1. 引言
子宫内膜癌(endometrialcarcinoma EC)是发生于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤，其发病机制至今不清。目前普遍认为子宫内膜癌的发生与子宫内膜长期受雌激素作用而缺乏孕激素拮抗有关 [1] 。肥胖、高血压、糖尿病、多囊卵巢综合征作为子宫内膜癌发生的相关危险因素越来越受到重视，这些因素共同病理生理特征是胰岛素抵抗和继发的高胰岛素血症 [2] 。有研究发现血管内皮生长因子(VEGF)，能够明显促进新生血管形成，在子宫内膜癌发生发展中发挥重要作用 [3] 。bFG与调控体内血管新生过程，其主要生物学效应是促进细胞增殖，增加血管的血液供应，从而提供大量营养物质促使肿瘤细胞快速增长 [4] 。bFGF与子宫内膜癌的发生有密切的关系 [5] 。我们旨在通过对子宫内膜癌细胞ER表达阳性Ishikawa细胞株中VEGF和bFGF的表达与雌激素、胰岛素的关系进行初步探讨，分析子宫内膜癌发生发展可能的分子机制。
2. 材料与方法
2.1. 材料来源
子宫内膜癌细胞系Ishikawa，来自于子宫内膜高分化腺癌，其雌激素受体(ER)表达阳性，购自于南京凯基生物技术公司。β雌二醇及胰岛素(牛来源)购自北京博奥拓达科技有限公司；胎牛血清、McCoy′s5A培养液、RPMI 1640培养液、胰蛋白酶消化液均购自于美国gibco公司；酶标仪E1808(BiTek)、流式细胞仪accuri C6(BD)、二氧化碳培养箱HF90(Heal force)、荧光定量PCR仪(Roche 480)；荧光定量引物由Primer 3在线设计：VEGFA-F AAGAGCGACCCTCACATCAA，VEGFA-R AAAGAAACACTCATCCGTAACAC，全长147 bp；bFGF-F GCTGTACTGCAAAAACGGGG，bFGF-R TAGCTTGATGTGAGGGTCGC全长94 bp，引物由上海生工合成。
2.2. 方法
2.2.1. Ishikawa增殖实验
1) 96孔板铺板：将稳定传代的Ishikawa细胞消化离心，计数，每孔加入细胞100 ul/孔(约1 × 104)。其中96孔边缘孔空出来，设置空白对照组1个(不加细胞不给药)，阴性对照组1个(有细胞不给药)，实验组各三个孔。放置二氧化碳培养箱培养24小时。
2) 细胞培养：吸去上清，3个实验孔加入200 ul含有β雌二醇的培养液，3个实验孔加入200 ul含有胰岛素的培养液，3个实验孔加入200 ul含有β雌二醇和胰岛素的培养液，阴性对照孔不加。其中配制的雌二醇浓度最终为10−8 mmol/l，胰岛素最终浓度10−8 mmol/l。
3) 四甲基偶氮唑蓝(MTT)：在24 h、48 h、72 h、96 h分别终止反应，吸去上清，每孔加入1 × MTT20 ul，80 ul的无血清培养液。37℃培养4小时。4小时后吸出上清每孔加入150 ul DMSO摇动混匀10 min，酶标仪上490 nm波长下测定各吸光度值。
4) 荧光定量PCR技术分别检测雌二醇、胰岛素、雌二醇 + 胰岛素作用后Ishikawa细胞中VEGF、bFGF基因的表达：TRIzol法提取各组细胞总RNA，利用RT试剂盒逆转录合成cDNA。VEGF基因引物序列，上游；5′-AAGAGCGACCCTCACATCAA-3′，下游：5′-AAAGAAACACTCATCCGTAACAC-3′，扩增产物片段147bp；bFGF基因引物序列，上游：5′-GCTGTACTGCAAAAACGGGG-3′，下游：5′-TAGCTTGATGTGAGGGTCGC-3′，扩增产物片段长度94 bp，PCR反应体系共20 ul，包括DNA荧光燃料SYBR Green 10 ul，PCR Forward Primer (10 μM) 0.8 μl，PCR Reverse Primer (10 μM) 0.8 μl，DNA模板(<100 ng) 2 μl，加水至20 μl。PCR反应条件：预变性95℃ 30 sec 1 cycle PCR 95℃ 5 sec，60℃ 30 sec 45 cycles 融解95℃ 5 sec，60℃ 1 sec， 95℃ 1 cycle 降温 50℃ 30 sec 1 cycle。采用2-△△CT法计算mRNA的表达水平。
2.2.2. 统计学方法
采用SPSS17.0软件进行统计学处理。计量资料以均数 ± 标准差(
± S)表示，多样本间的两两比较，采用单因素方差分析。
3. 结果
3.1. VEGF、bFGF在雌二醇，胰岛素，雌二醇 + 胰岛素中的表达情况
荧光定量PCR技术检测显示：雌二醇组细胞中VEGF基因表达自24 h至72 h远高于对照组，24小时表达差异极显著(p < 0.0001)，48 h和72 h表达差异极显著(p < 0.01)，96 h与对照组相比较，该基因表达呈下降趋势；胰岛素组细胞中VEGF基因表达呈持续升高趋势，与对照组比较，24 h、48 h升高趋势并不明显，但从72 h开始，与对照组比较，72 h、96 h表达升高趋势显著(p < 0.05)，见表1；雌二醇组细胞中bFGF基因在24 h、48 h、72 h和96 h表达均呈递增趋势，24 h、48 h表达略低于对照组，72 h、96 h高于对照组，其中72 h该基因表达与对照组比较差异显著(p < 0.05)，96 h该基因表达与对照组比较差异极显著(p < 0.01)；胰岛素组细胞中24 h bFGF表达相对于对照组，呈短暂抑制后升高，48 h与对照组比较差异显著(p < 0.05)，然后72 h、96 h呈下降趋势，但均高于各时间点对照组的表达水平；雌二醇 +胰岛素组细胞中bFGF在48 h、72 h、96 h表达水平均高于对照组，且72 h表达水平最高，差异有统计学意义(p < 0.05)。本研究显示结果显示：雌二醇，胰岛素，雌二醇+胰岛素均不同程度的诱导Ishikawa细胞中bFGF mRNA的表达，且在72小时表达最显著，见表2。
3.2. VEGF、bFGF基因在雌二醇 + 胰岛素组中表达与雌二醇、胰岛素组的比较
该研究结果显示：雌二醇 + 胰岛素组细胞中VEGF的表达与相同时间点雌二醇、胰岛素组中VEGF的表达比较无明显增高，差异没有统计学意义(p > 0.05)；雌激素+胰岛素组细胞中bFGF的表达与相同时间点雌二醇、胰岛素组中bFGF的表达比较无明显增高，差异没有统计学意义(p > 0.05)，见图1，图2。
Table 1. The comparison of VEGFmRNA expression level in every group Ishikawa cells (± S)
表1. 各组Ishikawa细胞中VEGFmRNA表达水平的比较(
± S)
注：*与对照组比较p < 0.05。
Table 2. The comparison of bFGFmRNA expression level in every group Ishikawa cells (± S)
表2. 各组Ishikawa细胞中bFGFmRNA表达水平的比较(
± S)
注：*与对照组比较p < 0.05。
Figure 1. The VEGF gene expression in different dealing groups (mean ± SD, n = 3)
图1. 不同处理组VEGF基因表达情况(mean ± SD, n = 3)
Figure 2. The bFGF gene expression in different dealing groups (mean ± SD, n = 3)
图2. 不同处理组bFGF基因表达情况(mean ± SD, n = 3)
4. 讨论
子宫内膜癌是一个多基因参与的渐进性发展疾病，主要是由于抑癌基因与癌基因之间失去平衡，抑癌基因缺失、突变失活导致细胞增殖失去控制并且多个癌基因的编码蛋白过度表达而出现异常激活，从而导致细胞出现恶性转变，具体机制尚不清楚 [4] [6] 。血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是子宫内膜癌重要的细胞因子，参与调控体内血管新生过程，其主要生物学效应是促进细胞增殖、刺激血管内皮细胞迁移和促进血管生成，增加血管的血液供应，从而提供大量营养物质促使肿瘤细胞快速增长 [5] 。
目前，肥胖、糖尿病、高血压是公认的子宫内膜癌的三大高危因素，肥胖是首要危险因素。流行病学研究表明子宫内膜癌的发生与肥胖有关，子宫内膜癌患者中40%~50%为过度肥胖。体重指数(BMI)是衡量肥胖的指标，成人超重和肥胖的体重指数WHO标准为：BMI正常值为18.5~24.9，25~27.9为超重，>30为肥胖。肥胖，糖尿病，高血压的共同的病理生理基础为胰岛素抵抗及高胰岛素血症。国际多项研究证实子宫内膜癌的发病风险直接与C肽和胰岛素水平呈正相关。胰岛素和胰岛素抵抗在肿瘤的形成和恶性转化阶段起重要作用。胰岛素可促进性激素的合成，同时可降低性激素结合球蛋白的水平，从而使雌激素和其他促肿瘤因子的水平增高，促进肿瘤生长。同时，胰岛素可激活胰岛素受体的酪氨酸激酶生长受体通路，进一步引起下游的信号通路的激活，促进肿瘤细胞的增殖。
肿瘤细胞增殖及血管形成是在多种生长因子调控下完成的，肿瘤的血管生成主要由肿瘤细胞产生的某些血管生长因子诱导，VEGF和bFGF是目前人们关注较多的促血管生长因子。VEGF又名血管通透因子，是一种内皮细胞有丝分裂原，同时能诱导血管通透性增加，导致血浆蛋白外渗到血管外间隙，形成富于纤维的基质，诱导内皮细胞等的增生，最后形成高度血管化的间质。雌激素可通过非基因转录效应诱导子宫内膜癌细胞产生VEGF、bFGF，促进子宫内膜癌发生发展，而胰岛素与VEGF、bFGF表达关系相关研究较少。本研究结果显示：雌二醇，胰岛素，雌二醇+胰岛素对Ishikawa细胞中VEGF、bFGF均有不同程度促进表达作用。雌二醇组细胞中VEGF在24小时表达差异极显著(p < 0.0001)，48 h和72 h表达差异极显著(p < 0.01)；胰岛素组细胞中VEGF基因表达呈持续升高趋势，与对照组比较72 h、96 h表达升高趋势显著(p < 0.05)；雌二醇组细胞中bFGF基因在24 h、48 h、72 h和96 h表达均呈递增趋势，其中72 h该基因表达与对照组比较差异显著(p < 0.05)，96 h该基因表达与对照组比较差异极显著(p < 0.01)；胰岛素组细胞中24 h bFGF表达相对于对照组，呈短暂抑制后升高，48 h与对照组比较差异显著(p < 0.05)，然后72 h、96 h呈下降趋势，但均高于各时间点对照组的表达水平；雌二醇 + 胰岛素组细胞中bFGF在48 h、72 h、96 h表达水平均高于对照组，且72 h表达水平最高，差异有统计学意义(p < 0.05)。
雌激素、胰岛素诱发子宫内膜癌细胞产生的VEGF、bFGF，通过调控体内血管新生，刺激血管内皮细胞迁移和促进血管生成，增加血管的血液供应，从而提供大量营养物质促使肿瘤细胞快速增长，促进子宫内膜癌发生、发展。肥胖、高血压、糖尿病、多囊卵巢综合征，作为子宫内膜癌的高危因素，其共同病理生理特征是胰岛素抵抗和继发的高胰岛素血症，由此可以推测这些高危因素促进子宫内膜癌的发生发展与胰岛素促进VEGF、bFGF产生有关，VEGF、bFGF可能为子宫内膜癌高危因素向内膜癌发展过程中的一个重要的分子机制。
综上所述，本研究探讨了子宫内膜癌发生发展可能的分子机制，雌激素、胰岛素通过诱导子宫内膜癌ER表达阳性细胞株VEGF、bFGF基因表达，促进了子内膜癌的发生、发展，本研究对临床该病的防治提供了相关的基础支持。
基金项目
本项目获得宁夏自然科学基金(NZ14169)资助。
*通讯作者。