1. 引言
黄花梨(Pyrus pyrifolia Nakai Huanghua)是1962年用亲本为不同生态型的品种“黄蜜(母本)”与“三花(父本)”杂交所得 [1]。黄花梨果实深受消费者的青睐，具有很高的食用价值，是我国南方地区大量种植的优良梨品种，也是重庆市永川区主要的梨栽培品种，栽培面积达6000 hm2，年产量达60,000 t，是农民的重要经济来源 [2]。
黄酮类化合物是一类植物次生代谢产物，存在于多种植物中，不仅数量种类繁多，而且结构类型复杂多样 [3]。据报道，黄酮类化合物具有许多重要的生理、生化作用，适量摄入能减少癌症、肿瘤、心血管疾病、脂质过氧化以及骨质疏松等疾病的发病率 [4] ，在医药领域应用广泛。果农每年都要进行整形修剪，废弃了大量的残枝叶片，为了充分利用资源，发挥其应有的价值，本实验以黄花梨叶片为材料，对叶片中总黄酮提取工艺进行了研究，为黄花梨叶片的再利用提供技术保障。
2. 材料和方法
2.1. 材料与设备
2.1.1. 材料与试剂
黄花梨叶片：采自重庆市永川区黄瓜山梨园。
芦丁：合肥博美生物科技有限责任公司生产；无水乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝等均为分析纯。
2.1.2. 仪器与设备
电热恒温鼓风干燥箱：DGG-9246A型，上海齐欣科学仪器有限公司；电热恒温水浴锅：HH.S11-4-S型，上海龙跃仪器设备有限公司；高效多功能粉碎机：DS-T300型，上海顶帅电器有限公司；电热恒温水温箱：HH.W21.600型，上海跃进医疗器械厂；电子天平：El204型，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；隔膜真空泵：GM-0.5A，浙江台州求精真空泵有限公司；可见分光光度计：722型，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；旋转蒸发仪：RE-52AA型，上海亚荣生化仪器厂。
2.2. 方法
2.2.1. 标准曲线的制作
称取芦丁标准品20.00 mg，加入70%的乙醇溶液，定容至100 ml，得质量浓度为0.20 mg/ml的芦丁标准液。分别吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml标准液置于1、2、3、4、5、6、7号共7个25 ml容量瓶中，各加70%乙醇溶液补充至5 ml，再分别加入5%亚硝酸钠溶液0.3 ml，摇匀后静置6分钟后加入10%硝酸铝溶液0.3 ml，摇匀，静置5分钟，最后加入1 mol/L氢氧化钠溶液4 ml，定容至25 ml，放置10分钟后，以1号试管为对照，测定在510 nm波长处不同芦丁标准液的吸光度，以吸光度为纵坐标，芦丁标准液浓度为横坐标，绘制标准曲线。
2.2.2. 总黄酮含量的测定
测定黄花梨叶片总黄酮含量时，按制作标准曲线的方法测定不同系列样品的含量，参照总黄酮提取率计算公式进行计算 [5]。
式中：C为根据标准曲线计算出的总黄酮质量浓度(mg/ml)；V为提取液体积(ml)；n为提取溶液稀释倍数；m为提取叶片的质量(g)。
2.2.3. 单因素试验
在其它条件相同的情况下，分别开展乙醇浓度(40%、50%、60%、70%、80%、90%)、液料比(10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1 ml/g)、提取温度(20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃)、提取时间(0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h)对黄花梨叶片总黄酮提取率的影响。
2.2.4. 正交试验
根据单因素试验结果，考虑乙醇浓度(A)、液料比(B)、提取温度(C)、提取时间(D)对黄花梨叶片总黄酮提取的影响，选用L9(34)正交表进行正交试验方案的设计(表1)，进一步优化黄花梨叶片中总黄酮的提取工艺。
Table 1. Factors and levels of orthogonal experiment
表1. 正交实验因素与水平
2.2.5. 数据分析
数据采用SPSS18.0进行统计分析。
3. 结果与分析
3.1. 标准曲线的绘制
根据实验结果得出芦丁标准曲线(图1)，其回归方程为y = 5.8393x + 0.0043，相关系数R2 = 0.9991，表明芦丁标准液浓度与吸光度值有较强的线性相关关系。
Figure 1. Standard curve of rutin solution
图1. 芦丁溶液的标准曲线
3.2. 乙醇浓度对黄花梨叶片总黄酮提取率的影响
选取液料比20:1，温度40℃，提取时间1 h，采用2.2.3设置的不同水平的乙醇浓度10 ml进行实验。由图2看出，在乙醇浓度为40%~60%时，随着乙醇浓度的增加，黄花梨叶片的总黄酮提取率呈现上升趋势，在乙醇浓度为60%时达到最大值，之后，随着乙醇浓度的增加，黄花梨叶片的总黄酮提取率下降较为明显，这可能是由于杂质与脂溶性黄酮竞争溶剂，从而导致总黄酮的提取率降低 [6]。
Figure 2. The effect of extraction ethanol concentration on extraction rate
图2. 乙醇浓度对提取率的影响
3.3. 液料比对黄花梨片总黄酮提取率的影响
选取乙醇浓度70%，温度40℃，提取时间1 h，采用2.2.3设置的不同水平的液料比进行实验。由图3可知，黄花梨叶片总黄酮的提取率随着液料比的增加呈现上升趋势，最终在液料比为50:1时趋于稳定，呈小幅度的上升。因此，从提取效果和减少溶剂用量考虑，选择液料比为50:1较为适宜。
Figure 3. The effect of extraction liquid-solid ratio on extraction rate
图3. 液料比对提取率的影响
3.4. 提取温度对黄花梨叶片总黄酮提取率的影响
选取乙醇浓度70%，液料比20:1，提取时间1 h，采用2.2.3设置的不同水平的温度进行实验。由图4可知，当提取温度升高时，黄花梨叶片的总黄酮提取率先上升后下降，在提取温度为50℃时，提取率最大。从热力学角度分析，温度越高，越有利于总黄酮的溶出，但温度过高，杂质的溶出增加，同时乙醇的挥发也增加，不利于黄酮类化合物的溶出 [7]。
3.5. 提取时间对黄花梨叶片总黄酮提取率的影响
以乙醇浓度70%，液料比20:1，温度40℃，采用2.2.3设置的不同水平的提取时间进行实验。从图5可看出，从整体来看，随着提取时间的增加，黄花梨叶片总黄酮提取率先上升后下降，在0.5 h~1.5 h内，提取时间增加，提取率增加；在1.5 h~3 h内，提取时间增加，提取率减小，可能是由于提取时间过长，一些热敏性组分被破坏，导致提取率下降。
Figure 4. The effect of extraction temperature on extraction rate
图4. 提取温度对提取率的影响
Figure 5. The effect of extraction time on extraction rate
图5. 提取时间对提取率的影响
3.6. 正交试验
根据单因素试验结果进行正交试验，从表2可见，乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间对黄花梨叶片中总黄酮的提取率均有影响，影响力大小依次为：C > B > A>D，即提取温度 > 液料比 > 乙醇浓度 > 提取时间。由表3看出，经方差分析，乙醇浓度、液料比、提取温度对黄花梨叶片总黄酮提取率有显著差异，提取时间无显著差异。提取工艺的最佳条件是A3B2C1D3，即乙醇浓度70%，液料比50:1 ml/g,提取温度40℃，提取时间2 h，在此提取条件下，黄花梨叶片中总黄酮的提取率达到9.72%。
Table 2. Results and analysis of orthogonal experiment
表2. 正交实验结果与分析
Table 3. Variance analysis of orthogonal experiment
表3. 正交实验方差分析
4. 结论
通过单因素试验和正交试验，综合分析得出：
1) 液料比、提取温度、乙醇浓度、提取时间四因素对黄花梨叶片总黄酮的提取均有影响，其中乙醇浓度、液料比、提取温度的影响达到显著水平(P < 0.05)，各因素对黄花梨叶片总黄酮提取率的影响程度依次为提取温度 > 液料比 > 乙醇浓度 > 提取时间。
2) 黄花梨叶片总黄酮的最佳提取工艺条件为：乙醇浓度70%，液料比50:1 ml/g，提取温度40℃，提取时间2 h，提取率达到9.72%。
基金项目
重庆市大学生创新创业训练计划项目“黄花梨叶片总黄酮提取工艺的研究”(201810642044)。
NOTES
*通讯作者。