1. 引言
报春苣苔(Primulina tabacum)是我国特有的多年生草本植物 [1] ，属苦苣苔科(Gesneriaceae)，报春苣苔属(Primulina)。报春苣苔为多年生草本；叶基生，叶片羽状浅裂，圆卵形或三角形，基部浅心形；长5~10 cm，宽5~10 cm；具或长或短的叶柄；叶面被腺毛和短柔毛 [1] 。由于报春苣苔分布地域狭窄，数量少，1999年，被列为国家Ⅰ级重点保护野生植物，并列入首批《国家重点保护野生植物名录》 [2] 。常被发现生长在海拔约300 m的石灰岩山地阴湿的石壁上 [3] [4] ，是石灰岩地区特有植物、我国喀斯特植物的重要类群之一 [5] 。石灰岩上土壤土层薄且土被不连续，不易保水，土壤呈中性偏碱，这样特殊的生态环境，加上昆虫难以进行异地授粉，繁殖率极低 [6] [7] ，使得报春苣苔濒临灭绝。
迄今为止，报春苣苔的研究报道，主要是新种的记录 [8] - [11] 、培植技术的改进 [12] [13] ；还有从生态生物学特征 [7] [14] 、光合作用机制角度开展研究 [15] [16] ；围绕报春苣苔已开展了花粉形态 [17] 、遗传多样性 [18] - [20] 等方面的研究，但未见从解剖学的角度对报春苣苔叶片开展的研究。本研究主要对报春苣苔叶片进行研究，旨在找出在不同生境条件(洞口、洞中、洞内)下，报春苣苔叶片维管束、表皮毛和腺毛的形态变化规律，为报春苣苔的保护和进一步研究，提供有一定参考价值的资料；同时也丰富石灰岩植被植物营养器官的解剖学资料。
2. 材料与方法
2.1. 实验材料
实验用的报春苣苔(P. tabacum)叶片于2015年3月，采自广东省连州市星子上柏场石灰岩洞；长4~9 cm，宽3~6 cm。该洞海拔约600 m，洞高3~
15 m
；洞内报春苣苔分布范围约
75 m
。洞口报春苣苔多数生长在石壁缝隙中；洞中报春苣苔有约一半生长在石壁缝隙中，另一半生长在地上；洞内报春苣苔主要生长在地上。
2.2. 处理方法
在洞口、洞中、洞内3个观察点(各点相距约25 m)采集不同植株、不同发育阶段的叶片，用卡诺氏固定液I (无水乙醇:冰醋酸 = 3:1)固定，再用75%酒精清洗2次，75%酒精低温保存，备用。
2.3. 组织切片制作方法
分别切取不同生境、成熟的报春苣苔叶片中下部、过主脉的部分。用爱氏苏木精整体染色，常规石蜡切片法制片，切片厚度为8 μm，再用1%碱性品红酒精液复染，中性树胶封固，Olympus显微镜观察、拍照。
2.4. 表皮解离的制作方法
分别切取不同生境、成熟的报春苣苔叶片中下部、过主脉的部分。置于2.5%果胶酶加2.5%纤维素酶混合液(根据叶片老嫩不同，比例由4:6到6:4改变)中，
30 ℃
恒温20~45 min，1%亚甲基蓝染色，阿拉伯树胶封藏，Olympus显微镜观察、拍照。
2.5. 叶脉标本的制作方法
用卡诺氏固定液Ⅱ (无水乙醇:冰醋酸:氯仿 = 6:3:1)透明24~48 h (视材料而定)取出；再用酒精、甘油等组成的混合液透明24~96 h (视材料而定)；待透明后，换上新的透明液，加入1%的亚甲基蓝染色至合适，流水冲洗，乳胶贴片；Canon G5相机拍照。
3. 观察结果
3.1. 成熟叶片外形及叶脉结构
叶脉的描述术语参考喻诚鸿等 [21] 的表述；气孔器类型分类按胡正海 [22] 的表述。
报春苣苔叶基生，具叶柄，叶片圆卵形至三角形，基部浅心形。叶片脉序属分枝曲行羽状脉类型；成熟叶片叶脉分为四级。叶片中央分布一条一级叶脉。二级脉由一级脉生出；每侧3~5条，基部的2条粗大，近叶尖的2~3条较细；二级脉至边缘常产生分枝，有分枝直至叶缘(图1)。具复合型的二级间脉。三级脉为结网型。四级脉与三级脉及二级间脉组成完善的网眼；盲脉缺或弧曲(图2)。
3.2. 成熟叶片横切面结构
3.2.1. 报春苣苔成熟叶片的结构
显微观察显示：报春苣苔的成熟叶片由表皮、叶肉和叶脉三部分组成。表皮由1层细胞构成，细胞排列紧密、不规则，细胞壁不加厚，表皮外无角质层。非一级脉区叶肉常由4~5层薄壁组织细胞，有栅栏组织和海绵组织之分，栅栏组织1层，细胞呈长柱形；海绵组织细胞不规则，3~4层，排列较紧密，有细胞间隙(图3)。一级脉区叶肉不分化为栅栏组织和海绵组织(图4)。一级脉、二级脉中下部明显向下表皮凸出；该区叶肉细胞近下表皮的大、含叶绿体少或不含，近上表皮的细胞小、含叶绿体多(图5)。叶脉维管束均为外韧有限维管束；近叶基的一级脉维管束呈弧形团状排列，维管束外近上表皮位置，会出现1~2个维管束，是一级脉分生形成二级脉的维管束，维管束的木质部和韧皮部均未见纤维(图6)；远离叶基的一级脉呈圆形(图7)。由一级脉近基部发出的1~2对二级脉粗大，近叶尖的2~3对二级脉纤细，二级脉维管束呈近圆形(图8)。三级脉、四级脉具由一层薄壁组织构成的维管束鞘；三级脉(图9)由于生长环境不同，导管和筛管数量有不同。四级脉维管束分化较晚，且筛管形成更后，往往只见导管(图10)。
3.2.2. 不同生境下报春苣苔成熟叶片结构的比较
不同生境下的报春苣苔的叶片，除了具有上述相同的结构外，还具各自的结构特点，见表1：
Figure 1. Leaf venation in middle cave. Scale bar = 13 mm
图1. 洞中叶片脉序。比例尺 = 13 mm
Figure 2. Leaf venation in middle cave. Showing the areole. Scale bar = 3 mm
图2. 洞中叶片脉序，示网眼。比例尺 = 3 mm
Figure 3. Transverse-section of leaf (non-primary vein area) in entrance cave. Scale bar = 200 μm
图3. 洞口叶片非一级脉区横切片。比例尺 = 200 μm
Figure 4. Transverse-section of the primary vein area in entrance cave. Scale bar = 250 μm
图4. 洞口叶片一级脉区横切片。比例尺 = 250 μm
Figure 5. Transverse-section of the secondary vein area in middle cave. Scale bar = 200 μm
图5. 洞中叶片二级脉区横切片。比例尺 = 200 μm
Figure 6. Transverse-section of the primary vein area approach the leaf base in entrance cave. Scale bar = 200 μm
图6. 洞口叶片近叶基一级脉区横切片。比例尺 = 200 μm
Figure 7. Transverse-section of the primary vein area approach the leaf apex in entrance cave. Scale bar = 200 μm
图7. 洞口叶片近叶尖一级脉区横切片。比例尺 = 200 μm
Figure 8. Transverse-section of the secondary vein area in entrance cave. Scale bar = 200 μm
图8. 洞口叶片二级脉区横切片。比例尺 = 200 μm
Figure 9. Transverse-section of the tertiary vein area in middle cave. Scale bar = 200 μm
图9. 洞中叶片三级脉区横切片。比例尺 = 200 μm
Figure 10. Transverse-section of the fourth vein area in middle cave. Scale bar = 200 μm
图10. 洞中叶片四级脉区横切片。比例尺 = 200 μm
Table 1. Compare of P. tabacum leaves in different habitats
表1. 不同生境的报春苣苔叶片的比较
3.3. 报春苣苔叶片表皮解离结构
3.3.1. 报春苣苔成熟叶表皮解离结构
显微观察显示：报春苣苔叶片的上、下表皮均有表皮毛和腺毛。表皮毛为单列毛，基部的一个细胞增大明显，从基部到顶端逐渐变尖，大部分表皮毛由3~4个细胞组成(图20)；也发现少数表皮毛由5~6个细胞组成的(图21)；横切面切片可见：表皮毛在表皮上的毛基细胞多为1个，也有具2个的(图22)。腺毛分为双头腺毛(包括双头长柄腺毛和双头短柄腺毛)和单头腺毛(包括单头长柄腺毛和单头短柄腺毛)两类，均由基细胞、柄细胞和头细胞组成；横切面切片可见腺毛在表皮上的毛基细胞为1个(图23)。双头短柄腺毛，1个柄细胞，呈棒状，而头部均由2个细胞组成，呈二分叉的状态，顶端圆滑(图24)；双头长柄腺毛，有2个或2个以上柄细胞，近基细胞的柄细胞较长，可为其上一个柄细胞的两倍，呈棒状，或下粗上窄的；头部由2个细胞组成，呈二分叉的状态，顶端圆滑(图25)。单头腺毛为头部仅1个细胞，没有分叉；单头短柄腺毛，1个柄细胞(图26)；单头长柄腺毛，2个柄细胞。所有材料的上表皮都没有气孔器分布。气孔器分布在下表皮，多数气孔器为不等细胞型，有两个保卫细胞，呈肾形；在保卫细胞周围有3个副卫细胞环绕，形状不规则，其中一个较小，副卫细胞细胞壁边缘为波浪状(图27、图28)。
3.3.2. 不同生境下报春苣苔叶表皮解离结构的比较
不同生境下的报春苣苔叶片的解离结构，除了具有上述相同的结构外，还具各自的结构特点，见表2：
Figure 11. Leaf venation in entrance cave. Scale bar = 12 mm
图11. 洞口叶片脉序。比例尺 = 12 mm
Figure 12. Leaf venation in entrance cave. Showing the areole. Scale bar = 2.5 mm
图12. 洞口叶片脉序，示网眼。比例尺 = 2.5 mm
Figure 13. Leaf venation in middle cave. Scale bar = 12 mm
图13. 洞中叶片脉序。比例尺 = 12 mm
Figure 14. Leaf venation in middle cave. Showing the areole. Scale bar = 2.5 mm
图14. 洞中脉序，示网眼。比例尺 = 2.5 mm
Figure 15. Leaf venation in inner cave. Scale bar = 12 mm
图15. 洞内叶片脉序。比例尺 = 12 mm
Figure 16. Leaf venation in inner cave. Showing the areole. Scale bar = 2.5 mm
图16. 洞内脉序，示网眼。比例尺 = 2.5 mm
Figure 17. Transverse-section of leaf (non-primary vein area) in entrance cave. Scale bar = 200 μm
图17. 洞口叶片非一级脉区横切片。比例尺 = 200 μm
Figure 18. Transverse-section of leaf (non- primary vein area) in middle cave. Scale bar = 200 μm
图18. 洞中叶片非一级脉区横切片。比例尺 = 200 μm
Figure 19. Transverse-section of leaf (non-pri- mary vein area) in inner cave. Scale bar = 200 μm
图19. 洞内叶片非一级脉区横切片。比例尺 = 200 μm
Figure 20. The upper epidermis of leaf in entrance cave. Showing the epidermis hairs with 3 - 4 cells. Scale bar = 200 μm
图20. 洞口上表皮，示3~4个细胞表皮毛。比例尺 = 200 μm
Figure 21. The upper epidermis of leaf in inner cave. Showing the epidermis hairs with 5 cells. Scale bar = 50 μm
图21. 洞内上表皮，示5个细胞表皮毛。比例尺 = 50 μm
Figure 22. Transverse-section of leaf (non- primary vein area) in entrance cave. Showing the epidermis hairs and hairs basal cells. Scale bar = 200 μm
图22. 洞口叶片非一级脉区横切片，示表皮毛及毛基细胞。比例尺 = 200 μm
Figure 23. Transverse-section of leaf (non-primary vein area) in inner cave. Showing the glandular hairs and hairs basal cells. Scale bar = 200 μm
图23. 洞内叶片非一级脉区横切片，示腺毛及毛基细胞。比例尺 = 200 μm
Figure 24. The under epidermis of leaf in entrance cave. Showing the double headed short handle glandular hairs. Scale bar = 50 μm
图24. 洞口下表皮，示双头短柄腺毛。比例尺 = 50 μm
Figure 25. The under epidermis of leaf in inner cave. Showing the double headed long handle glandular hairs. Scale bar = 50 μm
图25. 洞内下表皮，示双头长柄腺毛。比例尺 = 50 μm
Figure 26. The under epidermis of leaf in entrance cave. Showing the single headed small handle glan- dular hairs. Scale bar = 200 μm
图26. 洞口下表皮，示单头短柄腺毛。比例尺 = 200 μm
Figure 27. The under epidermis of leaf in entrance cave. Showing the anomocytic type of stomatal apparatus. Scale bar = 50 μm
图27. 洞口下表皮，示无规则型气孔器。比例尺 = 50 μm
Figure 28. The under epidermis of leaf in entrance cave. Showing the anisocytic type of stomatal apparatus. Scale bar = 50 μm
图28. 洞口下表皮，示不等细胞型气孔器。比例尺 = 50 μm
Table 2. Compare of P. tabacum epidermis of leafs in different habitats
表2. 不同生境的报春苣苔叶表皮的比较
Figure 29. The upper epidermis of leaf in entrance cave. Scale bar = 300 μm
图29. 洞口上表皮。比例尺 = 300 μm
Figure 30. The under epidermis of leaf in entrance cave. Scale bar = 200 μm
图30. 洞口下表皮。比例尺 = 200 μm
Figure 31. The upper epidermis of leaf in middle cave. Scale bar = 200 μm
图31. 洞中上表皮。比例尺 = 200 μm
Figure 32. The under epidermis of leaf in middle cave. Scale bar = 200 μm
图32. 洞中下表皮。比例尺 = 200 μm
Figure 33. The upper epidermis of leaf in inner cave. Scale bar = 200 μm
图33. 洞内上表皮。比例尺 = 200 μm
Figure 34. The under epidermis of leaf in inner cave. Scale bar = 200 μm
图34. 洞内下表皮。比例尺 = 200 μm
Figure 35. The under epidermis of leaf in entrance cave. Showing the epidermis hairs with 3 cells. Scale bar = 200 μm
图35. 洞口下表皮，示3个细胞表皮毛。比例尺 = 200 μm
Figure 36. The under epidermis of leaf in middle cave. Showing the epidermis hairs with 4 cells. Scale bar = 200 μm
图36. 洞中下表皮，示4个细胞表皮毛。比例尺 = 200 μm
Figure 37. The upper epidermis of leaf in inner cave. Showing the epidermis hairs with 6 cells. Scale bar = 500 μm
图37. 洞内上表皮，示6个细胞表皮毛。比例尺 = 500 μm
4. 讨论
有研究表明，植物的表皮毛和腺毛主要是增加表皮厚度，保护叶片 [23] ；表皮毛可缓冲阳光直射，对强烈太阳光起漫射作用，防止水分蒸发，减少蒸腾作用；腺毛对食草昆虫、细菌和真菌病原体则存在化学防御作用，是植物次生代谢产物分泌的主要场所 [24] 。报春苣苔叶片上、下表皮均分布有腺毛和表皮毛。
Figure 38. The under epidermis of leaf in entrance cave. Showing the double headed short handle glandular hairs. Scale bar = 200 μm
图38. 洞口下表皮，示双头短柄腺毛。比例尺 = 200 μm
Figure 39. The upper epidermis of leaf in middle cave. Showing the double headed short handle glandular hairs. Scale bar = 200 μm
图39. 洞中上表皮，示双头短柄腺毛。比例尺 = 200 μm
Figure 40. The under epidermis of leaf in middle cave. Showing the single headed long handle glandular hairs. Scale bar = 50 μm
图40. 洞中下表皮，示单头长柄腺毛。比例尺 = 50 μm
腺毛以双头短柄腺毛为主；单头短柄腺毛、双头长柄腺毛在洞口偶见，而洞内的双头长柄腺毛数目较多。洞口的腺毛密度和表皮毛密度最大，洞中次之，洞内的腺毛密度和表皮毛密度最小，这些都与洞穴环境适应。缪绅裕等 [3] 研究表明，上柏场的岩洞，随着洞穴的深入，平均气温逐渐升高，相对湿度也愈来愈小，但洞内湿度变幅最大，洞内二氧化碳浓度较高，约是洞外的2倍。这就很好地表明随着洞穴深入，
Figure 41. The upper epidermis of leaf in middle cave. Showing the double headed long handle glandular hairs. Scale bar = 300 μm
图41. 洞中上表皮，示双头长柄腺毛。比例尺 = 300 μm
Figure 42. The upper epidermis of leaf in inner cave. Showing the double headed long handle glandular hairs. Scale bar = 300 μm
图42. 洞内上表皮，示双头长柄腺毛。比例尺 = 300 μm
Figure 43. The upper epidermis of leaf in inner cave. Showing the double headed long handle glandular hairs. Scale bar = 200 μm
图43. 洞内上表皮，示双头长柄腺毛。比例尺 = 200 μm
叶片腺毛密度和表皮毛密度逐渐变小，是报春苣苔叶片适应岩穴中不同生境条件的表现；而洞内环境的变化，洞内叶片也产生较洞中和洞口不同的一些腺毛类型。气孔器对植物的光合、呼吸、蒸腾等生理活动起着重要的调节作用 [24] 。本研究显示洞口处报春苣苔叶片表皮的气孔器密度最大，而且与洞中、洞内叶片表皮的气孔密度相差较大，洞内叶表皮的气孔密度最小，即随着洞穴的深入，叶片的气孔器密度逐
Figure 44. The upper epidermis of leaf in inner cave. Showing the double headed long handle glandular hairs. Scale bar = 200 μm
图44. 洞内上表皮，示双头长柄腺毛。比例尺 = 200 μm
Figure 45. The upper epidermis of leaf in inner cave. Showing the single headed long handle glandular hairs. Scale bar = 200 μm
图45. 洞内上表皮，示单头长柄腺毛。比例尺 = 200 μm
Figure 46. The under epidermis of leaf in entrance cave. Showing the anisocytic type of stomatal apparatus. Scale bar = 100 μm
图46. 洞口下表皮，示不等细胞型气孔器。比例尺 = 100 μm
渐变小，说明腺毛和表皮毛对叶片的保护及生长起到很大的作用，这都是报春苣苔叶片适应岩穴中不同生境条件的表现。
尽管洞内叶片叶肉细胞的叶绿体少、栅栏组织发育不完全，但其生境下高浓度的CO2有助于减少叶片因光呼吸的碳消耗，有利于维持光合产物的净积累，也与“生长在该环境下植物叶片绿色度处于很低
Figure 47. The under epidermis of leaf in middle cave. Showing the anisocytic type of stomatal apparatus. Scale bar = 50 μm
图47. 洞中下表皮，示不等细胞型气孔器。比例尺 = 50 μm
Figure 48. The under epidermis of leaf in middle cave. Showing anisocytic type of the stomatal apparatus. Scale bar = 50 μm
图48. 洞中下表皮，示不等细胞型气孔器。比例尺 = 50 μm
Figure 49. The under epidermis of leaf in inner cave. Showing anisocytic type of the stomatal apparatus. Scale bar = 50 μm
图49. 洞内下表皮，示不等细胞型气孔器。比例尺 = 50 μm
水平” [3] 的结论一致；“洞内材料三、四级叶脉维管束鞘具延伸，叶脉的分布密度较稀；栅栏组织发育不良，属阴性叶。洞口的叶脉分布较密，叶脉维管束无延伸，栅栏组织发育完整，排列整齐属阳性叶”的结果与其它种类的结果一致 [24] 。此外，表皮毛密度大、气孔器分布在下表皮，有助于防止水分的过度
Figure 50. The under epidermis of leaf in inner cave. Showing the anomocytic type of stomatal apparatus. Scale bar = 50 μm
图50. 洞内下表皮，示无规则型气孔器。比例尺 = 50 μm
蒸发。气孔器密度与光合作用也密切相关，强光下，高密度的气孔器具有较高的灵活性，有利于植物保持体内水分和有效地进行呼吸及光合气体交换 [16] ；这些特点与报春苣苔叶片的解剖特征吻合。
报春苣苔生长在我国南方海拔300 m以上的石灰岩上，与地表生态系统相比较，喀斯特洞穴生态系统有显著的脆弱性，洞穴内的物质能量循环趋近于封闭 [25] 。本研究的岩洞不同采样点的温度和相对湿度存在差异，洞内年均气温比洞口高，相对湿度则比洞口低且变幅大 [3] ，尽管洞穴深度不是很深，但叶片形态结构已经出现区别，说明报春苣苔叶片对自然生境的温度和湿度变化产生一定的适应性。报春苣苔在狭窄的分布范围，以及其特殊的生长环境、生长条件，再加上人类活动的影响，使其种群数量不断下降，分布面积也急剧减少，导致报春苣苔濒临灭绝 [7] 。所以开展对报春苣苔的研究是十分有必要的。
基金项目
广东省自然科学基金项目(S2012010009714)；广东省高等教育教学改革项目(GDJG20142263)。