1. 引言
多发性骨髓瘤(Multiple myeloma, MM)，是一种单克隆B淋巴细胞恶性增殖的浆细胞恶性肿瘤 [1] ，多发生于中老年人，且男性发病率略高于女性 [2] ，症状复杂多样，主要临床表现为高钙血症、反复感染、贫血、肾功能不全和骨质破坏等靶器官损害 [3] 。目前仍无法治愈。细胞遗传学是近年来研究最多的MM预后分层因素之一。研究认为MM患者的临床表现，疾病过程及预后的异质性与MM细胞的不同生物学特性密切相关，而决定MM细胞不同生物学行为的核心因素是细胞的不同遗传学特征。MM的遗传学改变多为同时包含数量和结构改变的复杂核型异常，所有23对染色体均有受累。目前应用比较多的细胞遗传学异常危险分层是Mayo Clinic提出的MM危险分层(Mayo stratification of myeloma and risk-adapted therapy, m SMART)见表1，依据患者的细胞遗传学结果将患者分为低危组、中危组和高危组三组，不仅可以评估患者的预后，而且具有指导治疗的价值，根据患者染色体异常进行危险分层治疗 [4] 。由此可见，MM的细胞遗传学数量和结构的异常检测率有着非常重要的意义。但是常规的染色体核型分析阳性率很低，本研究联合FISH方法，发现可以极大提高阳性率，增加对临床的指导意义。
2. 资料和方法
2.1. 病例资料
收集上海金域医学检验所2017年02月~2018年04月确诊为多发性骨髓瘤的患者标本同时检测骨髓染色体核型分析和间期荧光原位杂交。其中男性患者50例，女性患者32例，男女比例为1.56:1，82例患者年龄范围为44~84岁，中位数年龄为64岁。(伦理许可申明：我们是商业化检测公司，对各医院送检标本进行常规检测，检测后不保留患者标本，及时按照国家和公司规定处理残留的标本。本文只是对病例资料进行回顾性总结，不涉及患者隐私和利益，对患者无不利影响)。
Table 1. mSMART hazard stratification
表1. mSMART危险分层
注：mSMART为Mayo骨髓瘤分层及风险调整治疗；FISH为荧光原位杂交；GEP为基因表达谱。
2.2. 检测方法
2.2.1. G显带染色体核型分析
无菌抽取患者骨髓2 ml~3 ml (肝素钠抗凝)，按1 × 106/ml~2 × 106/ml每个标本接种两瓶培养基, 其中一瓶添加l ps刺激剂，培养3天，另一瓶不加l ps的培养2天。收获前，分别加入20 ug/ml秋水仙素20 μl混匀，放入37℃孵育箱继续培养，4小时后收获。1300 rpm离心10 min，弃上清液；加入0.075 M KCl溶液(预温至37℃) 8.0 ml左右，轻轻混匀，置37℃温浴35 min；沿着管壁缓缓加入1 ml固定液(甲醇：冰醋酸 = 3:1)，轻轻地混匀，1300 rpm离心10 min (室温)；离心后弃上清液，缓慢加入固定液约8.0 ml，混匀，放置45 min固定；1300 rpm离心10 min，离心后弃上清液，加入固定液约8.0 ml，混匀，放置12小时(过夜)固定；离心1300 rpm离心10 min，弃上清液，加适量固定液配成细胞悬液。制片后置于90℃的烤箱中烘烤1.5小时。冷却后胰酶消化，姬姆萨染液染色。每例标本分析20个中期分裂相依据《国际人类染色体命名系统》《ISCN2016》做出诊断报告。根据克隆的标准，至少两个细胞有同样的染色体增加或结构异常，或至少三个细胞有一致的染色体丢失。肿瘤细胞遗传学检查时只有克隆性异常才有报告价值，判断为阳性。
2.2.2. FISH检测
使用CD138磁珠分选富集浆细胞：将外周血(使用30 μm滤过器)或骨髓血(使用100 μm滤过器)通过滤过器，去除血凝块、骨块；每1 ml血液加50 μl全血CD138磁珠，充分混匀后在2℃~8℃孵育15分钟；然后每1 ml血液加2 ml~5 ml autoMACS Running Buffer (裂解红细胞)，室温445 × g离心10分钟；去上清，通过加等体积autoMACS Running Buffer重悬细胞沉淀；将经过3 ml autoMACS Running Buffer冲洗的全血过滤柱置于磁力架上，加入细胞悬液，使用3 × 3 ml autoMACS Running Buffer过柱；将全血过滤柱从磁力架上拿下来置于一新的收集管中，加5 ml Whole Blood Column Elution Buffer，将吸附柱上的细胞洗脱，加autoMACS Running Buffer制成细胞悬液；每个检测探针滴一张片，放入56℃烤箱中烘烤2小时，将玻片浸入50 ml 2 × SSC中，2缸各洗涤3 min；于70%、80%、100%酒精中依次放置3 min进行梯度脱水(≤6个载玻片/缸)；风干玻片；用0.2 ml EP管混合探针(0.5 µl~1.0 µl)和缓冲液(探针：缓冲液 = 1:10)，按检测项目依次混合好探针，在杂交区域加入足量的探针(5.0 µl~10.0 µl)，再加上合适大小的盖玻片封盖检测区域，用封片胶封闭盖玻片四周。运行Thermo Brite™程序，参数如下：75℃度变性5 mins，37℃杂交14 h~18 h；从−20℃取出DAPI II，置于室温解冻，加50 ml杂交后洗涤缓冲液(0.4 × SSC/0.3% NP-40)至考普林缸内，水浴升温至72℃ ± 1℃，至少保留30分钟；再取一个考普林缸(Coplin缸)，加入50 ml杂交后洗涤缓冲液，室温放置；用镊子小心的揭开封片胶，移去盖玻片，去掉玻片上多余的封片胶，将载玻片浸没在72℃ ± 1℃的杂交后洗涤缓冲液内3分钟(≤6个载玻片/缸)；从洗涤缓冲液中取出所有载玻片，暗室直立风干(使用密闭抽屉或密闭室内的架子即可)；在载玻片目标区上加入10 μL的DAPI II复染液，盖上盖玻片。在进行信号计数之前，将载玻片置于玻片盒。选择好合适的滤光片后，开始计数细胞中的杂交信号，信号分析采用Meta systems ISIS分析软件(Isis V 5.5.3/5.3.3)，每例计数200个间期细胞，计算阳性细胞百分比。阳性细胞比率大于正常域值者为阳性。FISH检测的探针包括RB1，CKS1B/CDKN2C (P18)，IGH，IGH/CCND1，IGH/FGFR3，TP53/CEP17，13q14.3/13q34(D13S319/LAMP1)，IGH/MAF。(注：CUT-OFF值说明：实验室开展项目之前需进行方法学验证，建立自己实验室的CUT-OFF值)。
2.3. 统计分析
以百分比来表示染色体核型异常的阳性率，常规染色体分析与FISH的阳性率比较用卡方检验，采用STATA11.0统计软件，P < 0.05认为有统计学差异。
3. 结果
1) 常规染色体核型分析82例MM患者标本，1例培养失败。7例为阳性(其中4例为复杂核型)，阳性率为(7/81, 8.64%)。同时进行FISH检测的82例MM标本，47例阳性，阳性率为(47/82, 57.31%)，同时进行核型分析和浆胞富集后的间期荧光原位杂交实验，总阳性率为(49/82, 59.76%)。有2例染色体结果阳性FISH结果阴性，原因为染色体核型分析检测出复杂核型，而FISH探针未覆盖异常的染色体位点。常规染色体分析与FISH的阳性率存在显著统计学差异，P值 < 0.001。两种方法学检测的阳性率比较见表2。
Table 2. Positive rates of MM by different methods
表2. 不同方法学检测MM阳性率情况
*有一例患者无分裂相
2) 82例MM标本通过FISH检测分析发现47例为阳性，探针阳性分布(表3)：RB1探针检测的13q14缺失25例，占总阳性比为53.19%；CKS1B/CDKN2C (P18)探针检测的1q21扩增拷贝阳性34例，占总阳性比为72.34%；IGH探针检测的IGH重排阳性16例，占总阳性比为34.04%；IGH/CCND1探针检测的t (11; 14)阳性2例，占总阳性比为4.25%；IGH/FGFR3探针检测的t (4; 14)阳性8例，占总阳性比为17.02%；TP53/CEP17探针检测的17p13.1阳性6例，占总阳性比为12.77%；13q14.3/13q34 (D13S319/LAMP1)检测的13q14.3阳性3例，占总阳性比为6.38%；IGH/MAF探针检测的t (14; 16)阳性为0，阳性率为0.00%。
Table 3. Positive probe distribution ratio in 47 MM
表3. 47例多发性骨髓瘤FISH检测阳性探针分布比率
4. 讨论
通过本研究发现：同时联合检测常规染色体核型和FISH可以极大提高多发性骨髓瘤阳性检出率，从8.64%提高到59.76%。常规细胞遗传学方法的染色体异常检出率低有以下几点原因：1) 骨髓瘤细胞有丝分裂指数低，增殖缓慢，骨髓浸润程度不同。2) 染色体核型分析只能检测分裂中期的染色体，并且只分析20个细胞。3) 对染色体质量要求较高，异常的细胞有时形态很差，难以分析辨别。4) 核型分析分辨率低，对于一些微小片段丢失，例如RB1缺失，隐匿的异常，例如t (4; 14) (p 16; q 32)核型分析肉眼难以发现。FISH检测阳性率高。FISH的优势在于，1) 不仅可以分析中期分裂相细胞，也可以分析大量间期细胞，分析细胞数是染色体的10倍数量级，2) 可以发现并分析20 Kb的微小染色体缺失或畸变，能够对已知序列片段的变化进行高度敏感而特异的检测，特别是染色体显带不易分辨的倒位、丢失以及复杂的染色体异常改变。3) 通过浆细胞富集更可以提高检测标本中浆细胞比例，进一步提高检出率。FISH 检测技术的应用可以弥补常规染色体核型分析技术的不足之处。但是FISH检测是用已知的探针检测靶基因的技术，且它的探针是有限的，不能覆盖全部染色体，对于不确定的染色体异常及涉及到多条染色体复杂核型，非常见的异常，FISH技术难以检测。而常规染色体核型分析则不受此限制。所以也需要检测染色体。如本研究中，就有2例患者染色体阳性，但是FISH未发现。
国外也有类似报道，在多发性骨髓瘤的检测中，核型分析常得到正常的结果，FISH对于有临床意义的异常染色体(例如13q-，17p-，IGH重排)的检测具有更高的灵敏度。但是核型分析检测出的复杂结构和数目异常FISH则无法检出。13q-，IGH重排和亚二倍体等核型均是MM重要的预后因素，表明对于多发性骨髓瘤，联合使用核型分析和FISH检测对临床具有重要意义 [5] 。
根据我们的研究，国内MM中最常见的核型异常有1q21扩增拷贝，13q14缺失，IGH重排，t (4; 14)，P53缺失。在多发性骨髓瘤中，17p13.1 (抑癌基因位点P53)的缺失导致TP53的杂合性丢失，被认为是MM高危特征。存在TP53缺失的MM患者无进展生存时间(PFS)和OS较短 [6] 。1号染色体异常也是多发性骨髓瘤常见改变。1q21的获得/扩增与疾病的进展和不良预后有关 [7] 。RB1基因缺失多见于多发性骨髓瘤(MM)。染色体13q-常伴随17p-，1q+和(或) t (4; 14)，单独13q-不是独立预后因素。13q-的预后不良与17p-，1q+和(或) t (4; 14)的发生有关。位于14q32位点上的IGH基因(编码免疫球蛋白重链)重排，最常见的三种易位按出现频率高低依次是t (4; 14) (p16; q32)，t (11; 14) (q13; q32)和t (14; 16) (q32; q23)。一些研究证实t (4; 14)和t (14; 16)是影响MM患者生存的独立预后不良因素。t (11; 14) (q13; q32)对PFS和OS均无显著影响 [8] 。
因此联合应用染色体核型分析，浆细胞富集后的FISH检测，可以提高MM患者染色体异常的检出率。两者应该联合应用可以更全面准确发现MM患者的异常核型，更好地为临床提供治疗指导和预后评估。
NOTES
*通讯作者。