1. 引言
新孢子虫病(Neosporiasis)是一种由犬新孢子虫(Neospora caninum)引起的全球性寄生虫病 [1] 。属原生动物口，顶复亚口，孢子虫纲，球虫亚纲，真球虫目，肉孢子虫科，新孢子虫属 [2] 。新孢子虫可感染牛等多种动物，造成母畜流产、产出木乃伊胎、死胎、繁殖障碍等经济损失 [3] [4] [5] [6] 。还能使患病动物体重减轻、营养不良，造成产奶量下降和饲养费用的浪费，以及产生对奶牛的扑杀、更换、对环境造成污染所带来间接的费用和损失。在国内，刘群等 [7] 第一次检出奶牛血清中新孢子虫阳性抗体，证实了新孢子虫在我国牛场中是有的，之后在新疆、甘肃等地方的羊群里也相继报道了新孢子虫病的存在 [8] [9] 。巴音查汗等 [10] 首先使用了重组抗原进行rELISA检测方法，对南疆部分地区进行新孢子虫病流行病学研究，关于阿勒泰地区新孢子虫感染数据也在不断的更新中。用透射电镜观察新孢子虫病原体的超微结构，速殖子的结构和弓形虫相似，但新孢子虫速殖子的棒状形电子密集度很高，而弓形虫的棒状体呈蜂窝形。目前还没有能够预防新孢子虫病的疫苗投入市场的有关报道。试验运用新疆农业大学动物医学学院寄生虫实验室前期建立的rELISA检测方法及其研发的试剂盒 [11] ，首次对阿勒泰哈巴河县3个乡镇的118份牛血清样品进行了rELISA检测、诊断，获得了哈巴河县有关牛新孢子虫病的实际数据。
2. 材料与方法
2.1. 样品来源
于2017年11月份采自阿勒泰哈巴河县随机抽取3个乡镇的牛血清共计118份(库勒拜乡30份，萨尔布拉克乡30份，加依勒玛乡58份)。经颈静脉采血，低温保存送回实验室，摆成斜面，室温下自然析出血清后收集血清，−20℃保存待检。
2.2. 实验材料
辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG购自北京中杉金桥试剂公司，新孢子虫rELISA试剂盒、CBS (碳酸盐缓冲液，PH9.6)、吐温(Tween)-20、PBS由实验室自制，显色液购自北京鼎国生物公司；PBST配制的5%脱脂奶粉、终止液是2 mol/L H2SO4。
2.3. 主要仪器
酶标板(96孔平底微量板)、移液枪、枪头购自上海生物工程有限公司，KHBST-36型全自动酶标仪、温箱购自中仪国科(北京)科技有限公司。
2.4. 实验方法
2.4.1. 抗原包被
将抗原NcSRS2取5~7 μg/mL加入到包被缓冲液内充分混匀后，在96孔酶标板每孔加100 μL缓冲液，4℃条件下过夜培养。
2.4.2. 封闭
PBST洗涤液洗涤三次后，残留粘附物用封闭液(0.5%的脱脂乳)每孔200 μL来封闭，37℃生化箱里培养1 h。
2.4.3. 加入待检血清
酶标板用PBST洗涤液冲洗三次后，100 μL每孔吸入按1:100滴度稀释的被检血清(设两个阳性、两个阴性、两个空白)，做好加样记录，并在37℃生化培养箱里孵育1 h。
2.4.4. 加二抗
PBST洗涤液洗涤三次后，每孔吸入1:8000滴度稀释后的辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG抗体或者是辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG抗体100 μL，并在37℃生化培养箱中温育1 h。
2.4.5. TMB显色液
PBST洗涤液洗涤三次后，每孔吸入100 μL TMB显色液，酶标板覆膜后置于37℃生化培养箱中温育25 min。
2.4.6. 终止显色
生化培养箱里拿出酶标板，每孔打入2 mol/L的H2SO4终止液50 μL，立即放入酶标仪读数。
2.4.7. 酶标仪读数
预热酶标仪30 min后，将终止液吸入板上，并在OD450/630 nm的波长处测量吸光度。
2.4.8. 判定标准
再经酶标仪检测后，将被检血清值高于标准阳性血清平均值判定为阳性结果；将低于阴性血清值判定为阴性结果，没有出现结果的为空白对照。
3. 实验结果
3.1. 抗体检测结果
运用rELISA方法对和静县两个村的牛和羊血清样品进行了新孢子虫病的抗体检测。检测结果为：在118份牛血清样品中，NcSRS2抗原检出5份阳性血清，平均阳性率为4.23%；详见表1。
3.2. 各乡镇感染情况
对采自哈巴河县各乡镇的118份牛血清样品进行新孢子虫病抗体水平检测，新孢子虫感染率最高为萨尔布拉克乡，结果详见表2。
4. 分析讨论
rELISA方法是最简单、方便、迅速，并且特异性和敏感性都挺高，新孢子虫抗体检测现已广泛应用 [12] 。之前的研究结果表明，使用新疆农业大学动物医学院寄生虫实验室构建、保存的菌种诱导表达新孢子虫虫体表面NcSRS2蛋白，筛选rELISA条件，建立的新孢子虫病的rELISA检查方法特异性极强，不
Table 1. Neosporidium positive antibody inspection situation
表1. 新孢子虫阳性抗体检出情况
Table 2. Infection of new sporidia in cattle in different towns
表2. 各乡镇牛新孢子虫感染情况
和弓形虫病以及布氏杆菌病发生交叉反应，本实验采用NcSRS2蛋白对新孢子虫病进行实验室诊断，从而运用ELISA检测方法对118头牛进行血清样品的诊断；共检出牛5头，平均阳性率为4.23%；出现这样的结果，原因是很多的，有可能是因为此地区的卫生条件之间存在差异，也可能是每个地区对牛、羊的饲养情况之间的差异，每个地区和犬科动物相处的密切情况等，一系列因素都会造成新孢子虫的感染情况不同。由于新孢子虫的终末宿主是犬，建议在饲养牛只的地方不要饲养狗，或者犬和牛放养的地方不要交叉，将犬的粪便清理到牛场距离远的地方，对该病的控制有帮助。还有一方面是外地引进的牛只，一定要先进行严格的检疫、隔离，进行新孢子虫病、弓形虫病及布鲁氏菌病的检测，一经发现，马上严格处理。目前，没有很有效的方法进行治疗，预防是较好的控制方法；严禁犬科动物与牛、羊接触，达到切断传染源的目的，更好地预防新孢子虫病的传播。
参考文献
NOTES
*通讯作者。