溴脱氧尿苷在生物医学诊断中的应用与研究

Application and Research of Bromodeoxyuridine in Biomedical Diagnosis

摘要: 核苷与脱氧核苷系列化合物主要用于医学领域，用途广泛，而且新产品层出不穷，应用范围不断扩大。核苷类抗病毒药物品种繁多，结构多样，主要以破坏病毒转录、干扰或终止病毒核酸的合成为目的，用于抗疱疹病毒，HIV，HBV，以及流感和呼吸系统病毒等DNA和RNA病毒。目前在这方面应用最多，而且新出现的药物主要集中于治疗上述疾病。作为抗肿瘤药物，它们的主要作用是干扰肿瘤的DNA合成，或者影响核酸的转录过程，抑制蛋白质的化合物已经有多种临床应用，其中有部分产品对多种真菌具有抑制作用，而且对哺乳动物几乎没毒性。作为抗抑郁药物，核苷类药物可以用于治疗神经系统疾病，有非常强的抗抑郁作用，有的药物同时可以用作治疗关节疾病的镇定剂，对脑血管功能障碍也有效。其他方面，核苷及其核苷类系列化合物，有的可以作为高校食用增鲜剂；一些寡核苷酸不仅可以用于基因疗法，还可以用作案件侦破，考古以及作为DNA计算机的元件等。

Abstract: The nucleoside and deoxynucleoside series of compounds are mainly used in the medical field, and are widely used, and new products are emerging one after another, and the application range is expanding. Nucleoside antiviral drugs are diverse in variety and structure, and are mainly used for anti-herpesvirus, HIV, HBV, and DNA and RNA viruses such as influenza and respiratory viruses for the purpose of destroying viral transcription, interference or termination of viral nucleic acid synthesis. It is currently the most widely used in this area, and new drugs are mainly concentrated on the treatment of the above diseases. As anti-tumor drugs, their main role is to interfere with the DNA synthesis of tumors, or to affect the transcription process of nucleic acids. Compounds that inhibit proteins have been used in many clinical applications, some of which have inhibitory effects on various fungi, and on mammals. There are almost no toxic side effects. As an antidepressant, nucleoside drugs can be used to treat neurological diseases and have a strong antidepressant effect. Some drugs can also be used as sedatives for the treatment of joint diseases, and are also effective for cerebrovascular dysfunction. In other respects, nucleosides and their nucleoside series of compounds, some can be used as edible flavoring agents in colleges and universities; some oligonucleotides can be used not only for gene therapy, but also for case detection, archaeology, and as a component of DNA computers.

1. 引言

溴脱氧尿苷(BrdUrd)是一种掺入DNA的胸苷类似物，可以通过荧光或发色猝灭与DNA结合或对BrdUrd抗体进行定量分析。自20世纪70年代以来，这些技术一直被用作测量分离的染色体和细胞和组织中DNA合成的工具。

在20世纪60年代和70年代，引入了许多细胞化学方法，试图了解染色体复制时间，染色体不活动和姐妹染色单体交换。这些技术包括放射自显影，吉姆萨染色，奎纳克林荧光。对晚期复制的理解受到放射自显影技术的限制，该技术是劳动密集型的并且通常是不精确的。随后的研究包括Dutrillaux等人对BrdUrd对荧光DNA染料的猝灭效应。使用Giemsa技术显示中度X射线剂量后第1，第2和第3分区中人和兔淋巴细胞的相对分布。Chebotarev和Selezneva等人将该技术应用于细胞周期持续时间的快速动力学测定。Botto等人通过评估第1至第3细胞分裂中的中期分析，采用Hoechst-Giemsa方法分析人淋巴细胞动力学。Ardito等人使用姐妹染色单体分化评估了四种猕猴的淋巴细胞中的细胞动力学。然后将荧光猝灭技术应用于DNA复制和细胞动力学的流式细胞术研究。Latt，Beck和Kubbies等人 [1] [2] [3] [4] [5] 使用Hoechst的BrdUrd猝灭来区分掺入BrdUrd的细胞。Bohmer和Ellwart等人将Hoechst与溴化乙锭结合，允许同时测量DNA含量并淬灭Ho33258荧光。Epner等人也使用Hoechst/溴化乙锭技术显示α和β珠蛋白基因的复制发生在S期早期。Swartzendruber等人在Hoechst-mithramycin组合中使用增强的光神霉素荧光，显示诱导分化为浆细胞的鼠骨髓瘤细胞经历单细胞周期，然后在G1中被阻断。

2. 第一代溴脱氧尿苷

目前针对BrdUrd产生的抗体提供了检测掺入DNA中的BrdUrd的免疫化学方法。Gratzner等人发明了BrdUrd和IdUrd的抗血清，用于允许荧光检测掺入BrdUrd的S期细胞。Gratzner等人描述了一种单克隆抗BrdUrd，它随后将成为研究DNA合成的非常有价值的工具。免疫化学方法沿着两种不同的技术发展：流式细胞术(FCM)荧光方法和显微镜方法，包括图像分析。Gratzner和Gratzner等人将掺入的BrdUrd和前向光散射的荧光染色结合起来以获得流式细胞术双变量分布，其用于计算Sphase细胞的百分比。Dolbeare等人结合抗BrdUrd-FITC荧光与测定结合BrdUrd和碘化丙啶荧光来量化总细胞DNA含量 [6] [7] [8] [9] 。用BrdUrd脉冲标记的样品的顺序分析允许推导细胞周期参数和相持续时间。这成为评估增殖细胞中细胞动力学和标记指数的进一步工作的流式细胞术基础。与此同时发展，Raza等人开发了在载玻片上的肿瘤组织切片中掺入BrdUrd的免疫化学染色方法。这些技术成为肿瘤切片，切片和细胞离心涂片制剂中掺入的BrdUrd的大量后续定量的标准方案。

Miller等人允许对掺入DNA的卤代嘧啶类似物进行免疫化学定量。通过用溴尿苷蛋白或碘尿嘧啶蛋白免疫小鼠来产生单克隆抗体。将从免疫动物分离的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，以产生产生抗体的杂交瘤细胞系 [10] 。最初通过ELISA测定筛选这些抗体，然后针对掺入卤化嘧啶类似物的细胞进行测试。目前，至少20种单克隆抗BrdUrd或抗IdUrd抗体是可购买的。大多数抗体属于IgG1亚型，并且与BrdUrd和IdUrd以及可能的CldUrd交叉反应。几个例外包括来自Caltag的Br3，由Vanderlaan和他的同事描述，其与BrdUrd和CldUrd反应，但是对于IdUrd的反应性低，并且Bakker等人描述了来自SeraLab的大鼠单克隆。因为对BrdUrd和CldUrd具有反应性，但对IdUrd几乎没有反应性。研究人员将B-75抗体染色与Becton Dickinson B44抗BrdUrd结合，在高盐浓度条件下，它不与CldUrd结合，因此允许CldUrd和IdUrd的特异性染色而没有交叉反应性 [11] - [17] 。

最近Jensen等人证明了通过单克隆抗体ABDM和B-44将溴尿苷掺入RNA，但不是通过IU-4掺入RNA。Peters等人在兔体内抗血清抗5-氟-2’-脱氧尿苷-5-单-磷酸(FdUMP)，可在水溶液中检测0.1至5.0皮摩尔范围内的FdUMP，并可识别类似物与靶酶胸苷酸合成酶和叶酸辅助因子结合的三元复合物。固定剂用于免疫组织化学测定掺入的BrdUrd的早期技术使用70%乙醇，冷丙酮或冷甲醇作为固定剂。这些溶剂允许稳定抗原如BrdUrd的组织化学染色，但通常导致核，细胞质和膜抗原的免疫化学染色减少。需要同时染色一些其他细胞抗原以及BrdUrd，需要使用固定剂，以在将BrdUrd暴露于抗体所必需的苛刻变性条件下稳定抗原-抗体复合物。Houck等人在0℃下使用0.5%多聚甲醛30分钟，然后在室温下再使用30分钟以将结合的德克萨斯红抗Thy1.2固定在小鼠胸腺细胞的表面上。相比之下，Lokhorst等人仅使用冷的70%乙醇固定细胞离心涂片制剂，然后用4M HCl处理30分钟，能够获得BrdUrd和细胞质免疫球蛋白的双荧光免疫染色。部分地，通过上述两个报道获得的差异可以存在于干燥载玻片制剂上的免疫球蛋白蛋白质与流式细胞术分析中悬浮细胞的变性性差异。对于小鼠肠中的隐窝标记，Schutte等人发现交联剂如福尔马林和戊二醛在固定后产生了隐窝细胞染色强度的急剧增加。他们用胃蛋白酶固定后消化组织，然后进行DNA的酸变性。Cottell等人在盐水中结合甲醛/戊二醛作为小鼠胚胎组织的固定剂。将组织嵌入蜡块可视化是通过抗生物素蛋白–生物素过氧化物酶或免疫金银，其给出最敏感的信号。Hanazono等 [18] [19] [20] [21] 人采用固定在福尔马林和高碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛中的组合来固定子宫组织以嵌入聚酯蜡。

3. 第二代溴脱氧尿苷

BrdUrd的多克隆抗体和单克隆抗体检测都要求使DNA变性以使BrdUrd可用于抗体结合。在用于流式细胞术分析的Gratzner方法中，使用HCl，其也快速水解RNA。在室温下使用HCl，这是一种较温和的条件，但是在某些类型的细胞或福尔马林或多聚甲醛固定的组织中不能使DNA变性。通过流式细胞术测量的灵敏度取决于信噪比(S/N)，根据使用的固定剂和变性方案，信噪比可能会有很大差异。Sasaki等人研究了绿色荧光与HCl在22℃下长达1小时的S期，可达到的最大S/N比。Williamson等人表明，即使低浓度的HCl也可以产生足够的DNA变性，从而可以确定某些组织中的标记指数，而其他组织则需要更高的浓度。在50%甲酰胺存在下在80℃下细胞的热变性产生了S/N比的显著增加，但G1峰的变异系数为3~5 [22] 。

Magaud等人比较了稀NaOH，HCl，在85℃下在柠檬酸中的热变性，和甲酰胺加热在几种组织类型上，这些组织已被切成低温恒温器切片并用丙酮固定在载玻片上。他们对第二抗原(HL-II，Ki67，CD8，细胞角蛋白)使用免疫过氧化物酶染色，然后进行变性程序。他们得出结论，热甲酰胺方法对BrdUrd的形态学保存和免疫荧光染色都给出了优异的结果。通过限制性内切核酸酶处理然后进行核酸外切酶III处理，可以避免热变性或酸水解。然而，对于高亲和力抗体(IU-4)而言，该技术似乎比使用低亲和力抗体如IU-1或IU-2更有效 [23] [24] [25] 。Dinjens等人表明，与抗BrdUrd组合的外切核酸酶III和EcoRI孵育可用于固定在福尔马林，乙醇，戊二醛，Carnoy’s Bouin’s或Zamboni’s固定剂中的样本，并且产生更好的染色，DNA损失比HCl更少。Humbert等人，在EcoRI/ExoIII组合之前使用HCl，能够在细胞上同时获得PCNA和BrdUrd的荧光染色，用于共聚焦显微镜检查。Gonchoroff等人使用DNAse I来部分消化DNA，从而消除了恶劣的变性条件。Toba等人报道了用表面表型抗原的藻红蛋白偶联抗体，BU-1 FITC-antiBrdUrd (含有核酸酶)和7-氨基-放线菌素作为DNA染色剂对人外周血淋巴细胞进行三重染色的方法。Takagi等人用DNAse I处理载玻片处理载玻片，用DNAse I处理载玻片，然后用核酸外切酶III处理细胞。Schutte等人使用温和蛋白酶处理，然后进行HCl处理，以在福尔马林固定切片中观察BrdUrd。他们发现在戊二醛固定的组织中需要高浓度的胃蛋白酶。Wilson等人回顾了这种方法在临床材料中的应用，特别是对于实体肿瘤，因为小于20 mg的小活检样本足以产生足够的细胞核用于通过FCM分析动力学参数。Hayashi等人表明蛋白酶处理允许在福尔马林中预先固定数周至数月的切片中可视化BrdUrd。Van Erp等人在一步中将胃蛋白酶处理和酸水解相结合，得到良好的双变量分布，对人类包皮角质形成细胞和人骨髓细胞的细胞损失最小。比较了上述大多数方案用于对脆弱的杂交瘤细胞进行流式细胞术分析。用联合胃蛋白酶HC1处理获得了最佳的BrdUrd/DNA双变量直方图。

Magaud等人比较了稀NaOH，HCl，在85℃下在柠檬酸中的热变性，和甲酰胺加热在几种组织类型上，这些组织已被切成低温恒温器切片并用丙酮固定在载玻片上。他们对第二抗原(HL-II，Ki67，CD8，细胞角蛋白)使用免疫过氧化物酶染色，然后进行变性程序。他们得出结论，热/甲酰胺方法对BrdUrd的形态学保存和免疫荧光染色都给出了优异的结果。通过限制性内切核酸酶处理然后进行核酸外切酶III处理，可以避免热变性或酸水解。然而，对于高亲和力抗体(IU-4)而言，该技术似乎比使用低亲和力抗体如IU-1或IU-2更有效。Dinjens等人表明，与抗BrdUrd组合的外切核酸酶III和EcoRI孵育可用于固定在福尔马林，乙醇，戊二醛，Carnoy’s Bouin’s等人固定剂中的样本，并且产生更好的染色，DNA损失比 HCl更少。Humbert等人在EcoRI/ExoIII组合之前使用HCl，能够在细胞上同时获得PCNA和BrdUrd的荧光染色，用于共聚焦显微镜检查。Toba等人报道了用表面表型抗原的藻红蛋白偶联抗体，BU-1 FITC-antiBrdUrd (含有核酸酶)和7-氨基-放线菌素作为DNA染色剂对人外周血淋巴细胞进行三重染色的方法。Takagi等人用DNAse I处理载玻片处理载玻片，用DNAse I处理载玻片，然后用核酸外切酶III处理细胞。Schutte等人使用温和蛋白酶处理，然后进行HCl处理，以在福尔马林固定切片中观察BrdUrd。他们发现在戊二醛固定的组织中需要高浓度的胃蛋白酶。Wilson等人回顾了这种方法在临床材料中的应用，特别是对于实体肿瘤，因为小于20 mg的小活检样本足以产生足够的细胞核用于通过FCM分析动力学参数。Hayashi等人表明蛋白酶处理允许在福尔马林中预先固定数周至数月的切片中可视化BrdUrd。 Van Erp等人在一步中将胃蛋白酶处理和酸水解相结合，得到良好的双变量分布，对人类包皮角质形成细胞和人骨髓细胞的细胞损失最小。Migheli等人比较了来自大鼠脑胚胎的福尔马林和多聚甲醛固定切片上的乙醇钠，甲酰胺，HCl，并且发现仅HCl有效地检测增殖的脑细胞。Thoolen等人使用450瓦微波在塑料嵌入组织上用45秒微波获得了类似的结果，先前用氯仿处理以溶解塑料，在60℃下用HCl洗涤10分钟。微波方法似乎是非常规的，在345个染色罐中的载玻片上进行孵育，染色溶液的温度将达到接近沸腾的温度 Kaufman和Robert-Nicoud等人使用了一种没有HCl水解的新技术。他们用pH8.3的Tris缓冲液中的亚甲基蓝氧化溶液处理乙醇固定的大鼠成肌细胞，随后用抗BrdUrd，抗肌动蛋白或抗2-巨球蛋白和Ho33258染色细胞。在Darzynkiewicz及其同事最近的一篇出版物中，Li等人使用含有BrdUrd的DNA的选择性光解，然后用由外源末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)催化的生物素-洋地黄毒苷-缀合的脱氧核苷酸标记链断裂。Larsen等人介绍了几种消除细胞悬浮液组织化学处理离心的简短方案。作为无洗涤技术，其通过在染色过程的每个阶段添加各种试剂来进行。最近的洗涤技术结合RNase，去污剂和EDTA或柠檬酸盐裂解细胞以提供细胞核，然后加入DNase I以打开DNA或1M HCl以使DNA部分变性 [26] 。用Tris缓冲液中和HCl，并将悬浮液与抗体和碘化丙锭一起孵育。这些无洗涤技术避免了离心，导致大多数细胞或核聚集。Landberg等人使用该方法研究了几种淋巴细胞系中的各种核抗原和DNA合成。

4. 第三代溴脱氧尿苷

Beisker等人，使用先前的组蛋白提取技术，然后在100℃蒸馏水中变性，发现FITC-抗B. BrdUrd荧光与BrdUrd掺入的持续时间成正比。当使用饱和浓度的抗体时和当用添加的胸苷进行BrdUrd标记以降低取代的BrdUrd的密度时，超过10,000秒。Hoy等人报道，在热变性期间，悬浮液中的细胞密度，变性液体的pH，细胞悬浮液的体积和DNA变性的长度是影响化学计量的因素。分析由于DNA修复而导入的BrdUrd进入G1细胞，检查变性时间，变性温度和DNA修复时间，以获得化学计量染色。在90℃变性15分钟的长修复时间(24~48小时)产生化学计量结果，即在非计划合成期间的BrdUrd掺入与紫外辐射水平或所用化学诱变剂的浓度成一定比例。

5. 展望

核苷系列药物的重要性是勿容置疑的，我们要加快核苷及衍生物的开发与生产。由于天然核苷的多样性，为了防止体内酶对各种特定的核苷酸片段的降解，需要在核苷或核苷酸的不同部位引入保护基或进行结构修饰；而且为了治疗不同的疾病或者抵抗与防止病毒与肿瘤细胞的抗药性，发展特殊结构的核苷类药物，就必须对核苷碱基核苷键构型等多方面进行改造，变换，开发出多种千变万化的适应治疗多种疾病的核苷类药物。为了促使中国核苷类药物及其中间体的快速发展，就应该主要从核苷碱基及核苷的保护与修饰方面去研究与开发。

参考文献

NOTES

^*通讯作者。