4. 毛果杨LAC-1的原核表达及纯化
将含表达载体LAC-1-pET30a(+)的大肠杆菌BL21(DE3)在含卡那霉素(100 mg/L)的LB固体培养基上划线后于37℃过夜培养到单菌落长出，挑取单菌落于20 mL的含卡那霉素(100 mg/L)的液体LB培养基中过夜培养，取5 mL过夜培养的菌液按1:100的比例扩大培养到500 mL的含卡那霉素(100 mg/L)的液体LB培养基中培养3 h左右到OD600为0.6左右，加入抽滤灭菌的IPTG(终浓度为0.3 mmol/L)溶液，于28℃、140 rpm的摇床中诱导培养3 h。获得的菌液在4000 rpm的条件下富集菌体，以未加IPTG诱导的转化菌株为空白对照，以12%的SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的诱导表达结果。根据QIAGEN公司的蛋白纯化手册的步骤对目的蛋白进行纯化，以12%的SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的纯化结果。
3. 结果与分析
3.1. 毛果杨漆酶基因LAC-1及其蛋白序列的分析
利用拟南芥漆酶基因AtLAC4对毛果杨基因组数据库同源检索，我们得到同源性较高的毛果杨的的基因LAC-1，对其进行序列分析可知，其基因全长为2198 bp，其中含有6个外显子和5个内含子，其CDS序列全长为1635 bp，编码545个氨基酸，该序列没有信号肽大小约为60 KD。通过其与拟南芥中漆酶基因的氨基酸比对分析可知(图1)，该序列中具有漆酶基因的三个铜离子的保守结合域，其中铜离子结合保守域I中的保守氨基酸为四个H(组氨酸)残基，铜离子结合保守域II中的保守氨基酸为N(天冬氨酸)、L(亮氨酸)、V(缬氨酸)、K(赖氨酸)、P(脯氨酸)、Q(谷氨酰胺)、T(苏氨酸)，以及铜离子结合保守域III的四个保守氨基酸H(组氨酸)、C(半胱氨酸)、H(组氨酸)、L(亮氨酸)。
3.2. 毛果杨漆酶基因LAC-1的进化树分析
从进化树中可以清晰的看到(图2)，同一物种的不同漆酶在进化关系上都有比较大的差异，这充分说明漆酶基因家族中不同的漆酶的功能可能存在比较大的差异。毛果杨的漆酶基因LAC-1与野生大豆(G. soja)的laccase-4以及拟南芥的漆酶基因laccase-4具有比较相近的进化关系，最近的研究已经表明拟南芥的漆酶基因laccase-4在拟南芥的木质素合成过程中起到重要的作用，由此我们可以初步推测毛果杨漆酶基因LAC-1可能在毛果杨木质素合成过程发挥重要作用。
3.3. 毛果杨漆酶基因LAC-1的克隆及表达载体的构建
利用毛果杨组培苗的叶片为实验材料进行毛果杨总RNA的提取，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定所提取RNA的质量(如图3(a))，利用反转录后得到的cDNA为模板，通过PCR扩增得到大小约为1.7 Kb的片段(如图3(b))，与杨树基因组数据库中公布的漆酶的基因序列大小基本一致，将该片段回收后与pMD-18T载体连接转化大肠杆菌JM109，提取质粒进行初步的PCR鉴定，将得到的阳性送去测序，将测序结果与杨树基因组数据库中的序列进行比对，得到正确的LAC-1基因序列。将测序正确的毛果杨LAC-1与pET-30a(+)同时进行双酶切(Kpn I和BamH I)后连接，获得重组质粒LAC-1-pET30a(+)，然后进行双酶切鉴定(如图3(c))。
3.4. 重组蛋白的诱导表达及纯化
将获得的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后，经IPTG诱导表达，以未加IPTG诱导的转化菌株为对照，进行12%的SDS-PAGE电泳，从电泳结果可得(图4(a))，在60 KD左右的位置经IPTG诱导后有一条明显的蛋白条带表达，由此可以说明毛果杨漆酶基因LAC-1在大肠杆菌BL21(DE3)中可以实现成功表达，但该表达蛋白以无活性的包涵体形式存在于菌体沉淀中。由于表达载体pET-30a(+)中带有六个组氨酸的标签，因此按照QIAGEN公司的蛋白纯化手册中的包涵体蛋白的纯化通过Ni-NTA亲和层析对包涵体蛋白进行纯化，得到了纯化后的重组蛋白(图4(b))。
4. 讨论
漆酶(EC
1.10.3
.2)是多铜氧化酶中的一种含铜的糖蛋白氧化酶，按照来源大致可以分为植物漆酶、微
Figure 1. The amino acid sequence alignments of Populus trichocarpa LAC-1 and Arabidopsis thaliana laccases
图1. 毛果杨漆酶LAC-1与拟南芥漆酶的氨基酸序列比对
生物(包括真菌和细菌)漆酶和动物漆酶 [7] 。日本人吉田于1883年首次在漆树(Toxicodendron vernicifluum(Stokes)F.A.Barkley)漆液里发现漆酶，随后研究发现某些高等真菌也能分泌这种酶，并且高等真菌分泌的漆酶能够催化降解多种芳香族化合物特别是酚类。与真菌所分泌的漆酶作用恰恰相反，漆酶在植物中主要起到合成木质素的作用。Sterjiades等 [8] 和Bao等 [9] 分别从欧亚槭(A. pseudoplatanus)和火炬松(Pinus taeda L.)中分离得到漆酶，并证明其可以在体外催化木质素单体的氧化聚合。Berthet S等 [10] 通过对拟南芥突变体的研究确定了LAC4和LAC17在拟南芥木质素合成中起重要作用。而木质素是植物细胞
Figure 2. Phylogenetic relationship of LAC-1 protein in Populus trichocarpa and other plants
图2. 毛果杨漆酶LAC-1蛋白与其它植物蛋白的系统发生分析
(a) (b) (c)
Figure 3. The results of LAC-1 gene cloning and double digestion of recombined vector ((a) electrophoresis of Populus trichocarpa totle RNA, (b) electrophoresis of LAC-1 cloning, (c) double digestion of recombined vector)
图3. 毛果杨漆酶基因LAC-1的克隆及重组载体双酶切鉴定结果((a) 毛果杨总RNA电泳图，(b) 漆酶基因LAC
-1 克
隆电泳图，(c) 重组载体双酶切鉴定结果)
(a) (b)
Figure 4. Analysis of induced expression and purified products by SDS-PAGE
图4. 诱导表达及纯化产物的SDS-PAGE分析
壁氧化聚合木质素单体而形成的高聚物。木质素结构稳定，很难在短时间内被降解。在造纸工业中，木质素是严重影响纸浆质量和造成环境污染的重要因素 [11] 。在畜牧业中，饲草的木质素影响牲畜的消化与营养吸收，木质素含量的高低是饲草优劣的指标之一 [12] 。降低木质素含量或改变其组分，将有利于更好地利用资源植物。
自漆酶基因被发现以来，有关其研究一直经久不衰，但漆酶的研究主要集中在高等真菌方面，而关于植物漆酶的研究相对较少。有关植物漆酶的体外表达研究更是鲜见报导。要了解漆酶基因在植物体内的生化功能，必须要从蛋白水平上进行研究。原核表达系统是最常用的表达系统，以大肠杆菌为代表的原核表达系统是外源基因表达的首选 [13] ，因此原核表达为研究植物漆酶蛋白的表达与功能提供了一条有效的途径。本研究中将克隆得到的毛果杨漆酶基因LAC-1与原核表达载体pET-30a(+)重组后转入大肠杆BL21(DE3)中经IPTG诱导表达后，经SDS-PAGE电泳检测表明，漆酶基因与组氨酸标签形成融合蛋白后，在原核表达系统中可以进行成功表达，但表达的融合蛋白主要以无活性的包涵体形式存在，这说明毛果杨漆酶基因虽然能在大肠杆菌中实现表达，但由于原核生物表达条件的限制导致表达蛋白并不能正确实现折叠而导致了包涵体蛋白的形成。利用表达融合蛋白上的组氨酸标签，通过Ni-NTA亲和层析对包涵体蛋白进行纯化并获得纯化目的蛋白，而进一步研究该包涵体蛋白的复性以及体外活性与结构功能是本文后续的研究方向，毛果杨漆酶基因LAC-1在体内参与怎样的代谢活动，其是否与毛果杨中木质素合成过程相关都会在以后的深入研究中逐渐揭晓。
5. 结论
毛果杨漆酶基因在合适的条件下可以在原核表达系统中实现成功表达，为植物漆酶基因体外结构与功能的研究提供了基本资料。
基金项目
国家自然科学基金项目(31570582, 30671697, J1103516)。