1. 引言
由创伤、感染、肿瘤引起的骨缺损是临床常见的病症。骨缺损的再生和修复过程需要多种生长因子的协同调控，适时适量补充外源性生长因子能够有效地促进骨缺损的修复。其中，骨形态发生蛋白-2 (BMP-2)是目前已知效应最强、应用最广泛的骨生长因子 [1] 。而且是唯一一种能够启动成骨分化并作用于整个成骨分化形成过程的细胞活性蛋白。BMP-2能够促进细胞外基质组成成分的合成且促进细胞的增殖。BMP-2表达水平的高低直接影响间充质干细胞分化和骨量产生的水平。但是，直接应用BMP-2存在诸多问题，如半衰期较短，缺乏长期稳定性和组织选择性等，难以在局部持久有效的发挥作用 [2] 。利用药物缓控释技术将BMP-2载入微球中，可使其缓慢、持久地释放，并且能够长期维持生长因子的生物活性。
聚乳酸(PLA)以其优越的生物相容性、生物安全性和可降解性，在生物医学工程领域得到广泛的研究和应用 [3] 。PLLA的最终降解产物是H2O和CO2，中间产物乳酸也是体内正常糖代谢产物，不会在重要器官聚集。在各种缓控释系统的制备过程中，可以根据药物的性质、给药途径和释药时间，选用不同的PLLA，通过调整PLLA的组成、分子量等来调控微球的载药量及粒径的大小，从而调控药物的释放速率 [4] 。本研究采用BSA为模型蛋白，利用乳化法制备BSA-PLLA微球，研究PLLA分子量、PLLA浓度、PEG分子量对PLLA载药微球的影响，根据优化条件制备BMP-2-PLLA微球，对其进行表征并检测BMP-2的释放规律和生物活性。
2. 材料与方法
2.1. 材料
PLLA (济南岱罡生物工程有限公司)，聚乙烯醇(PVA，Sigma公司)，聚乙二醇(PEG，成都市科龙化工试剂厂) BCA试剂盒(南京建成)，BMP-2 (Peprotech)，BMP-2-ELISA试剂盒(RD进口分装)
2.2. PLLA微球的制备
采用乳化法制备PLLA微球 [5] 。称取适量PLLA和PEG溶于5 mL二氯甲烷中组成有机相，待其完全溶解后，缓缓加入250 μL 1 mg/mL的BSA溶液，至于磁力搅拌器上高速搅拌2分钟，形成初乳(W/O)。再加入10 mL 1% PVA，磁力搅拌器上高速搅拌5分钟形成复乳(WO/W)。将乳浊液加入400 mL 0.1% PVA中室温下搅拌4小时，500 r/min，有机溶剂挥发后得到微粒的混悬液。将所得微粒的混悬液5000 r/min离心10分钟，用蒸馏水洗涤3次，真空冷冻干燥24小时得到BMP-2-PLLA载药微球。
2.3. 制备条件对PLLA载药微球的影响
分别采用分子量为10、50、100 KDa的PLLA制备载BSA的PLLA微球，其它条件不变，考察PLLA分子量对PLLA微球的影响。
分别采用浓度为50 mg/mL、100 mg/mL、150 mg/mL的PLLA制备载BSA的PLLA微球，其它条件不变，考察PLLA浓度对载药微球的影响。
分别采用分子量为400、1000、4000的PEG制备载BSA的PLLA微球，其它条件不变，考察PEG分子量对载药微球的影响。
2.4. PLLA微球的表征
PLLA载药微球的形貌通过扫描电镜观察，取一定微粒用导电胶粘在载物台上，喷金后观察。微球粒径大小及粒径分布采用激光粒度仪测定。一定量的样品加入样品池，经超声分散后启动仪器循环泵，自动分析软件即可获得微粒粒径大小及粒径分布。
2.5. PLLA微球的包封率和载药量
精确称量适量的BSA-PLLA载药微球，加入二氯甲烷适量，磁力搅拌直至聚乳酸完全溶解，再加入定量高纯水，搅拌同时缓慢升温，待二氯甲烷挥发完全，溶液经0.22 µm微孔滤膜滤过，采用BSA试剂盒测试BSA浓度。BMP-2含量的测定采用酶联免疫吸附法定量检测试剂盒。根据2010年版《中华人民共和国家药典》规定，载药量和包封率分别按以下公式计算：
2.6. PLLA微球体外释放检测
精密称取BSA-PLLA 60 mg置于预先处理好的透析袋中，在袋中加入2 mL磷酸缓冲液(pH 7.2)溶液，封口后将透析袋浸没于盛有PBS的试剂瓶中。试剂瓶置于37℃水平恒温振荡器(频率100 r/min)，开始计时。在预定的时间取样1 mL，同时补加1 mL空白PBS，采用BSA试剂盒测试BSA浓度。BMP-2含量的测定采用酶联免疫吸附法定量检测试剂盒。用标准曲线求出药物浓度并换算成不同时间的计算累积释放率，绘制累计释放量与时间的曲线。
2.7. PLLA载药微球中二氯甲烷残留量的检测
精密称取PLLA载药微球100 mg，以二氯甲烷标准品为对照，采用气相色谱顶空法检测其二氯甲烷残留量。
2.8. BMP-2-PLLA微球中BMP-2生物活性的检测
BMP-2-PLLA微球释放出的BMP-2的生物活性通过其对成骨细胞(MG63)碱性磷酸酶(ALP)合成的影响进行考察。将细胞接种于96孔细胞培养板中，置于37℃，5% CO2细胞培养箱培养24小时，然后按照实验分组：1) 对照组：仅加入培养基，2) Free-BMP-2组：培养基中直接加入BMP-2，3) BMP-2-PLLA组：培养基中加入BMP-2-PLLA微球。培养7天，采用ALP检测试剂盒检测细胞分泌ALP的浓度。
3. 结果
3.1. 不同制备条件对PLLA载药微球的影响
3.1.1. PLLA分子量对PLLA载药微球的影响
不同PLLA分子量对PLLA载药微球粒径、载药量、包封率的影响见表1。随着PLLA分子量的增大，微球粒径逐渐增大，BSA包封率逐渐减小而载药量逐渐增大。
3.1.2. PLLA浓度对PLLA载药微球的影响
不同PLLA浓度对PLLA载药微球粒径、载药量、包封率的影响见表2。随着PLLA浓度的增大，微球粒径逐渐增大，BSA包封率逐渐增大而载药量逐渐减小。
3.1.3. PEG分子量对PLLA载药微球的影响
不同PEG分子量对PLLA载药微球粒径、载药量、包封率的影响见表3。随着PEG分子量的增大，微球粒径逐渐减小，BSA包封率和载药量都逐渐增大。
3.2. BMP-2-PLLA微球的表征
根据不同制备条件对PLLA载药微球粒径、载药量、包封率的影响，为了制备大小适宜、包封率和载药量较高的PLLA载药微球，最终选择分子量为10 KDa，浓度为50 mg/mL的PLLA，分子量为4000的PEG来制备BMP-2-PLLA微球。由图1可见，BMP-2-PLLA微球的形态规则，表面光滑，大小均一。BMP-2-PLLA微球的平均粒径为4.815 μm，BMP-2-PLLA微球的理论载药量为3.99 × 10−3%，实际载药量为2.28 × 10−3%，包封率为70.88%。
3.3. PLLA载药微球中二氯甲烷残留量
本研究以二氯甲烷标准品为对照，采用顶空法测得BMP-2-PLLA微球中二氯甲烷残留为0.0041%，远低于中华人民共和国药典(2010)限度规定(0.06%)。由此可见，本实验中所采用的制备方法和条件可以制得有机溶剂残留量低的常用的高分子微球。
3.4. PLLA载药微球的体外释放检测
分别制备BMP-2-PLLA和BSA-PLLA载药微球，在不同时间点检测溶出介质PBS中BMP-2和BSA的浓度，计算累计释放率，如图2。24小时，BMP-2和BSA的累计释放率分别为55.797%和45.976%；7天时，BMP-2和BSA的累计释放率分别为87.357%和77.789%；14天时，BMP-2和BSA的累计释放率分别为93.104%和83.451%；21天时，BMP-2和BSA的累计释放率分别为94.395%和90.268%。
3.5. 细胞合成ALP的检测
采用ALP检测试剂盒检测MG63细胞合成ALP的情况，见图3。细胞培养1天后，BMP-2-PLLA载药微球中释放出的BMP-2较空白对照组和直接在培养液中加入BMP-2组，显著促进MG63细胞合成ALP (P < 0.05)，直接在培养液中加入BMP-2组与空白对照组没有显著差异。培养7天后，直接在培养液中加入BMP-2和BMP-2-PLLA载药微球中释放出的BMP-2都能够显著促进ALP合成，且BMP-2-PLLA微球中释放的BMP-2对MG63细胞合成ALP的诱导作用更加显著(P < 0.01)。
Table 1. Mean size, drug loading and encapsulation efficiency of BSA-PLLA microspheres prepared in different PLLA Mw
表1. 不同分子量PLLA制得的BSA-PLLA载药微球的粒径、载药量、包封率
Table 2. Mean size, drug loading and encapsulation efficiency of BSA-PLLA microspheres prepared in different PLLA concentrations
表2. 不同浓度PLLA制得的BSA-PLLA载药微球的粒径、载药量、包封率
Table 3. Mean size, drug loading and encapsulation efficiency of BSA-PLLA microspheres prepared in different PEG Mw
表3. 不同分子量PEG制得的BSA-PLLA载药微球的粒径、载药量、包封率
Figure 1. SEM photographs of BMP-2-PLLA
图1. BMP-2-PLLA载药微球的扫描电镜图
Figure 2. Drug release curves of BMP-2-PLLA, BSA-PLLA microspheres
图2. BMP-2-PLLA、BSA-PLLA载药微球的释放曲线
Figure 3. Biology activity of BMP-2 released from BMP-2-PLLA microspheres
图3. BMP-2-PLLA载药微球中释放出的BMP-2的生物活性
4. 讨论
利用具有骨诱导活性的人工骨促进大段骨缺损的修复和再生是近年来研究的热点 [6] 。将生长因子载入生物材料结合构建生长因子缓释微球应用于骨组织的再生和修复，可以长期维持生长因子的生物活性和稳定性，提高生物利用度，降低给药频率，使其在局部组织更好的更充分的发挥作用。利用PLLA作为生长因子缓释微球的主要制备材料，不但具有良好的生物相容性，对机体无毒无刺激，而且制备的药物缓释载体稳定、可控、重复性好。
实验考察了乳化法制备PLLA载药微球过程中影响微球粒径、蛋白药物载药量和包封率的几个主要因素。结果表明，BSA-PLLA微球的平均粒径与PLLA的相对分子量的大小有关。在实验考察范围内，BSA-PLLA微球的平均粒径随着聚乳酸相对分子量的增大而增大。这是由于PLLA在二氯甲烷中溶解性良好，相对分子量越低结晶度相对较低，溶解度较大。在微球形成过程中，随着二氯甲烷的挥发，相对分子量低的PLLA沉积速率较慢，成球速度较慢，相对分子量较高的聚乳酸结晶度相对较高，沉积速率快，但随着分子量的增大，但在乳化过程中油相的粘度就越大，在其他条件相同的情况下，致使乳化过程的分散程度降低，增加了溶剂挥发过程中乳液液滴碰撞发生聚集的可能性，从而产生一些粒径较大的微球 [7] 。载药量和包封率检测结果表明，载药量PLLA相对分子量的增大而减小，包封率随着PLLA相对分子量的增大而增大。原因是由于聚乳酸是一种疏水性高分子化合物，其分子量越大，疏水性越强，水分子渗透引起药物流失的程度越小，因此微球包封率相对增高 [8] 。另外，PLLA浓度对微球的粒径、包封率和载药量的影响比较明显，在一定范围内，随着PLLA浓度的增大，微球的粒径和包封率增大。PLLA浓度的增大使得乳化过程中油相的粘度较大，乳化过程的分散程度降低，使微球的粒径增大。当PLLA浓度大于100 mg/mL后，增加材料的用量对包封率的提高并不明显，说明材料内包载的蛋白已达到极限。从PEG分子量对微球的影响可以看出，PEG-400制备的PLLA载药微球粒径最大，PEG-1000制备的胰蛋白酶–聚乳酸载药微球粒径最小。当PEG分子量大400后所制备的微球粒径随着PEG分子量增大而增大。载药量和包封率随着PEG分子量的增大而增大。综合以上结果，选择分子量为10 KDa，浓度为50 mg/mL的PLLA，分子量为4000的PEG来制备BMP-2-PLLA微球。制备的微球表面光滑，形态规则，大小均一。
理想的药物缓释载体应具有稳定的药物释放速率，以达到药物最大的生物学性能 [9] 。从PLLA微球中BMP-2和BSA两种蛋白的累积释放曲线可以看出，24小时，BMP-2和BSA的累计释放率分别为55.797%和45.976%，蛋白的释放都存在一定的突释现象。随后蛋白的释放持续且稳定，7天时，BMP-2和BSA的累计释放率分别为87.357%和77.789%；然后，蛋白的释放速率逐渐减慢，14天时，BMP-2和BSA的累计释放率分别为93.104%和83.451%。21天时，BMP-2和BSA的累计释放率分别为94.395%和90.268%。BMP-2-PLLA微球能够对生长因子起到缓释的作用，且有效实现了BMP-2长期稳定缓慢释放。另有研究制备了载有FGF-2的PLGA缓释微球 [10] ，其蛋白的累计释放率在13天时约为12%，本研究中的蛋白释放速率较快。
保持生长因子的生物活性是本研究的关键。在BMP-2-PLLA微球的制备过程中，需使用少量的有机溶剂，但微球经过低温搅拌和反复洗涤后，充分挥发去除了制备过程使用的二氯甲烷，大大降低二氯甲烷的残留量，减少或避免了有机溶剂可能带来的毒副作用，最终制得有机溶剂残留量非常低的PLLA微球。从细胞ALP合成的结果可知，BMP-2-PLLA对细胞ALP的合成具有显著地促进作用，证明制备过程保持了BMP-2的生物活性。而且，BMP-2-PLLA对细胞合成ALP的诱导作用较直接应用BMP-2水溶液更显著，原因是BMP-2-PLLA中持续释放BMP-2，充分发挥了BMP-2的生物活性。
本研究制备的BMP-2-PLLA微球简单易行，且能够持续缓慢释放BMP-2并有效地维持其的生物活性，为构建多因子缓释系统，发挥它们之间的协同调控作用奠定基础。
基金项目
国家自然科学基金资助项目(编号：81401535)。
*通讯作者。