羊栖菜岩藻甾醇提取物的抗氧化生物活性研究

Antioxidant Activities of Fucosterol Extract from Sargassum fusiforme

摘要: 研究了羊栖菜岩藻甾醇提取物的抗氧化生物活性。实验以VC和BHT作为阳性对照，分别对三种物质的总还原力、•DPPH自由基、 自由基以及•OH自由基进行了测定。结果表明：在20~200 µg/mL的实验浓度范围内，羊栖菜岩藻甾醇提取物表现出较好的抗氧化活性。 The antioxidant activity of fucosterol extract was assessed through the determination of •DPPH,   and •OH radical scavenging rate and compared with VC and BHT. The results show that fu-costerol extract from Sargassum fusiforme has good anti-oxidant activity in the concentration range of 20 - 200 µg/mL.

1. 引言

羊栖菜(Sargassum fusiforme)隶属褐藻门马尾藻科，是一种暖温带–亚热带性海藻，适宜生长于海水透明度较高、营养盐量丰富的海域。在我国，北至辽东半岛，南至闽粤沿海，其均有分布，其中尤以浙闽海域为盛；在日本、韩国以及朝鲜部分海域亦有分布 [1] [2] [3] 。抗氧化剂在日常生活中的应用愈发广泛，人工合成的抗氧化剂所导致的副作用日益凸显，天然抗氧化剂因其绿色、安全的优点而噬待开发。据相关文献报道，岩藻甾醇具有较强的抗氧化性 [4] 。本实验通过总还原力、·DPPH自由基清除率、 $\cdot {\text{O}}_2^{-}$ 自由基清除率以及·OH自由基清除率对岩藻甾醇提取物的抗氧化活性进行初步探索，为后期其他天然抗氧化剂的研究开发提供一定的理论依据 [5] [6] 。

2. 材料与方法

2.1. 材料与试剂

新鲜羊栖菜购买于浙江省温州市洞头县，查阅《中国药典》相关规定，将羊栖菜湿样用清水冲洗，以去除泥沙，切碎，置于55˚C真空烘箱中恒温烘干至恒重，然后研制成粉末状，密封，在避光低温条件下储藏备用。·DPPH、VC、BHT、 $\cdot {\text{O}}_2^{-}$ 、·OH购于阿拉丁试剂公司。其它化学试剂均购自杭州汇谱化工有限公司。

2.2. 仪器

Milli-Q超纯水装置，美国MILLIPORE公司；Evolution 60S紫外可见光分光光度计，美国Themo Fisher公司；iMARK酶标仪，美国Bio-Rad公司。

2.3. 实验方法

2.3.1. 羊栖菜岩藻甾醇粗提物的制备

称量约150 g的羊栖菜干粉，以甲醇–二氯甲烷(1:1, v/v)进行热回流提取，回流液经自然冷却后于高速冷冻离心机中以5000 rpm离心10 min (室温)，取上清液后旋转蒸发，获得羊栖菜岩藻甾醇粗提物5.86 g，将岩藻甾醇提取物样品以95%乙醇进行溶解，配制成浓度分别为20 µg/mL、40 µg/mL、80 µg/mL、100 µg/mL、150 µg/mL、200 µg/mL的样品溶液。

2.3.2. 总还原力的测定

物质的总还原力是其潜在抗氧化性的标志。抗氧化剂因自身的还原能力而给出电子从而实现自由基的清除，总还原力越强，抗氧化性越强。因此通过总还原力的测定可以说明其抗氧化活性的强弱。岩藻甾醇提取物总还原力的测定参考相关文献 [7] 并稍作改动，具体实验操作如下：取各浓度样品溶液0.5 mL，向其中分别加入0.2 mol/L PBS缓冲液(pH = 6.6)和1% K₃Fe(CN)₆各1.25 mL，待其混合均匀后，于50˚C恒温水浴锅中反应20 min。取出后，加入1.25 mL 10%的三氯乙酸，混匀后以1000 rpm离心10 min。取上清液2.5 mL，并加入2.5 mL 95%乙醇以及1 mL 0.1%的FeCl₃，混匀后测定其在700 nm下的吸光度。以VC、BHT重复上述实验作为阳性对照。为减小误差，各浓度样品均平行测定3次，取平均值。样品吸光度至越大，表明其总还原力越强。

2.3.3. ·DPPH自由基清除能力的测定

DPPH是以氮为中心的自由基，性质非常稳定，自身呈紫色，其在517 nm下有强烈的吸收。当待测物具有降低烷基自由基、过氧化自由基、羟基自由基及切断脂质过氧化反应等能力时，表明该待测物也具有清除·DPPH自由基能力。样品中氢与·DPPH相结合即·DPPH自由基中孤电子被配对时，其颜色由紫色逐渐变为黄色，直至反应结束，相应地，其在517 nm处的吸光度也逐步降低。因此可以通过吸光度的测定检验物质的清除·DPPH自由基的能力，进而为该物质的抗氧化能力给出参考 [8] 。

准确量取1 mL 1 × 10⁻⁴ mol/mL ·DPPH乙醇溶液，向其中加入1 mL样品溶液，混匀，氮气保护下，于暗处反应40 min后，用95%乙醇做参比液，测定反应体系在517 nm处的吸光度A_i；同时测定517 nm处1 mL ·DPPH溶液与等体积95%乙醇混合液的吸光度A_c及1 mL岩藻甾醇样品溶液与等体积乙醇95%混合液的吸光度A_j。以VC、BHT重复上述实验作为阳性对照。各浓度岩藻甾醇提取物样品溶液均平行测定3次，·DPPH自由基清除率的计算公式如下：

$·\text{DPPH}自由基清除率\left(\%\right)=\left[1-\left(A_i-A_j\right)/A_c\right]\times 100\%$ (1)

其中：

A_c—1 mLDPPH溶液加1 mL乙醇的吸光度；

A_j—1 mL样品溶液加1 mL乙醇的吸光度；

A_i—1 mL样品溶液加1 mL DPPH的吸光度。

2.3.4. $\cdot O_2^{-}$ 自由基清除能力的测定

超氧阴离子( $\cdot {\text{O}}_2^{-}$ )是氧类自由基的基础，具有转化成其他自由基的能力。作为机体内存活时间最久的自由基，超氧阴离子自由基可以引发自由基链式反应，从而生成活性相对更强的自由基。由于超氧阴离子自由基具有较强的扩散性及靶向性，从而对机体造成多种伤害：钝化机体内SOD酶及含-SH的酶；氧化机体内抗坏血酸等。因此对 $\cdot {\text{O}}_2^{-}$ 自由基的有效清除将极大地降低氧自由基的产生量 [9] 。

实验原理：邻苯三酚自氧化法。具体操作如下：将4.5 mL 0.05 mol/L Tris-HCl (pH = 8.2)于25˚C恒温水浴中预热20 min后，分别向其中加入1 mL岩藻甾醇提取物样品溶液和0.4 mL 25 nmol/L邻苯三酚溶液，混匀并于25˚C水浴中准确反应5 min，立即向其中加入2滴8 mol/L的HCl以终止反应。在波长320 nm处，测定反应体系的吸光度A_i；另在预热20 min的Tris-HCl (pH = 8.2)中加入1 mL样品溶液和0.4 mL 95%乙醇，混匀后于25˚C水浴中准确反应5 min后，于320 nm测其吸光度A_j；在预热20 min Tris-HCl (pH = 8.2)中加入1 mL乙醇和0.4 mL 25 nmol/L邻苯三酚混匀后于25˚C水浴中准确反应5 min，作为对照，于320 nm测其吸光度A_c。以VC、BHT重复上述实验作为阳性对照。岩藻甾醇提取物 $\cdot {\text{O}}_2^{-}$ 自由基清除率的计算公式如下：

$\cdot {\text{O}}_2^{-}自由基清除率\left(\%\right)=\left[1-\left(A_i-A_j\right)/A_c\right]\times 100\%$ (2)

其中：

A_i—样品溶液加邻苯三酚溶液的吸光度；

A_j—样品溶液加乙醇的吸光度；

A_c—邻苯三酚溶液加乙醇的吸光度。

2.3.5.·OH自由基清除能力的测定

羟自由基(·OH)是机体内最为活泼的自由基，其可以通过解聚或聚合蛋白质、裂解核酸及脂类等促使细胞及组织发生病变，进而对机体造成巨大伤害。清除·OH自由基可以有效地预防早衰及心血管疾病等 [10] 。

实验原理：Fe²⁺与H₂O₂发生反应会产生·OH，其可以被水杨酸捕捉并产生有色物质，此有色物质在510 nm处有最大吸收。具体实验步骤为：取2 mmol/L FeSO₄及6 mmol/LH₂O₂溶液各25 mL，充分混匀后，向其中加入6 mmol/L水杨酸75 mL，取1 mL混合液，加入1 mL 95%乙醇，将其于36.5˚C的恒温水浴锅中反应10 min后于波长510 nm下测吸光度A₀；取混合液1 mL，加入1 mL待测样品溶液，于36.5˚C的恒温水浴锅中准确反应10 min后在波长510 nm下测吸光度A_x。以VC、BHT重复上述实验作为阳性对照。样品的·OH自由基清除率计算公式如下：

$·\text{OH}自由基清除率\left(\%\right)=\left(A_0-A_x\right)/A_0\times 100\%$ (3)

其中：

A₀—空白对照的吸光度；

A_x—加入样品溶液后测得的吸光度。

3. 结果与分析

3.1. 总还原力的测定

VC、BHT、岩藻甾醇提取物的总还原力测定结果如图1所示。实验所测浓度范围内，三者均具有一

Figure 1. Reducing power of VC, BHT and fucosterol extract

图1. VC、BHT、岩藻甾醇提取物的总还原力

定的还原能力，且三者的还原能力与各自浓度呈正相关。其中，在样品浓度低于40 µg/mL时，三者的还原能力相差不大，响应值均在0.3以内；在浓度在40~80 µg/mL范围内，VC的还原能力迅速提高；80 µg/mL以后，三者之间还原能力差距越来越大，基本呈现倍数关系。综合三者相比较，岩藻甾醇提取物的还原能力较低，VC的还原能力明显强于BHT和岩藻甾醇提取物。

3.2. ·DPPH自由基清除能力的测定

VC、BHT、岩藻甾醇提取物的·DPPH自由基清除能力测定结果如图2所示。VC、BHT、岩藻甾醇提取物在实验浓度范围内均表现出较强的·DPPH自由基清除能力，且清除能力与各自的浓度均呈正相关。其中，VC的·DPPH自由基清除能力明显强于岩藻甾醇提取物及BHT。当浓度在20~60 µg/mL范围内，岩藻甾醇提取物的清除能力最弱，但当浓度超过40 µg/mL时，随着浓度的增加，岩藻甾醇提取物的清除率上升幅度明显快于BHT；当浓度在60~150 µg/mL范围内，岩藻甾醇提取物的清除率均高于BHT，但当浓度超过80 µg/mL时，其清除率增幅逐渐趋于平缓而BHT的清除率增幅逐渐增大；当浓度在150~200 µg/mL范围内，岩藻甾醇提取物与BHT的·DPPH自由基清除能力基本持平。

3.3. $\cdot O_2^{-}$ 自由基清除能力的测定

VC、BHT、岩藻甾醇提取物的 $\cdot {\text{O}}_2^{-}$ 自由基清除能力测定结果如图3所示。VC、BHT、岩藻甾醇提取物在实验所测浓度范围内表现出较强的 $\cdot {\text{O}}_2^{-}$ 自由基清除能力，且清除能力与各自的浓度均呈正相关。其中，当浓度为20 µg/mL时，岩藻甾醇提取物的清除率为6.27%，VC与BHT的清除率分别为12.06%和10.67%；当浓度增加到200 µg/mL时，岩藻甾醇提取物的清除率达到53.57%，而VC与BHT的清除率分别达到83.62%及81.20%。

3.4. ·OH自由基清除能力的测定

VC、BHT、岩藻甾醇提取物的·OH自由基清除能力测定结果如图4所示。VC、BHT、岩藻甾醇提

Figure 2. Scavenging activities of VC, BHT and fucosterol extract on ·DPPH

图2. VC、BHT、岩藻甾醇提取物的·DPPH自由基清除能力

Figure 3. Scavenging activities of VC, BHT, and fucosterol extract on $\cdot {\text{O}}_2^{-}$

图3. VC、BHT、岩藻甾醇提取物的 $\cdot {\text{O}}_2^{-}$ 自由基清除能力

Figure 4. Scavenging activities of VC, BHT and fucosterol extract on ·OH

图4. VC、BHT、岩藻甾醇提取物的^.OH自由基清除能力

取物在所测浓度范围内据具有清除·OH自由基的作用，且清除能力与各自的浓度均呈正相关。当浓度低于40 µg/mL时，三者的清除能力相差不大，均在30%以内；当浓度在40~80 µg/mL范围内，随着浓度的增加，BHT和岩藻甾醇提取物的清除能力增幅快于VC；当浓度超过80 µg/mL时，BHT的清除能力上升越来越快，而岩藻甾醇提取物和VC的清除率增幅相对逐渐趋于平缓；当浓度达到200 µg/mL时，BHT的·OH自由基清除率达到87.96%，岩藻甾醇提取物与VC的·OH自由基清除率分别为57.85%和56.33%。

4. 结论

本文对羊栖菜岩藻甾醇提取物进行系列的体外抗氧化生物活性试验。在20~200 µg/mL的实验所测浓度范围内，分别对总还原力、·DPPH自由基清除率、 $\cdot {\text{O}}_2^{-}$ 自由基清除率以及·OH自由基清除率进行测定，并与VC、BHT两种抗氧化剂进行对比。结果表明：VC的总还原力最强、BHT次之，而岩藻甾醇提取物相对较弱；岩藻甾醇提取物的·DPPH自由基清除率较强，在浓度为60~140 µg/mL范围内，其清除率甚至超过了BHT；岩藻甾醇提取物的 $\cdot {\text{O}}_2^{-}$ 自由基清除能力虽弱于VC和BHT，但当浓度为200 µg/mL时，其清除率亦达到53.5%；与VC相比，岩藻甾醇提取物的·OH自由基清除能力较强。综上所述，羊栖菜中岩藻甾醇提取物具有较好的抗氧化活性。

基金项目

浙江省自然科学基金项目(LY15C200004)。