1. 引言
小儿脑性瘫痪是目前小儿时期最主要的运动功能伤残疾病，且终生存在。近年来脑瘫的发生率无明显降低，在某些地区甚至有上升的趋势。其主要病因是由于早产、产伤、围产期窒息及核黄疸等原因造成脑组织的缺血缺氧。在新生儿期尤其是出生后一个月内，脑白质极易因脑缺血缺氧而受损 [1] 。
神经系统的功能单位–神经元，在缺血缺氧损伤后不可再生，从而严重影响神经功能。对于脑瘫的治疗，人们采用了各种办法和手段，目前尚无较好的治疗方法。目前，已有报道采用干细胞移植治疗huntington病、帕金森症、脑卒中后遗症等。近期，有学者研究表明NSCs的早期干预治疗有希望成为临床治疗HIE的重要手段。NSCs作为新生神经细胞的“种子”，具有的免疫豁免性、良好的融合和迁徙能力，为中枢神经的再生性治疗和基因治疗提供了可能。NSCs所具有的这种迁徙能力使它得以通过直接移植到脑脊液循环中，在进一步迁徙整合过程中参与神经结构和功能的修复与重建 [2] 。经侧脑室穿刺法移植的NSCs由于直接突破血脑屏障，并与宿主细胞在形态和功能上形成良好的整合，因此是一个干细胞移植的有效途径。经腰椎穿刺法移值NSCs在理论上具有同样的效果，而后者可能是将来临床干细胞移植更为实用、简洁的有效途径 [3] 。本实验建立缺血、缺氧性脑损伤的动物模型并将将神经干细胞注入缺血缺氧鼠损伤侧大脑的侧脑室，证明了其神经电生理得到明显改善，为日后神经干细胞移植治疗小儿脑瘫的治疗提供了依据。
2. 材料
2.1. 实验动物
健康7日龄Wistar大鼠40只，清洁级，雌雄不限，体重13.75 ± 0.35 g购自新疆医科大学实验动物中心，许可证号FCXK (新) 2003-0001。本实验研究符合动物保护委员会标准要求，实验中尽可能减少使用动物的数量和减轻动物的痛苦。
2.2. 实验药品
异氟醚吸入麻醉剂DMEM/F12无血清专用培养基、小牛血清1.2.4碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子EGF、青霉素/链霉素、B27无血清添加物、L2谷胺酰胺。
2.3. 实验器材
国产手术显微镜、显微手术器械、动物缺氧箱、智能氧量分析仪、小鼠立体定位仪、微型磨钻、微量注射泵、微量进样器(10 UL)、Nicolet EDX肌电诱发电位仪。
3. 方法
3.1. 实验分组
随机分为两组：NSCs组(n ＝ 20) HIE组(n ＝ 20)。
NSCs组：生后7天Wistar大鼠麻醉条件下行左侧颈总动脉双重结扎并离断，置于缺氧环境中缺氧3小时；3天后进行神经干细胞移植。
HIE组：生后7天Wistar大鼠麻醉条件下行左侧颈总动脉双重结扎并离断，置于缺氧环境中缺氧3小时；中途脱落12只，最终移植组11只，对照组17只进入评估。
3.2. 模型的制作
3.2.1. 神经干细胞的制备
将E14孕鼠乙醚麻醉后打开腹腔切取子宫，夹取胎鼠双侧大脑皮层组织，用D-Hanks液冲洗。将脑组织剪成1.0 mm3小块，吸管吹打成单细胞悬液。室温25℃1000 r/min下离心5 min，弃上清，1 × 106/4 mL密度置条件培养基中培养。
3.2.2. HIE大鼠模型的制作
选用出生后第7天Wistar大鼠，异氟醚吸入麻醉，显微镜下行颈正中纵切口，分离颈总动脉与迷走神经后以6~0丝线双重结扎颈总动脉并离断，缝合皮肤切口。术后麻醉恢复2小时后根据经验放置于混合8%氧 + 92%氮气缺氧箱中3小时。
3.2.3. HIE大鼠神经干细胞移植模型的制作
NSCs组：选用出生后第7天Wistar大鼠，麻醉后结扎颈总动脉并离断，缝合皮肤切口。术后麻醉恢复2小时后放置于混合8%氧 + 92%氮气缺氧箱中3小时。术后3天进行神经干细胞移植。将2 μL移植液移植液缓缓注入新生大鼠的左侧侧侧脑室内，注射完毕后留针2 min后取出，骨蜡封闭注射针口。待新生大鼠苏醒后送返母鼠旁继续喂哺。
3.3. 评价方法：运动诱发电位检测
术后3周对两组大鼠分别进行股四头肌复合肌肉运动诱发电位(Compound Muscle Action Potential, CMAP)检测。具体如下：大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.4 ml/100g体重，顶部皮肤去毛，碘酒、乙醇消毒，顶正中矢状切开头皮，推开骨膜，暴露冠状缝与矢状缝，以冠状缝后3 mm，中线旁开2 mm为刺激中心点，保持局部颅骨湿润。双极刺激电极刺激大脑皮层运动区表面颅骨，刺激强度2 mA~10 mA，波宽0.1 ms，单次刺激。针状记录电极置于股四头肌内。参考电极置于同侧胫前肌内，滤波30 Hz~300 Hz，灵敏度5 µV，重复1~5次。接地电极置于尾根部。记录电位，寻找最大波幅刺激强度，分析MEP第一个向上的负波的波幅及峰潜伏期。
3.4. 统计方法
所有数据采用均数 ± 标准差(x ± s)表示，SPSS17.0软件进行统计分析，采用两独立样本的t检验进行组间的统计学比较，检验水准α = 0.05。
4. 结果
术后3周组移植鼠后肢CMAP波幅为13.070 ± 3.015 MV，大于对照组HIE4.074 ± 0.910 MV，统计学处理后认为差异有统计学意义(P < 0.01)；术后7周移植组实验鼠后肢CMAP波幅为24.030 ± 2.884 mv，大于实验组2.021 ± 0.542 mv，统计学处理后认为差别有统计学意义(P < 0.01)。如表1所示：术后3周、7周移植组后肢MEP与对照组HIE组相比，波幅明显增高。
5. 讨论
脑室周围白质软化症是新生儿缺血缺氧性脑病最常见的脑损伤类型，主要引起脑室周围白质的少突胶质细胞受损，纤维束损伤，导致去髓鞘病变，是造成脑瘫等神经系统后遗症的主要原因 [4] [5] ，迄今对早产儿PVL尚无防治良策。外源性NSCs的移植研究进展，为早产儿脑室周围白质软化症的治疗提供了新的思路 [6] [7] 。脑瘫治疗后疗效的评价指标包括行为学的改善，神经电生理的变化，以及病理的改善。其中神经电生理是评价指标中比较客观、微创、利于临床应用的方法。也正因为如此，目前最常用、经典的指标之一是神经电生理功能检测，运动诱发电位能直接反映外周运动神经的功能状态 [8] 。近年来神经干细胞移植的实验研究开始增多，逐渐将神经电生理的功能检测运用到实验评价指标中。郭世磊等将种植非神经干细胞性成体干细胞源性神经元细胞构建的组织工程化神经移植于鼠、犬外周神经损伤缺损模型中，发现非神经干细胞性成体干细胞源神经元细胞，可以在外周神经微环境中存活、增殖、形成突触联系，促进了神经功能的修复。何珏等 [9] 研究发现骨髓间充质干细胞移植后脊髓损伤大鼠的运动诱发电位和体感诱发电位恢复较为显著，波幅增高。移植后第5周微弱的复合肌肉动作电位(CAMP)出现，CAMP的波幅随手术恢复时间的延长而逐步增大，两者具有线性相关关系。王玉成等 [10] 对脊髓损伤大鼠进行许旺细胞联合C5a受体拮抗剂移植后发现后肢运动功能评价联合移植组优于对照组。联合组大鼠体感诱发电位及运动诱发电位的潜伏期、波幅明显优于其他组，提示许旺细胞移植和C5a受体拮抗剂联合应用可促进脊髓损伤大鼠神经突触的再生，改善其肢体运动功能和电生理功能。王广志等 [11] 研究证实接受嗅鞘细胞移植脊髓损伤大鼠体感诱发电位及运动诱发电位的潜伏期、波幅明显优于对照组，细胞移植组大鼠BBB后肢运动功能评分较对照组明显提高。本实验观察并探讨了大脑缺血缺氧损伤后运动诱发电位(motorevoked potential, MEP)的变化。对两组实验鼠后肢进行了MEP检测。MEP是指应用电或磁刺激皮层运动区，产生兴奋，通过下行传导径路，使脊髓前角细胞去极化，在相应外周神经或肌肉表面记录到的电位结果显示，术后3周、7周移植组实验鼠后肢MEP与对照组相比，波幅明显升高，达到最大
Table 1. CMAP of rats in two groups were compared between 3 weeks and 7 weeks after operation
表1. 两组实验鼠术后3周、7周大鼠CMAP比较
波幅所需刺激强度也相应降低，进一步说明移植后实验鼠的神经传导性得到提，改善了脑瘫模型鼠肢体运动的功能，这一结果与行为学预期结果相符。本实验将神经干细胞注入缺血缺氧鼠损伤侧大脑的侧脑室，证明了其神经电生理得到明显改善，为日后神经干细胞移植治疗小儿脑瘫的治疗提供了依据。