冬凌草甲素对Bcap-37细胞生长的抑制作用

The Inhibition Effects of Oridonin on Bcap-37 Cells

摘要: 研究冬凌草甲素对Bcap-37细胞生长的抑制作用。MTT法检测冬凌草甲素对Bcap-37细胞生长的抑制作用，RT-PCR检测Bcl-2和Bax mRNA的表达。研究结果表明冬凌草甲素对Bcap-37细胞生长具有显著的抑制作用，且呈时间和剂量依赖性。冬凌草甲素作用Bcap-37细胞24 h，Bcl-2的mRNA表达显著降低，Bax的mRNA表达显著增加(p < 0.05)。

Abstract: To investigate the effects of oridonin on Bcap-37 cells, MTT was used to measure the inhibition effects of oridonin on Bcap-37 cells and RT-PCR was used to measure the Bcl-2 and Bax mRNA expression. Our results showed the inhibition effects of oridonin on Bcap-37 cells by time- and dose-dependent manner. Bcl-2 mRNA expression decreased and Bax mRNA expression increased by oridonin treatment for 24 hours (p < 0.05).

1. 引言

冬凌草甲素(oridonin, ORI)是从冬凌草中提取的一类四环二萜类化合物，具有抗病毒、抗炎、抗肿瘤等多种药理活性 [1] 。近年来人们对其研究的重点集中在其抗肿瘤活性上，发现其对多种实体瘤如肝癌、食管癌、乳腺癌、前列腺癌等有效果。目前，冬凌草甲素在抗乳腺癌方面的作用尤为显著。冬凌草甲素可以诱导人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞发生凋亡 [2] [3] 。本文将探讨冬凌草甲素作为一种潜在的抗乳腺癌制剂，对乳腺癌细胞Bcap37的作用。

2. 材料与方法

2.1. 细胞与试剂

乳腺癌细胞株Bcap-37购自中科院上海细胞生物学研究所。冬凌草甲素购自成都普思生物科技有限公司。RPMI1640购于Gibco公司。小牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所。

2.2. 方法

2.2.1. 细胞培养

细胞用含10%小牛血清的RPMI1640培养液， 37 ℃ 、5% CO₂培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。

2.2.2. MTT 法检测细胞增殖活力

将生长状态良好的Bcap-37细胞以1.0 × 10⁴个/孔的密度传代培养于96孔板中，待细胞贴壁后，每板按照分组加入含不同浓度冬凌草甲素的完全培养液，使其终浓度为0、10、20、40 μM，每组5个复孔，并设置调零孔，继续分别培养12、24和48小时。并于培养后12、24、48 h时，取出培养板，每孔加入20 μL浓度为5 mg∙mL⁻¹的MTT溶液，培养箱中继续孵育4 h，弃去培养液，每孔加入100 μl DMSO，震荡溶解沉积在孔底的蓝紫色结晶，并在10 min内于570 nm波长处检测各孔吸光度值(A570)，并计算细胞活力：细胞活力(%) = (加药组A570 − 空白组A570)/(对照组A570 − 空白组A570) × 100%。实验独立重复3次。

2.2.3. 实时PCR 检测Bcl-2和Bax的mRNA水平

用Trizol法提取总RNA，A260/A280比值为1.8~2.0，经逆转录反应合成cDNA。然后利用SYBR荧光实时PCR法检测Bcl-2和Bax mRNA相对表达量。实验所用引物均由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。以β-actin为内参照基因，β-actin引物序列：上游，5'-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3'；下游，5'-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3'。Bcl-2引物序列：上游， 5'-ATCGCCCTGTGGATGACTGAG-3'；下游，5'-CAGCCAGGAGAAATCAAACAGAGG -3'。Bax引物序列：上游，5'-GGACGAACTGGACAGTAACATGG-3'；下游，5'-GCAAAGTAGAAAAGGGCGACAAC-3'。反应体系为10 μl，包含Power SYBR Green PCR Master Mix 5 μl，上游引物0.2 μl，下游引物0.2 μl，cDNA 模板0.5 μl，ddH₂O 4.1 μl。反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，58℃退火45 s，40个循环。每个样本设3个复孔，同时设无模板阴性对照。反应结束后，各个样本的Ct值分别取平均数。以对照组的靶基因表达量为1，2-ΔΔCt即为实验组相对对照组靶基因表达的倍数。

2.3. 统计学处理

采用SPSS13.0 统计软件处理实验数据，数据均以−x + s表示，组间均值比较采用单因素方差分析。P < 0.05 认为统计学有显著差异。

3. 结果

3.1. 冬凌草甲素对乳腺癌Bcap37细胞生长的抑制作用呈剂量依赖性

观察10，20，40 μM冬凌草甲素对乳腺癌细胞株Bcap37细胞存活的作用。取对数期生长的乳腺癌MCF-7细胞消化后加入96孔板，调节细胞密度为10,000个每孔，5%CO₂， 37 ℃ 孵育过夜。移除培养基，每孔加入用培养基配制的浓度梯度药物100 μl，每个药物浓度设置5复孔。5%CO₂， 37 ℃ 孵育24小时，倒置显微镜下观察。避光条件下，每孔加入20 μl MTT溶液，5%CO₂， 37 ℃ 孵育4小时后移除含MTT的培养基。每孔加入100 μl二甲基亚砜，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪，在570 nm波长处测量各孔吸光值，计算细胞增殖活力。结果显示，冬凌草甲素作用24小时可明显抑制Bcap37人乳腺癌细胞株的增殖，且呈现明显的剂量依赖性(图1)。

3.2. 冬凌草甲素对乳腺癌细胞株Bcap37细胞的抑制作用呈时间依赖性

观察40 μM冬凌草甲素对乳腺癌细胞株Bcap37细胞的作用。取对数期生长的乳腺癌MCF-7细胞消化后加入96孔板，调节细胞密度为10,000个每孔，5%CO₂，37℃孵育过夜。移除培养基，每孔加入用培养基配制的浓度梯度药物100 μl，每个药物浓度设置5复孔。5%CO₂， 37 ℃ 分别孵育12，24和48小时，

Figure 1. The inhibition of oridonin on Bcap37 cells shows dose-dependence

图1. 冬凌草甲素对乳腺癌细胞Bcap37生长的抑制作用呈剂量依赖性(*P < 0.05)

倒置显微镜下观察。避光条件下，每孔加入20 μl MTT溶液，5%CO₂，37℃孵育4小时后移除含MTT的培养基。每孔加入100 μl二甲基亚砜，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪，在570 nm波长处测量各孔吸光值，计算细胞活力。结果显示，作用12，24和48小时后，冬凌草甲素可明显抑制Bcap37人乳腺癌细胞株的增殖，且呈现明显的时间依赖性(图2)。

3.3. 冬凌草甲素(Oridonin)对Bcap37细胞Bcl-2 mRNA的抑制作用

取对数生长期的乳腺癌细胞，消化并接种于无菌培养瓶中。以不同浓度的冬凌草甲素处理24小时后，收集细胞，用ABI PRISM^® 6100 Nucleic Acid PrepStation试剂盒提取细胞总RNA。总RNA的质量和完整性用分光亮度计在260 nm/280 nm下分析。等量的RNA用SuperScript^TM III First-Strand Synthesis System在Gene Amp^® PCR System 9700反转录为cDNA。扩增反应在PCR扩增仪上进行。用β-actin作为内参定量。检测Bcl-2 mRNA的表达含量。本实验研究发现冬凌草甲素作用于Bcap37细胞24小时，随药物浓度的升高，Bcl-2 mRNA的表达逐渐下降(图3)。

3.4. 冬凌草甲素(Oridonin)对Bcap37细胞Bax mRNA的调节作用

取对数生长期的乳腺癌细胞，消化并接种于无菌培养瓶中。以不同浓度的冬凌草甲素处理24小时后，收集细胞，检测Bax mRNA的表达含量。本实验研究发现冬凌草甲素作用于Bcap37细胞24小时，随药物浓度的升高，Bax mRNA的表达上调。由此可推断冬凌草甲素对人乳腺癌Bcap37细胞的抑制作用可能是通过抑制Bcl-2的表达和增强Bax的表达诱导细胞凋亡(图4)。

Figure 2. The inhibition of oridonin on Bcap37 cells shows time-dependence

图2. 冬凌草甲素对乳腺癌细胞Bcap37生长的抑制作用呈时间依赖性(*P < 0.05)

Figure 3. The effects of oridonin on Bcl-2 mRNA expression of Bcap37 cells

图3. 冬凌草甲素对Bcap37细胞Bcl-2 mRNA的调节作用(*P < 0.05)

Figure 4. The effects of oridonin on Bax mRNA expression of Bcap37 cells

图4. 冬凌草甲素对Bcap37细胞Bax mRNA的调节作用(*P < 0.05)

4. 讨论

本研究发现冬凌草甲素对Bcap-37细胞生长具有显著的抑制作用，且呈时间和剂量依赖性。冬凌草甲素作用Bcap-37细胞24 h，Bcl-2的mRNA表达显著降低，Bax的mRNA表达显著增加。由此推断冬凌草甲素对人乳腺癌Bcap37细胞生长的抑制作用可能是通过抑制Bcl-2的表达和增强Bax的表达诱导细胞凋亡。

冬凌草甲素在抗乳腺癌方面的作用已有大量报道。崔桥等发现，冬凌草甲素诱导人乳腺癌MCF-7细胞发生凋亡 [4] 。朱仁书等发现，冬凌草甲素可显著抑制MCF-7细胞的生长及诱导细胞发生凋亡，并呈现出一定的剂量–效应与时间–效应关系 [2] 。江永青等通过体外实验证实冬凌草甲素可通过激活Caspase途径，下调抑制凋亡基因Bcl-xl的表达，同时上调促进凋亡基因Bid及caspase3的表达，进而诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231的凋亡 [3] 。彭延延等通过体外实验表明冬凌草甲素通过下调MMP-2和MMP-9明显抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的侵袭 [5] 。汪茗等研究表明冬凌草甲素可通过调控PI3K/Akt通路，抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞中PI3K的活性，使下游p-Akt、p-GSK3β蛋白表达降低，进而诱发细胞凋亡 [6] 。岳静发现冬凌草甲素对乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制作用呈时间依赖性、浓度依赖性；冬凌草甲素阻滞MCF-7细胞于G2/M期,且可诱导其凋亡；冬凌草甲素可下调wnt4、GSK3β-catenin的表达 [7] 。李秀才发现冬凌草成分冬凌草素乙和冬凌草素甲诱导乳腺癌MCF-7细胞停滞于S/G2/M期，减慢G1/S期进程 [8] 。李瑞芳发现在一定的浓度范围内，冬凌草甲素可下调K562细胞的端粒酶活性。同时细胞周期各时相分布发生变化，G0/G1期或G2/M期细胞增多，S期细胞减少 [9] 。

余越美等研究发现冬凌草甲素可以诱导乳腺癌细胞Bcap-37发生凋亡，其可能与Survivin和GADD34的调控相关 [10] 。杜海爽等研究发现冬凌草甲素可抑制乳腺癌Bcap-37细胞的增殖，该作用可能与p21mRNA表达上调及cdc、cyclin B1 mRNA表达下调有关 [11] 。本研究也发现冬凌草甲素对Bcap-37细胞生长具有显著的抑制作用，且呈时间和剂量依赖性。同时我们的研究结果也表明冬凌草甲素对人乳腺癌Bcap-37细胞生长的抑制作用可能是通过抑制Bcl-2的表达和增强Bax的表达诱导细胞凋亡。

基金项目

浙江省自然科学基金项目(LQ13H280002)，河南省基础与前沿技术研究计划项目(142300410388，132300410048)，宁波市自然科学基金( 2015A 610234)。