1. 引言
菊花作为一种常见的药食两用花卉包含多种维生素、微量元素和次生代谢产物等而具有一定的药效或功效，近年越来越受到人们的青睐。菊花主要活性成分为黄酮类和酚类化合物，由于菊花品种、产地、甚至采摘期不同，菊花中的主要活性成分的种类和含量都有差异 [1] [2] [3] 。
目前在菊花质量评价中所选用的指标各不相同，有的选用总黄酮和总挥发油 [4] [5] [6] ，有的定量测定菊花中黄酮或酚酸类成分 [5] - [10] ，有的借助指纹图谱反映菊花质量的差异 [11] 。根据有关报道，目前西藏地区茶用菊花品种比较少，仅有零星的雪菊种植，为增加高原地区菊花的种类，本研究通过从内地引种茶用菊花品种，并对菊花品种中主要成分进行人工提取纯化，利用高效液相色谱法(HPLC)检测茶用菊花中绿原酸、木犀草苷、槲皮素等含量较高的几种成分，同时测定菊花样品中总黄酮的含量，以期为茶用菊花高原引种后的研究和开发提供一定基础和依据。
2. 仪器与材料
Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；SB-5200D型高功率数控超声波仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)。芦丁标准品(MUST-11040302)、绿原酸(MUST-11042802)、木犀草苷(MUST-12041703)、槲皮素(MUST-10092801)。
3. 方法与结果
3.1. 菊花中绿原酸、木犀草苷、槲皮素HPLC-DAD测定条件
3.1.1. 样品提取方法
分别取0.25 g菊花样品：取样地点为河北的小黄菊、小白菊、大黄菊；取样地点为西藏的小黄菊(西藏温室)、小白菊、大黄菊、小黄菊(西藏露天)。精密称定，置于锥形瓶中，加入25 mL 70%甲醇，密塞，称定重量，超声处理40 min后，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，分离上清液，后置于4℃冰箱。取0.5 mL样品液，过0.22 µm有机膜，后进样分析。
3.1.2. 对照品溶液的制备
分别称取1.00 mg的绿原酸、木犀草苷和槲皮素，置于1 mL的容量瓶中，用70%的甲醇稀释至刻度，配成1 mg/mL的标准储存液。分别吸取适量的上述标准储存溶液，置于同一容量瓶中，采用70%甲醇稀释至实验需求的浓度。
3.1.3. HPLC条件
采用Aglient SB C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm)，以乙腈A-0.5%甲酸水溶液B为流动相；梯度洗脱条件：0~10 min，10%~20% A；10~25 min，20%~20% A；25~30 min，20%~36% A；30~40 min，36%~36% A；40~45 min，36%~40% A；45~50 min，40%~50% A；50~60 min，50%~90% A。柱温为25℃，体积流量为0.8 mL/min，进样量为5 µL，检测波长为348 nm [12] ；各茶用菊花样品绿原酸、木犀草苷、槲皮素的HPLC图见图1。
3.1.4. 标准曲线的建立
吸取一定体积的3种标准储备液，采用70%甲醇稀释至一定体积，配成不同浓度的混合标准液；按上述色谱条件进样分析，测定各化合物的峰面积，以各化合物浓度(μg/mL)为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并求得回归方程，见表1。
根据标准曲线，求得各标准品的回归方程为：绿原酸“y = 26.919x + 3.7684”，木犀草苷“y = 17.733x − 124.66”，槲皮素“y = 16.831x + 18.794，R2 = 0.9997”，总黄酮“y = 0.005x − 0.0229”，回归系数和线性范围为：绿原酸“R2 = 1.0000，0.05~50.00 μg/mL”，木犀草苷“R2 = 0.9993，0.05~50.00 μg/mL”，槲皮素“R2 = 0.9997，0.10~50.00 μg/mL”。结果表明，在各标准液的线性范围内化合物浓度与峰面积具有良好的线性关系。
注：A.标准品；B.菊化样品；1.绿原酸；2.木犀草苷；3.槲皮素。
Figure 1. The HPLC diagram of mixed standard reference substances and samples
图1. 混合标准对照品与样品HPLC图
Table 1. The results of three standard products HPLC about regression equation, linear range, detection limit and quantitative limit measurement
表1. 3种标准品HPLC分析回归方程、线性范围及检测限、定量限测定结果
3.1.5. 三种有效成分的含量测定
供试品溶液制备方法制备样品溶液，采用上述色谱条件分别进样分析，获得3种化合物色谱峰面积，将测得结果带入表1 HPLC-DAD线性回归方程，计算菊花样品中三种化合物的含量，结果如表2。
由表2结果可知，西藏产的小白菊与河北产的小白菊之间绿原酸的含量具有显著性差异，小黄菊和大黄菊亦是呈现同样的结果；西藏地区的小白菊与河北产的小白菊之间木犀草苷的含量具有显著性的差异，西藏地区的小黄菊与河北地区的小黄菊之间木犀草苷的含量也具有显著性的差异，大黄菊也呈现同样的结果；西藏地区小白菊与河北地区小白菊之间槲皮素的含量具有显著性的差异，西藏地区的小黄菊与河北地区的小黄菊之间槲皮素的含量也具有显著性的差异，大黄菊也呈现同样的结果(p < 0.05)。
3.2. 总黄酮测定
3.2.1. 提取过程
取各类菊花样品0.15 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇25 mL，密塞，摇匀，超声处理10分钟，放置3小时以上，过滤。
3.2.2. 对照品溶液的制备
取芦丁对照品适量，精密称定，加乙醇制成每1 mL含芦丁0.20 mg的溶液。
3.2.3. 标准曲线的建立
精密量取对照品溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL，分别置25 mL量瓶中，各加水至6 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，使混匀，放置6分钟，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应的试剂为空白，用紫外–可见分光光度法，以500 nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，并求得回归方程，结果见表1。
3.2.4. 总黄酮含量的测定
精密量取滤液2 mL，置25 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为供试样品溶液。精密量取供试品溶液2 mL，置于25 mL量瓶中，照标准曲线的制备方法，依法测定吸光度，同时精密量取供试品溶液2 mL，置25 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为空白溶液。从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的量，计算，即得总黄酮的含量(见表3)。
由表3可知，针对各茶用菊花总黄酮的含量，西藏地区植的小白菊的含量明显高于河北地区种植的小白菊，西藏地区种植的小黄菊和大黄菊总黄酮的含量也呈现高于河北地区的特点(p < 0.05)。
3.3. 统计分析
数据处理和统计分析采用SPSS22.0软件，结果以均值 ± 标准差(
)表示。
Table 2. The determination of 3 active components in chrysanthemum samples (μg∙g−1, n = 10)
表2. 菊花样品中3种有效成分含量测定(μg∙g−1, n = 10)
Table 3. The determination of total flavonoids in chrysanthemum samples (μg∙g−1, n = 10)
表3. 菊花样品中总黄酮含量测定(μg∙g−1, n = 10)
4. 结论
4.1. 样品中待测含量的比较
4.1.1. 绿原酸含量的比较
从表2中可以看到，将同一产区的各类茶用菊花绿原酸含量进行比较得到：西藏产的小黄菊含量高于大黄菊高于小白菊；河北产的小黄菊高于小白菊高于大黄菊；不同产区相同品种菊花绿原酸含量进行比较得到：西藏小黄菊高于河北小黄菊，西藏的小白菊高于河北小白菊，西藏的大黄菊高于河北的大黄菊；将同产区不同栽培措施条件下的茶用菊花绿原酸含量进行比较得到：露天小黄菊高于温室大棚小黄菊，由此可以得到菊花中绿原酸的含量受到栽培措施的影响。
4.1.2. 木犀草苷含量的比较
由表2的结果可知，将同一生境下各类菊花木犀草苷含量进行比较得到：西藏产小黄菊木犀草苷含量高于小白菊高于大黄菊；河北产的小黄菊高于小白菊高于大黄菊；不同生境下同一品系茶用菊花木犀草苷含量进行比较得到：西藏小黄菊高于河北小黄菊，西藏小白菊高于河北小白菊，西藏大黄菊高于河北大黄菊；另外，由表2可知，不同栽培措施条件下菊花木樨草高含量存在差异：露天的小黄菊高于温室大棚里的小黄菊。
4.1.3. 槲皮素含量的比较
根据测定结果(见表2)可见，将同一生境下各类茶用菊花槲皮素含量进行比较得到：西藏产小白菊槲皮素含量高于大黄菊高于小黄菊，河北产的小白菊高于小黄菊高于大黄菊；不同生境下同一品系茶用菊花槲皮素含量比较：西藏产小黄菊高于河北产小黄菊，西藏产小白菊高于西藏产小白菊，西藏产大黄菊高于河北产大黄菊。另外，菊花槲皮素含量受栽培措施条件的影响不大。
4.2. 菊花总黄酮含量的比较
现代研究表明，黄酮类化合物是菊花提取物中含量较多的有效成分，其含量因菊花品种不同而存在差异 [13] [14] [15] 。本实验测得各类菊花总黄酮含量见表3，将相同生境下茶用菊花总黄酮的含量进行比较得到：西藏产小黄菊高于大黄菊高于小白菊；不同产区下产的同类菊花总黄酮含量：西藏产小黄菊高于河北产小黄菊，西藏产小白菊高于河北产小白菊，西藏产大黄菊高于河北产大黄菊。此外，由表3可知，菊花中总黄酮的含量受栽培措施条件的影响。
通过对7个菊花样品中主要成分含量的测定，发现相同产区不同品种菊花绿原酸、木犀草苷、槲皮素含量各异；不同产区相同品种菊花绿原酸、木犀草苷、槲皮素、总黄酮等主要活性成分含量也存在差异；总体而言，高原环境产的菊花主要活性成分的含量明显高于内地。据此，通过对引进菊花主要活性成分含量的测定和比较分析，可为茶用菊花引种高原后对其质量评价、遗传多样性以及品种选育研究提供依据。
4.3. 茶用菊花各主要活性成分含量存在差异的可能原因
从内地引种高原后，相同菊花品种主要活性成分含量存在显著差异，且呈现显著性增加，主要原因可能是：高原上特殊的气候条件(光照、降雨、温度等)、地理条件等对菊花的主要活性成分含量产生了影响；相同生境下相同栽培措施不同品系菊花各活性成分含量存在差异，可能原因是不同种类菊花存在种质上的差异，其次生代谢产物等后含物也可能不同；此外，不同产地间菊花的栽培措施、采收方法以及菊花成熟度等因素也会对茶用菊花的有效成分含量造成影响。因此，菊花的内在质量受多因素的影响 [16] 。
从研究结果可以见到，在我国不同产区往往相同的茶用菊花品系，其主要活性成分存在较大的差异，同一生境下存在的多个类型茶用菊花，其主要活性成分含量同样存在差异，这些均体现了茶用菊花的多样性，为茶用菊花在高原上的育种工作提供了丰富的材料，使高原上菊花品种种类增加成为可能。
基金项目
西藏自治区拉萨市科技计划项目(201604)。
NOTES
*通讯作者。