1. 引言
作为一个患病人数逐年递增的神经退行性疾病，阿尔茨海默病(AD)，其患病机理被认为是受到错综复杂的多基因控制引发。在被提出的许多假说当中，老年斑(Senile Plaque)和神经元纤维缠结(Neuron Fibrillary Tangle)已经被广泛接受和研究 [1] 。淀粉样前体蛋白(APP)是产生老年斑的组成元素淀粉样β-蛋白(Aβ)的上游前体蛋白。
APP依次经α-，β-，γ-，δ-分泌酶和caspase酶水解后形成不同长度C端片段APP-CTFs，APLP2-CTFs是APP的同源蛋白APLP2水解后的产物，APP-CTFs和APLP2-CTFs亦贡献于AD的病理机制，其毒性机制是被各种酶切之后形成的AICD与Fe65结合进行核转移，后与CP2/LSF/LBP1转录因子结合刺激GSK-3β基因，增强Tau磷酸化 [2] [3] 。
APP被β-，γ-分泌酶剪切之后产生Aβ，Aβ的神经毒性可以引起形态学上异常神经炎和崩溃的神经元萎缩从而导致细胞骨架各方面的营养缺陷 [4] 。神经元纤维缠结中的过度磷酸化的tau蛋白不仅抑制促微管组装的活性，而且还对参与微管装配的正常tau蛋白、微管相关蛋白MAP1和MAP2进行阻隔，对微管组装造成进一步破坏，导致神经元功能紊乱，这很可能是调节神经元凋亡过程的始动因素 [5] 。
神经元的细胞骨架主要由细胞内的三种蛋白纤维丝的网状结构构成，主要是微管、微丝、中间纤维，微管蛋白tubulin则是微管的主要成分，肌动蛋白actin则是微丝的主要成分 [6] 。Cofilin属于肌动蛋白解聚因子家系，其作用可以与骨架肌动蛋白直接接触，对肌动蛋白解聚并重构，并可增强神经元的迁移能力。微管相关蛋白MAPs是一种主要分为两型(Ⅰ型和Ⅱ型)的高分子蛋白，可以起到维持细胞的微管稳定和装配的作用 [7] 。这其中tau蛋白已经被大多数人研究，MAP2现阶段成了关注的焦点。本实验大鼠胚胎神经元培养细胞中表达蛋白样前体蛋白C端，观察了APP-C/APLP2-C端对神经元细胞结构骨架营养状态的影响。
2. 材料与方法
2.1. 试剂与药品
APP-C端片段由韩国首尔医科大学药理学教室徐维宪教授馈赠；QIAGEN Plasmid Maxi Kit购于QIAGEN；Ph-cofilin, MAP2和tubulin免疫染色抗体、NDiff Neuro-2 (N2)培养基补充剂购于德国默克密理博公司；罗丹明鬼笔环肽染色购自sigma公司；Lipofectamine 2000从Invitrogen公司购买；多聚赖氨酸，免疫组化固定液，免疫组化封闭液，免疫组化洗涤液，免疫荧光染色试剂盒-抗兔Alexa Flour 555、抗鼠Alexa Flour 555，抗荧光淬灭封片液均从碧云天生物科技公司购买；10% DF培养液由本实验室自配；DMEM培养液(Grand Island, NY, 14072, USA)；胎牛血清、马血清(Corning, NY, 14831, USA)；SPF级SD大鼠由延边大学动物科学实验中心饲养提供。
2.2. 实验仪器
BIO-RAD蛋白印迹电泳装置(碧云天生物科技公司)、恒温水浴锅(金坛市杰瑞尔电器有限公司)、分析天平(上海精科天平仪器)、CO2培养箱(美墨尔特贸易有限公司MEMMERT)、低速容量离心机(艾测科技)、生物显微镜(上海精密仪器仪表公司)、制冰机(上海雪豹制冷设备有限公司)、立式压力蒸汽灭菌器(上海博迅)、移液器(上海巴玖实业有限公司)等。
2.3. 质粒扩增提取DNA
分别将含有重组质粒pEGFP-N1-APP-CTFs (C99，C57)、pEGFP-N1-APLP2-CT57和空载体pEGFP-N1的DH5α感受态甘油菌均匀涂抹在固体培养基(含有1/1000的庆大霉素)过夜培养。24 h后，用接种环挑菌与液体培养基中(含有1/1000的庆大霉素)，在
37 ℃
气浴恒温培养箱中以230 r/min的转速扩增培养 [8] 。然后按照质粒大量抽提试剂盒说明书步骤，把扩增后的菌体内的目标DNA抽提出来用pH 8.5的Tris•Cl溶解，用紫外分光光度计测定浓度及纯度。
2.4. 胚胎神经元培养
选择怀孕16~18天的大鼠将其用乙醚麻醉，解剖腹部取出胚胎放入预冷的D-hank’s液中。转移至超净台，剪开胚胎，取出仔鼠，用剪刀轻轻剪开颅骨，剥离掉最上层的脑膜后，直接取大脑皮层组织；将组织剪成约1 mm ×
1 mm
块状并放置于新的D-hank’s液中离心；去上清液后的组织再加入0.25%的胰酶消化分解，于37℃水浴20 min。最后把消化过的组织放于200目筛网将其进一步碾碎过筛得到神经元细胞。
预先用双蒸水配置含量为0.1%的多聚赖氨酸溶液，将该溶液包埋在盖玻片上风干以促使神经元细胞贴壁生长 [6] 。刚获得的神经元细胞用含5%的马血清，10%胎牛血清的DMEM培养液，在环境为5%浓度的CO2，
37 ℃
恒温培养箱中培养；第二天换成含有1%的N2的DMEM培养液培养，第四天再更换含有5%的马血清，10%胎牛血清的DMEM培养液；在5~7天进行细胞处理。
2.5. 质粒的转染及表达
按照Lipofectamine 2000说明书步骤将各APP-CTFs和APLP2-CTFs片段分别转染到六孔板各孔当中。实验分为四组：① 对照Vector空载体；② 转染APP-CT99；③ 转染APP-CT57；④ 转染APLP2-CT57；转染质粒24 h后在荧光显微镜下观察细胞形态，并可通过绿色荧光发光强度检验是否成功转染。
2.6. 免疫组化
Ph-cofilin、MAP2和tubulin染色：抽离孵育的六孔板中培养液(六孔板中预先用多聚赖氨酸包埋，促使细胞贴壁)，加1 mL固定液固定10 min后用洗涤液清洗3次，每次5 min。用封闭液封闭60 min，在摇床上轻轻摇动。去封闭液后同样将各孔清洗3次，之后用稀释的一抗Ph-cofilin、MAP2和tubulin (1:200)室温孵育60 min，摇床上轻轻摇动。用洗涤液洗3次，每次5 min。真空泵吸尽洗涤液后，加入1 mL稀释好的荧光二抗Alexa Flour 555 (1:300)室温避光条件下，在摇床上轻轻摇动孵育60 min。孵育后用洗涤液洗3次，每次5 min，期间避光操作。把盖玻片取出，倒置盖在滴有淬灭剂封片液的载玻片上，操作谨慎尽量避免气泡。荧光显微镜下观察效果。
罗丹明鬼笔环肽染色：将罗丹明用PBS配制成100 nM的液体，常温下可避光保存。真空泵抽去六孔板各孔中细胞上清，用
37 ℃
的PBS轻轻的清洗。加混合固定剂(4%甲醛)室温放置10 min，之后用室温的PBS液体清洗30 s。弃各孔内PBS后加入200 mL Triton x-100室温放置5 min，再用常温的PBS液体清洗30 s，在盖玻片上加200 μL罗丹明配置液，用封口膜将封住避免蒸发，暗处孵育30 min。孵育后同样用PBS清洗三次。取出盖玻片，轻轻倒置于载玻片上避免产生气泡，最后用淬灭剂封片。采用Olympus荧光正置显微镜下察染色效果。
2.7. Western蛋白印迹
Western印迹方法检测Ph-cofilin蛋白水平：用预冷的PBS清洗细胞后用RIPA裂解液，在冰上用细胞刮裂解细胞，将裂解液吸入离心管在4˚C, 8000 g rpm离心5分钟得到细胞沉淀液。定量蛋白之后，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳跑胶，2 h后将胶上蛋白电转移至PVDF膜上。此后，用碧云天Western Blotting封闭液封闭1 h，用活化的Ph-cofilin单克隆抗体(1:1000) 4˚C孵育过夜，洗涤液漂洗三次后加二抗辣根氧化酶(HRP)-IgG (1:1000)，室温孵育1 h，洗膜三次后化学发光法显色。用紫外分光光度计扫描条带灰度值，β-actin作为内参照，计算相对的蛋白质表达水平变化。
2.8. 统计学分析
采用SPSS 11.0统计软件进行统计处理，计量资料数据以表示，采用多个样本均数比较的单因素方差分析。
3. 结果
3.1. APP-C端片段对肌动蛋白结构的影响
如图1，分别转染了APP-CT99、APP-CT57和APLP2-CT57三组与对照组相比，细胞的四周延伸了许多发芽的触角，actin结构不够光滑，说明了增加了向细胞外方向的F-actin的聚合。为了探讨机制，我们研究了Ph-cofilin水平，蛋白印迹和免疫组化结果均显示APP/APLP2-CTFs转染组与对照组相比Ph-cofilin水平有所增高(P < 0.05) (图2，图3)。
Scale bar: 10 μm
Figure 1. The effect of APP-C/APLP2-C on actin
图1. APP-C/APLP2-C端对actin的影响
Figure 2. The effect of APP-C/APLP2-C on cofilin
图2. APP-C/APLP2-C端对磷酸化cofilin的影响
Figure 3. The effect of transfected APP-CTFs on Ph-cofilin Protein level
图3. APP-CTFs转染后Ph-cofilin蛋白表达的影响(*P < 0.05)
3.2. APP-C端片段对微管蛋白的影响
转染APP-CT99、转染APP-CT57和APLP2-CT57三组与转染空质粒的对照组相比，细胞内的tubulin都有不同程度的结构紊乱，表达程度加深 (图4)。
Scale bar: 10 μm
Figure 4. The effect of APP-C/APLP2-C on tubulin
图4. APP-C/APLP2-C端对tubulin的影响
3.3. APP-C端片段对微管相关蛋白的影响
转染APP-CT99、转染APP-CT57和APLP2-CT57三组与转染空质粒的对照组相比，轴突当中的MAP2蛋白的表达显著减弱，细胞与细胞之间的联络缩短。尤其APP-C99和APP-C57组MAP2蛋白的表达水平较低 (图5)。
4. 结论
转染淀粉样前体蛋白C端片段可以诱导细胞骨架蛋白和状态的改变。
5. 讨论
阿尔茨海默病(AD)患者大脑的神经元会不同程度地出现神经突的营养不良，如轴突或者树突的扭曲，进而神经元丢失，直接导致病人的认知功能损伤。因此解密形成轴突营养不良的机制为改善或治疗AD病可以提供一条新的思路。
Aβ的神经毒性可以引起形态学上异常神经炎和崩溃的神经元萎缩，从而导致细胞骨架各方面的营养缺陷 [2] 。Aβ诱导的退行性变化，通过LIM-激酶对ADF/cofilin-脱磷酸化来实行 [2] 。
在本实验中转染APP-CTFs后，在神经元的四周F-actin重排参差不齐类似伸展发芽，神经元细胞内磷酸化cofilin聚集。蛋白印迹实验结果也显示Ph-cofilin的蛋白水平比对照组明显增高(P < 0.05)，这与上述Aβ诱导的退行性变化的结论一致。此次试验我们选用了三个CDNA, APP-CT99, APP-CT57, APLP2-CT57, APP与APLP2结构相似都遵循由一大部分细胞外区域和一小部分细胞质区域，且APP-CTFs和APLP2-CTFs贡献AD病的发病机理相似，在细胞核内被γ内切酶所切的胞内C末端结构域(Intracellular C-terminal Domains, ICDs)，刺激了Fe65转录的激活，导致ICDs与CP2结合引起GSK-3β的表达，从而导致tau蛋白的磷酸化 [2] [3] 。
Actin是细胞骨架蛋白其中一种，有人提出假设cofilin是在细胞核内参与了完成actin蛋白的聚合作用。cofilin分子大小在18 kDa左右，它通过LIM激酶调控其Ser3位点的磷酸化与去磷酸化来解聚和重构actin，此外TES激酶也可以对其专一性磷酸化从而影响细胞结构 [5] 。尽管大部分的cofilin在应激条件下定位在细胞核内，但是它可以被动地扩散到细胞核内外 [9] 。此次试验中转染APP/LP-CTFs引起actin的解聚和重构，可能的机制是诱导了cofilin的磷酸化。
Scale bar: 10 μm
Figure 5. The effect of APP-C/APLP2-C on MAP2
图5. APP-C/APLP2-C端对MAP2的影响
Tubulin为球形蛋白，其分别与由450个氨基酸和455个氨基酸分子构成的α和β亚基结合形成分子量各约为55 kDa的α-和β-tubulin。α-和β-tubulin结合形成的异二聚体稳定结构基本单元构成了微管 [10] 。神经元中中空的微管结构是运输大分子物质的重要通道，在神经元细胞的轴突结构中，微管具有保证双向快速轴浆运输、维持神经元电生理功能等特殊作用。AD神经元内微管结构破坏可能与调控微管聚合与解聚多种因素有关，包括tau蛋白，MAP1，MAP2以及Ca2+变化有关 [11] 。本研究中转染APP/LP-CTFs导致tubulin结构紊乱，可能与MPA2等蛋白表达发生变化有关。
MAPs是神经元内的高分子蛋白(MAP1b, MAP2)，还是神经元胞体和树突受伤的早期标志物，MAP2的功能由蛋白激酶和蛋白磷酸酶对其磷酸化的高度动态平衡来调节 [12] 。哺乳动物大脑的海马区域神经元中贯穿颗粒细胞层有高含量的MAP2，大脑中调节MAP2的蛋白磷酸酶有蛋白磷酸酶
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和蛋白磷酸酶2B两种，还有证据表明在AD病中MAP2的减少和tau蛋白的高度磷酸化有着必不可少的联系 [13] 。在我们的结果中，荧光显色的区域集中在树突当中，表现为MAP2的表达减少，神经元突起或断裂不完整，粗细不一，这可能是转染APP-C端基因片段后神经元受损，MAP2磷酸化障碍，导致微管的聚合能力下降，微管的不稳定又引发了细胞骨架完整性缺失，树突发育受到抑制和可塑性崩溃 [14] 。神经元MAP-2的丢失涉及到神经元结构破坏，造成生神经元形态和功能改变，甚至导致神经功能障碍的神经元凋亡 [15] 。因此，APP-C端片段对神经元的树突的伸展有一定的影响，然而更详细的机制有待于进一步研究。
淀粉样前体蛋白作为阿尔茨海默病发病的一个标志物，APP-C端片段在AD的发病机制亦起重要的作用，本研究在细胞骨架方面进行了初步的研究，其更多的机制有待于进一步研究。
基金项目
国家自然科学基金(81160159)。
*通讯作者。