1. 引言
石榴，石榴科植物，又名安石榴。石榴皮是石榴的干燥果皮，我国云南、新疆、四川会理等地富产高品质石榴，而人们食用石榴后，通常把石榴皮作为废弃物扔弃，其实石榴皮是属于中药材中的一种，其性温、味苦涩，具有止血、杀虫、解毒的功效 [1]。石榴皮中含有多种有效成分，主要有鞣质、多酚类、黄酮类、色素、有机酸、生物碱、蛋白质、糖类化合物等 [2]，其中黄酮类化合物在石榴皮中广泛分布 [3]。根据现代药理学研究表明，它可以起到抗肿瘤、抗诱变、降血压、调节免疫系统、改善心血管系统等作用 [4] [5] [6]，并具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗衰老、清除自由基的活性 [7] [8] [9]。研究表明，天然的黄酮类化合物是一类来源广泛、获取成本低廉、提取方法简单可靠且具有强抗氧化性的抗氧化剂，黄酮类化合物既有药用价值，又有保健功能 [10]，同时还具有食用价值 [11]。目前，黄酮类化合物已被广泛应用于化妆品 [12]、药品 [4] [5] [6]、食品 [11] 等行业中，天然且廉价的黄酮类化合物的开发和利用价值不容小觑，为合理利用石榴皮这一废弃资源，更好地开发石榴皮的黄酮类化合物，响应可持续发展战略的号召，推广中药材的使用，本文将研究从四川会理石榴皮中提取黄酮类化合物的提取工艺优化。
根据研究表明 [13]，石榴各部位提取物中总黄酮含量依次为：石榴皮>石榴花>石榴籽；清除自由基的能力强弱依次为：石榴皮>石榴花>维生素Ｃ。目前已有的黄酮化合物的提取方法有超声辅助提取法、水浸提法、微波辅助浸提法、有机溶剂浸提法、酶辅助浸提法、超临界流体提取法等 [14] [15] [16] [17]，考虑到低成本、低能耗、操作简单、绿色环保、纯度高、提取率高等因素，本实验将采用超声辅助浸提法提取黄酮类化合物 [18]。紫外可见分光光度法由于其仪器设备简单、操作方便、测定快速、灵敏度高等优点 [19]，选择作为本实验总黄酮含量的测定方法。本实验将以总黄酮提取率为考察指标，采用超声辅助浸提法提取黄酮类化合物，结合紫外可见分光光度法测定提取物中总黄酮含量，对石榴皮中的黄酮类化合物的提取工艺进行优化，选择最佳颗粒大小、提取浓度、料液比、浸提时间等，提高总黄酮的提取率，同时为提取石榴皮中黄酮类化合物提供理论参考，为石榴皮的开发利用提供实验依据，提高石榴皮资源的利用价值。
2. 材料、试剂与仪器
2.1. 材料
石榴皮取自新鲜石榴皮(四川会理)，去除隔瓤后切成小片置于烘箱干燥至近恒重，粉碎后过筛目，储存于棕色广口瓶中，常温避光保存备用。
2.2. 试剂
芦丁标准品(四川维克奇生物公司)；亚硝酸钠(重庆茂业化学试剂有限公司，AR)、氢氧化钠(成都临江化工厂，AR)、硝酸铝(成都市科龙化工试剂厂，AR)、无水乙醇(成都市科龙化工试剂厂，AR)、石油醚(罗恩试剂，AR，沸程60℃~90℃)；超纯水。
2.3. 仪器
紫外可见分光光度计(UV-6300PC型，上海美谱达仪器有限公司)；超声波清洗仪(KQ3200E，昆山市超声仪器有限公司)；台式高速离子机(TG16-WS，长沙高新技术产业开发区湘仪离心机有限公司)；电子天平(FA2004C，上海越平科学仪器制造有限公司)；旋转蒸发仪(YRE2000B，巩义市予华仪器有限责任公司)；电热鼓风干燥箱(DHG-9145A，上海一恒科技有限公司)；隔膜真空泵(GM-0.33A，郑州长城科工贸有限公司)。
3. 试验方法
3.1. 标准溶液的配制
精密称取干燥的芦丁标准品(作为黄酮对照品) 5.0 mg，加入60%乙醇溶液溶解，定容至50 mL容量瓶中，配制成0.10 mg/mL的对照品溶液。
3.2. 供试品溶液的制备
将干燥的石榴皮粉末，过筛目，精密称取100目石榴皮粉末1.0 g，以1:60料液比加入60%乙醇60 mL，常温下浸提30 min，辅助超声30 min，取40 mL提取液以3000 r/min的转速条件下离心10 min，取上清液用超纯水定容至50 mL容量瓶，用0.45 μm微孔滤膜过滤，经旋转蒸发浓缩除去有机溶剂，超纯水定容浓缩液至50 mL容量瓶，石油醚与提取液1:1比例分液萃取，再次定容萃取液至50 mL，取1 mL于10 mL容量瓶中，超纯水定容，摇匀。
3.3. 标准曲线的制备
分别精密量取标准品芦丁溶液0.0、0.2、0.5、1.0、2.0、2.5、4.0 mL置于10 mL容量瓶中，加入5%亚硝酸钠0.3 mL，摇匀，放置6 min；10%硝酸铝0.3 mL，摇匀，放置6 min；4%氢氧化钠3 mL，摇匀，用60%乙醇定容，摇匀，放置15 min待其显色。取样品液在紫外可见分光光度计进行吸收光谱扫描(扫描波长范围为200~800 nm)，测出芦丁的最大吸收波长为520 nm，因此本实验在520 nm下直接测定吸光值，芦丁标准品溶液浓度(mg/mL)为纵坐标绘制出标准曲线，进行线性回归分析得出回归方程：A = 7.5865C − 0.0014，其中A—吸光度值，C—芦丁标准品浓度，线性相关系数：R = 0.9997，数据记录见图1。
3.4. 石榴皮中黄酮类化合物提取的单因素试验
精密称取石榴皮黄酮粉末1.0 g，考察在不同颗粒大小(20目、40目、60目、80目、100目)、不同乙醇浓度(0%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 100%)、不同料液比(1:10, 1:20, 1:40, 1:60, 1:80)、不同浸提时间(0 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 150 min)条件下，超声辅助30 min，取提取液以3000 r/min的转速条
件下离心10 min，取上清液用超纯水定容至50 mL，用0.45 μm微孔滤膜过滤，经旋转蒸发浓缩除去有机溶剂，超纯水定容浓缩液至50 mL，石油醚与提取液1:1比例分液萃取，再次定容萃取液至50 mL，取1 mL于10 mL容量瓶中，超纯水定容，摇匀。分别量取上述各容量瓶中溶液2 mL于10 mL容量瓶中，按照3.3方法显色，分别在520 nm下测定吸光度值，根据标准曲线计算总黄酮提取得率。
3.5. 石榴皮中黄酮类化合物提取的正交设计试验
根据3.4中单因素试验的结果，选择合适的石榴皮粉末颗粒大小、乙醇浓度、料液比、浸提时间，设计4因素3水平，按照L9(34)进行正交设计；选取最优方案进行验证试验，通过计算得出石榴皮黄酮在最佳条件下的提取得率。
4. 结果与分析
4.1. 单因素试验结果
4.1.1. 颗粒大小的选择
不同颗粒大小对黄酮类化合物提取率的影响数据记录见图2。
Figure 2. Effects of different particle size on extraction rate of flavonoids
图2. 不同颗粒大小对黄酮类化合物提取率的影响
随着石榴皮样品颗粒越小，原料的表面积越大，促进总黄酮溶解于提取溶剂，加速黄酮类化合物的浸出；当原料径粒过小，原料的表面积过大，吸附作用过强，影响物质的扩散作用，反而降低了黄酮类化合物的析出，并且不易滤过 [20]。综上，我们选择100目作为最佳提取颗粒大小。
4.1.2. 提取溶剂浓度的选择
不同乙醇浓度对黄酮类化合物提取率的影响数据记录见图3。
Figure 3. Effects of different ethanol concentrations on the extraction rate of flavonoids
图3. 不同乙醇浓度对黄酮类化合物提取率的影响
随着乙醇浓度增加，总黄酮提取率增高，当乙醇浓度继续增高时，黄酮提取率变化不大甚至降低，其主要原因可能是：当乙醇浓度较低时，石榴皮中黄酮类化合物的溶解性差，分离难，所需的物质析出较少；当乙醇体积分数继续增大大于70%时，提取物中黄酮类化合物基本达到平衡，而石榴皮中多糖、多酚类等其他物质含量增加，影响黄酮类物质的提取率测定 [21]。因此，选择60%乙醇作为最佳乙醇浓度。
4.1.3. 料液比的选择
不同液料比对黄酮类化合物提取率的影响数据记录见图4。
Figure 4. Effects of different liquid-solid ratio on extraction rate of flavonoids
图4. 不同液料比对黄酮类化合物提取率的影响
料液比为1:60时浸提效果最好，当液料比过大时，提取溶剂量过大，溶剂负荷增加，而总黄酮物质含量已达平衡，使得黄酮类物质的提取率反而降低；当料液比过小时，不易充分溶解和分离石榴皮粉末中的黄酮类物质，使得析出量少，而且提取上清液时不易操作 [22]。
4.1.4. 浸提时间的选择
不同浸提时间对黄酮类化合物提取率的影响数据记录见图5。
Figure 5. Effects of different extraction time on extraction rate of flavonoids
图5. 不同浸提时间对黄酮类化合物提取率的影响
在60 min时提取率达到最佳，当时间继续延长，浸泡时间对黄酮提取率影响不大，黄酮类物质已大量析出，继续浸提反而会增加其他杂质的溶出率，从而影响目的物质黄酮的纯度 [23]，考虑目的物质的纯度及时间效率，我们选择60 min作为最佳浸提时间。
4.2. 正交试验
正交试验结果如表1所示，四个因素对石榴皮总黄酮提取率影响程度为料液比>浸提时间>乙醇浓度>筛目。
Table 1. Orthogonal experiment design and results
表1. 正交试验设计及结果
4.3. 最佳工艺验证结果
为验证正交设计试验中优化条件C3D3B2A3的可靠性，我们以100目石榴皮粉末，60%乙醇为提取溶剂，料液比为1:60，浸提60分钟，超声30分钟，3000 r/min的转速条件下离心10 min为提取条件进行石榴皮总黄酮提取。将提取液的上清液过0.45 μm微孔滤膜，经旋转蒸发浓缩除去有机溶剂，超纯水定容浓缩液至50 mL，石油醚与提取液1:1比例分液萃取，再次定容萃取液至50 mL，取1 mL于10 mL容量瓶中，超纯水定容，摇匀。精密量取上述各量瓶中溶液2 mL于10 mL量瓶中，按照3.3方法显色，在520 nm下测定吸光度值，根据标准曲线回归方程分析得出总黄酮提取率为119.5 mg/g。
5. 讨论
石榴皮的品种、产地、实验室仪器设备、试验条件、操作人员等不同因素的影响，可能导致同类试验结果存在差异。牛俊乐等采用了超声波乙醇浸提法获得普通胭脂红石榴的石榴皮中的总黄酮含量148.09 mg/g [24]，但其超声时间较长，不利于实际操作与仪器维护；阮尚全等采用纤维素酶联合超声波协同提取攀枝花石榴皮总黄酮，得到总黄酮提取率为88.05 mg/g [26]；唐丽丽等采用乙醇回流法提取石榴皮总黄酮，提取率为102.80 mg/g [26]。与阮尚全、唐丽丽等的研究结果综合比较，本试验石榴皮中总黄酮提取技术操作简单，可有效缩短提取时间，提高生产效率。
6. 结论
本研究通过单因素试验和正交设计试验结果表明，颗粒大小、提取溶剂百分数、料液比、浸提时间4个因素对石榴皮总黄酮提取率的影响为料液比>浸提时间>乙醇浓度>筛目；确定了石榴皮总黄酮最佳提取工艺条件为：颗粒大小为100筛目，60%乙醇为提取溶剂，料液比为1:60，浸提60分钟，超声30分钟，该条件下石榴皮总黄酮的提取率为119.5 mg/g。
致谢
感谢成都中医药大学2018~2019年大学生科研实践创新重点课题ky-2019023的支持；感谢成都中医药大学校级教学改革建设项目JGYB201972、JGYB201975的支持；感谢成都中医药大学校级核心课程《物理思维与科研素养》建设基金的支持。
NOTES
#通讯作者。
*第一作者。