1. 背景介绍
ABO血型系统是人类最早发现的一种血型分类系统 [1]，在临床上具有重要意义。根据ABO基因参比序列(Genebank:NM_020469)，ABO血型基因位于人类染色体9q34.2，长度约25 kbp，包含7个外显子和6个内含子，基因编码糖基转移酶。A基因编码N-乙酰半乳糖转移酶，可使红细胞膜表面的H抗原的寡糖链末端携带N-乙酰半乳糖胺，成为A抗原。B基因表达半乳糖转移酶，可使H抗原的寡糖链末端携带半乳糖，成为B抗原。O基因由于碱基缺失形成移码变异，表达产物无酶活性，因此红细胞表面的H抗原无变化 [2]。O基因为隐形基因，A、B基因为共显性，二者对O基因完全显性。
根据Yamamato等人的研究 [3]，B基因的cDNA与A基因的cDNA相比有7个单碱基替换，分别是A294G，C523G，C654T，G700A，C793A，G800C，G927A。其中，C523G、G700A、C793A、G800C导致编码的氨基酸改变，使表达产物酶活性发生改变。G700A位点位于外显子7内，可被限制性内切酶Alu I、Msp I等特异性识别。O基因的cDNA发生258G缺失，导致第352位的TTA形成终止密码子TAA，提前终止翻译，使产物失去活性。这一位点位于外显子6内，可被Kpn I识别。
聚合酶链反应–限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)先PCR扩增目的片段，再用限制性内切酶特异性识别并切割待测DNA片段，然后对酶切产物进行电泳，最终，观察比较限制性图谱分析序列差异。PCR-RFLP技术可用于各种基因分型鉴定、细菌或真菌的菌种鉴定、基因突变的快速检测等。
本实验利用PCR-RFLP方法，利用两对引物分别扩增ABO基因的第6、7外显子片段，再根据A、B、O基因的序列不同，利用限制性内切酶特异性识别序列，通过酶切产物条带的不同来判断基因型。同时，通过对PCR产物直接测序并比对，再次验证基因型。
2. 实验材料与方法
2.1. 实验用品
2.1.1. 试剂
一管式口腔拭子DNA抽提试剂盒购自上海生工；引物由金唯智合成；高保真聚合酶试剂盒购自诺唯赞公司；DNA marker购自全式金公司；限制性内切酶购自NEB公司，测序由上海铂尚生物公司完成。
2.1.2. 仪器与耗材
灭菌棉签，EP管(1.5 mL、0.2 mL)，金属浴，PCR扩增仪，移液器，琼脂糖凝胶电泳装置，凝胶成像系统，离心机，250 mL锥形瓶，电子天平，药匙，微波炉，Nanodrop超微量分光光度计。
2.2. 实验方法
2.2.1. DNA提取
根据DNA抽提试剂盒的方法，用灭菌棉签刮取口腔上皮细胞，放入1.5 mLEP管，加入200 μL Qlysis-S Reagent和20 μL蛋白酶K，室温放置2 min，震荡混匀5 min。将灭菌棉签上的液体全部挤压在离心管内，弃掉棉签。室温放置5 min，95℃金属浴3 min。向离心管中加入200 μL buffer NST，震荡混匀，12,000 rpm室温离心5 min。取上清作为PCR扩增的DNA模板。分别提取笔者自己和班内另一名同学的DNA。
2.2.2. PCR扩增
根据参考文献 [4] [5]，设计2对引物如下。
引物 1: 5’-CGGAATTCACTCGCCACTGCCTGGGTCTC-3’；
引物 2: 5’-CGGGATCCATGTGGGTGGCACCCTGCCA-3’；
引物 3: 5’-GTGGAGATCCTGACTCCGCTG-3’;
引物 4: 5’-CACCGACCCCCCGAAGAA-3’。
引物1、2用于扩增包含6号外显子的片段，片段长度252 bp；引物3、4用于扩增7号外显子的片段，片段长度159 bp。PCR反应条件：95℃预变性5 min，94℃变性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸15 s，30个循环，72℃延伸5 min，最后4℃保温。PCR结束后使用Nanodrop测量产物浓度和纯度。
2.2.3. PCR产物鉴定及测序
用2%琼脂糖凝胶进行电泳，设定电压130 V，时间25 min。取9 μL PCR产物混合1 μL 10× loading buffer上样。如果得到目的条带，取20 μL PCR产物送测序。
2.2.4. 酶切消化
使用Kpn I消化引物1、2扩增的PCR产物，使用Alu I消化引物3、4扩增的PCR产物。酶切反应体系为20 μL，37℃金属浴3 h。
2.2.5. 酶切片段检测
配制3%琼脂糖凝胶进行电泳，设定电压130 V，时间30 min。取9 μL PCR产物混合1 μL 10×上样缓冲液上样，根据条带判断基因型。
2.2.6. 测序结果比对分析
使用MEGA-X，将测序结果与ABO基因参比序列(GeneBank: NM_020469)进行序列比对，判断基因型。
3. 实验结果
3.1. PCR-RFLP鉴定结果
引物1、2用于扩增一段包含第6外显子的252 bp的序列，用于区分O基因。O基因在该序列上有Kpn I酶的特异性识别位点，可被水解成169 bp和83 bp长度的两段DNA。但A、B基因上无法被识别，因此不会被酶消化。引物3、4用于扩增第7外显子上的159 bp长的序列，B基因在该区域上有Alu I的识别位点，可形成118 bp的条带，而A、O基因缺少识别位点。表1为酶切结果与对应的基因型。
本次实验提取了笔者和另一位同学的DNA进行鉴定，分别记为#1、#2。每人的DNA都用2对引物分别扩增，记为#1-12、#1-34、#2-12、#2-34。PCR产物浓度及纯度如表2所示，PCR电泳结果如图1(a)所示，酶切结果如图1(b)所示。PCR产物浓度较高，A260/A280在1.7~1.9范围内，表明DNA纯度较好，电泳条带清晰，无非特异性扩增，引物1、2扩增的片段均在252 bp处有条带，引物3、4扩增的片段均在159 bp处有条带，结果符合预期。#1-12、#2-12的酶切结果均只有252 bp一个条带，#1-34酶切结果只有159 bp条带，#2-34酶切结果有159 bp和118 bp两个条带，118 bp条带颜色略浅。根据酶切结果，对应表1，可知#1基因型为AA，#2基因型为AB。
Table 1. Digestion results and corresponding genotypes
表1. 酶切结果与对应基因型
Table 2. The concentration and purity of PCR products
表2. PCR产物浓度及纯度
(a) PCR产物电泳结果。#1-12是#1的DNA提取物用引物1、2进行PCR扩增的产物，长度为252 bp；#1-34是#1的DNA提取物用引物3、4扩增的产物，长度为159 bp。同理，#2-12、#2-34是#2的DNA提取物分别用引物对1、2和引物对3、4扩增的产物，分别长252 bp、159 bp。(b) 酶切反应结果。#1-12是#1的DNA提取物用引物1、2扩增，再用Kpn I酶切得到的产物，由图中可知仅有252 bp一个条带。#1-34是#1的DNA提取物用引物3、4扩增，再用Alu I酶切产物，仅得到159 bp条带。#2-12是#2的DNA提取物用引物1、2扩增，Kpn I酶切，得到一个252 bp条带。#2-34是#2的DNA提取物用引物3、4扩增，Alu I酶切，得到159 bp和118 bp两个条带
Figure 1. Electrophoresis results
图1. 电泳结果
3.2. 测序结果
#1-12、#2-12测序峰图清晰，无杂峰(如图2(a)和图2(b))，测序结果与参比序列比对后显示无碱基缺失(图2(e))，表明均不携带O基因。#1-34测序结果如图2(c)所示，信号清晰，结果表明不携带B基因。#2-34测序结果出现双峰位点，表明是携带B基因的杂合子。与参比序列比对的结果(图2(f))表明#1不携带B基因，#2携带B基因。综合所有测序结果，可得结论，#1基因型为AA，#2基因型为AB，与之前的PCR-RELP结果相一致。
(a) #1-12测序结果。O基因在箭头所指处碱基缺失。此结果表明该个体不携带O基因。(b) #2-12测序结果，该个体不携带O基因。(c) #1-34测序峰图。B基因在箭头所指处发生G→A替换。此结果表明该个体不携带B基因。(d) #2-34测序峰图，箭头所指处出现A、G双峰，表明该个体是携带B基因的杂合子。(e)和(f) 测序结果与参比序列比对结果。
Figure 2. Sequencing results
图2. 测序结果
4. 讨论
ABO血型系统是一套应用最广泛的血型分类系统，在临床输血、器官移植、法医检验鉴定等领域都有重要意义。血型的鉴定可通过抗原–抗体反应鉴定红细胞膜表面抗原种类，但这种方法只能区分不同表型，对A型血和B型血的个体不能确定是纯合子还是杂合子。A、B、O等位基因的关键差异在于几个位点的单碱基缺失或替换，因此，如果想鉴定个体基因型，可以对包含相关位点的片段进行测序；可以采用PCR-RFLP方法，选择能够识别相关位点的限制性内切酶，通过是否被酶切判断相关位点的序列情况；也可采用AS-PCR方法，根据相关位点的序列变化设计引物，通过扩增结果条带的有无、长度、数量来判断基因型。
本实验选择了PCR-RFLP方法。实验中根据参考文献、试剂使用说明等设计实验步骤，进行实验，根据实验结果修改步骤，以得到更好的实验数据。比如在PCR时，第一次PCR每种引物都加入2 μL，结果有引物二聚体生成，第二次PCR就将每种引物用量改为1 μL，得到的结果就没有引物二聚体(如图2(a)所示)。酶切反应时第一次使用50 μL反应体系，37℃反应30 min，电泳结果条带非常浅，不确定是否发生了酶切，推测可能是DNA含量太少的原因；第二次仍使用50 μL反应体系，增加反应体系中的DNA含量，延长反应时间为1 h，电泳结果条带依然很浅，有很模糊的酶切后的短条带形成，推测体系中DNA浓度仍然太低导致条带很浅，DNA含量太低或酶切不充分导致酶切后的短条带非常模糊；第三次为留出足够的PCR产物用于测序，改用20 μL反应体系，加入6 μL PCR产物，使体系中DNA浓度比之前更高，同时延长酶切反应时间至3 h，得到清晰结果(图2(b))。
通过本次实验，学生们对ABO血型系统有更深入的了解，同时，锻炼了查阅文献、设计修改实验方案的能力。本次实验是在遗传学实验《人的ABO血型测定》之后提出的自主性实验，希望学生们能够设计实验并检测自己血型所对应的基因型，是遗传学实验教学的有益尝试，达到了提高学生自主设计实验的目的，为以后的毕业设计打下坚实的基础。
基金项目
上海科技大学生命科学与技术学院本科生实验室运行经费——2019A0202-405-18。
NOTES
*通讯作者。