外生菌根真菌对排土场油松幼苗生长和根际土壤酶活性的影响

The Effect of Ectomycorrhizal Fungi on the Growth of Pinus tabulaeformis Seedlings and the Activities of Rhizospheric Soil Enzymes of Seedlings on Dump

摘要: 排土场的建设彻底破坏了矿区的生态环境，阻碍了植被恢复进程。本研究通过向排土场土壤中生长的油松幼苗接种外生菌根真菌牛肝菌-99和褐环乳牛肝菌，测定油松幼苗的生物量、叶绿素含量、光合指标和根际土壤酶活性的变化，探究将外生菌根真菌应用到排土场植被复垦中的可行性。结果表明，接种褐环乳牛肝菌后，油松幼苗的存活率、生物量明显提高；幼苗的叶绿素含量和光合指标明显升高；根际土壤酶活性显著提高(P < 0.05)，说明接种外生菌根真菌有助于排土场土壤中油松幼苗的生长，可以促进排土场植被恢复的进程。

Abstract: The construction of dump completely destroyed the ecological environment of mining area, obstructing the process of revegetation. In the study, Pinus tabulaeformis seedlings on dump soil were inoculated with Suillus collinitus-99 and S. luteus. Biomass, chlorophyll content, photosynthetic indexes and the activities of rhizospheric soil enzymes of seedlings were determined for exploring the feasibility of applying ectomycorrhizal biotechnology to revegetation. The survival rate and biomass of seedlings was significantly increased when seedlings are inoculated with S. luteus. Moreover, seedlings have more obvious growth chlorophyll content, photosynthetic indexes and the activities of rhizospheric soil enzymes of seedlings (P < 0.05). The results show that the growth of seedlings was significantly improved when inoculated with ectomycorrhizal fungi; ectomycorrhizal fungi can accelerate the process of revegetation.

1. 引言

煤矿资源开采形成的排土场，不仅破坏了当地的自然景观、造成土地生产率降低，而且彻底破坏了原有的生境，以及空气、水源的长期性破坏 [1]。对退化区土地进行植被恢复的目标就是促进土壤形成进程、防止水土流失、积累有机质、促进微生物群落的形成、启动营养循环等 [2] [3]。油松(Pinus tabulaeformis)是目前在我国植被恢复的主要树种之一。

外生菌根真菌(Ectomycorrhizal fungi, ECM fungi)能够与绝大部分陆上植物形成共生关系，其有助于宿主植物抵抗来自生物与非生物的胁迫 [4]。它在营养循环、种间关系和维护生态系统的物种多样性等方面发挥着主要作用 [5]。外生菌根真菌能够促进植物的生长、增强植物对干旱、重金属等逆境环境的耐受力 [6] - [12]。

韩桂云等人的研究表明，接种菌根菌剂可以提高矿区泥岩中生长的植物的存活率，调控土壤条件 [13]。利用外生菌根真菌对排土场植被恢复的研究相对较少。

本文探究牛肝菌(Suillus collinitus)-99、褐环乳牛肝菌(S. luteus)对哈尔乌素露天煤矿排土场土壤基质中生长的油松幼苗生长及根际土壤酶活性的影响，探索外生菌根菌剂在矿区排土场复垦中的应用的可行性，为矿区退化土地的植被恢复提供一条新思路。

2. 材料和方法

2.1. 材料

供试菌株和植物外生菌根真菌菌种由内蒙古农业大学林学院闫伟教授馈赠，油松种子为本实验室保藏。

主要培养基Pach固体培养基和MMN液体培养基配方 [14]。

供试土壤：土壤于2019年5月采自内蒙古鄂尔多斯准格尔旗哈尔乌素露天煤矿排土场。

2.2. 方法

菌剂的制备：用Pach固体培养基对菌种进行活化培养。获得活力旺盛的菌丝体后，于无菌环境将菌丝体接种到装有MMN液体培养基的锥形瓶中，在摇床上120 r/m培养15 d，温度为28℃，备用。

盆栽试验：试验于2019年5月30日至10月30日，在内蒙古大学菌根生物研究室进行。将挑选出的籽均匀、粒饱满油松种子以10% NaClO溶液浸泡15 min后，用无菌蒸馏水冲洗干净后催芽。于高13 cm、直径为10 cm装有1.5 kg土的花盆中，播种10粒萌发的油松种子，共设4个梯度：(1) CK：未接种菌剂；(2) M₁：接种菌剂牛肝菌-99；(3) M₂：接种褐环乳牛肝菌；(4) M₁ + M₂：牛肝菌-99、褐环乳牛肝菌(各2.5 ml)混合接种。未接种处理则注入5 ml灭菌培养基，作为对照。每处理重复5次。

培养条件为：水分控制在土壤最大持水量的75%~80%；光周期为14 L:10 D；培养温度为27℃；空气湿度为70%~80%。

2.3. 测定项目

生物量：每处理选取10株幼苗进行生物量的测定。

菌根依赖性及菌根侵染率：采用计数统计法测定菌根侵染率，并测定感染级数 [15]。将根剪成1 cm的根段，每处理随机选取50根段。

$菌根依赖性=\frac{接菌植株的干重}{未接菌植株的干重}\times 100\text{\%}$

$菌根的侵染率=\frac{形成外生菌根的根段数}{观察的总根段}\times 100\text{\%}$

光合指标：采用Li-6400P便携式光合系统测定仪和叶面积仪，于2013年10月25日上午9:00测定了植株的光合作用、叶面积等指标，并测定了幼苗的叶绿素含量 [16]。

土壤酶活性：将风干土壤过1 mm筛，备用。过氧化氢酶活性测定 [17]，单位为mg H₂O₂ g⁻¹；脲酶活性测定 [18]，单位为mg NH+ 4-N∙g⁻¹∙d⁻¹；蔗糖酶活性测定 [18]，单位为酚mg∙g⁻¹∙d⁻¹；碱性磷酸酶活性测定 [19]，单位为酚mg∙g⁻¹∙d⁻¹。

2.4. 数据的处理和统计分析

试验数据的采集及分析通过Microsoft Excel (version 2007)和SPSS Statistics (version 20.0 for Windows)软件完成。

3. 结果与分析

3.1. 接菌处理对油松幼苗生物量的影响

接种菌剂组油松幼苗的针叶相较于对照组，有明显增长，针叶较为浓绿，菌剂的促生效果明显。

与对照组相比，接种菌剂组油松幼苗的存活率显著提高，成活率提高百分率为：M₂ (48%) > M₁ (37%) > M₁ + M₂ (30%)。接种牛肝菌-99与褐环乳牛肝菌，均使得油松幼苗的鲜重、干重、地上部鲜重、地上部干重、地下部鲜重、地下部干重显著高于对照组(P < 0.05) (表1)。处理M₂相对于CK，油松幼苗的鲜重、干重、地上部鲜重、地上部干重、地下部鲜重、地下部干重分别提高160.62 mg、73.59 mg、123.48 mg、37.08 mg、42.69 mg、30.9 mg，增长率分别达到136.37%、157.74%、130.54%、160.2%、134.72%、206.41%、32.63%，根冠比提高15.4%。处理M₂相较于M₁与M₁ + M₂，油松幼苗的生长指标差异显著(P < 0.05)。

Table 1. The effect of mycorrhiza on the growth of P. tabulaeformis seedlings

表1. 接菌处理对油松幼苗生长的影响

注：平均值 ± 标准误。同列中不同字母表示不同处理间的同一指标数据存在显著差异(P < 0.05)。

3.2. 接菌处理对油松幼苗菌根依赖性及菌根侵染率的影响

菌根依赖性(MD)被用来衡量植物对菌根菌依赖程度的大小，也可以指示菌根真菌与植物的共生效果、促生作用 [20]。油松幼苗的MD为M₂ > M₁ > M₁ + M_2，分别为257%、182%、181%。因此油松幼苗对与褐环乳牛肝菌形成的菌根有中等强度的依赖性，对与牛肝菌-99形成的菌根依赖性较弱。

接菌油松幼苗根部，均有外生菌根真菌侵染，感染级数均已达到5级；侵染率自大到小为M₂ (96%) > M₁ (80%) > M₁ + M₂ (75%) > CK。各接种组与CK间的侵染率差异显著，M₂与M₁、M₁ + M₂侵染率存在显著差异(P < 0.05)。

3.3. 接菌处理对油松幼苗光合指标的影响

与CK相比，接菌显著提高了油松幼苗的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素、类胡萝卜素的含量(P < 0.05) (表2)。接种处理间叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素的含量存在差异显著，M₂最高，分别达到1.26、0.36、1.62 mg∙g⁻¹ FW，较对照提高41%、50%、43%，其次是M₁、M₁ + M₂。处理M₂、M₁与处理M₁ + M₂和CK的类胡萝卜素的含量(表2)表现出显著差异。

M₂、M₁与CK的叶面积存在显著差异(P < 0.05)，分别高于CK 0.11、0.1 cm²，接种组间不存在显著差异(表2)。M₂、M₁、M₁ + M₂与CK的净光合速率间存在显著差异(P < 0.05)，M₂ > M₁ > M₁ + M₂ > CK，分别较对照提高了86.35、75.03、47.72 μmol CO₂ m⁻²∙s⁻¹，说明接种褐环乳牛肝菌与牛肝菌-99提高了油松幼苗进行光合作用的速率(表2)。接种组间也存在显著差异。

接种处理的气孔导度差异显著(表3)，M₂最大，较对照增加了7.81 mmol H₂O m⁻²∙s⁻¹，接种组间差异不显著(P < 0.05)。说明接种褐环乳牛肝菌与牛肝菌-99可以影响油松幼苗调节叶片气孔的张开程度，进而调节油松幼苗的光合作用、呼吸作用和蒸腾作用。

Table 2. The effect of mycorrhiza on the chlorophyll content and photosynthetic characteristics of P. tabulaeformis seedlings

表2. 接菌处理对油松幼苗叶绿素含量和光合特性的影响

注：平均值 ± 标准误。同列中不同字母表示不同处理间的同一指标数据存在显著差异(P < 0.05)。

Table 3. The effect of mycorrhiza on the activity of rhizospheric soil enzymes of P.tabulaeformis seedlings

表3. 接菌对油松幼苗根际土壤酶活性的影响

注：平均值 ± 标准误。同列中不同字母表示不同处理间的同一指标数据存在显著差异(P < 0.05)。

接种菌剂褐环乳牛肝菌与牛肝菌-99显著提高了油松幼苗的蒸腾速率，M₂ > M₁ > M₁ + M₂ > CK，较对照分别提高了0.32、0.29、0.21 mmol H₂O m⁻²∙s⁻¹，说明接种外生菌根真菌可以提高油松幼苗的蒸腾速率，促进植株的蒸腾作用。

3.4. 接菌处理对油松幼苗根际土壤酶活性的影响

土壤脲酶活性在不同接菌处理间差异显著，处理M₂显著高于其他处理。脲酶的活性：M₂ > M₁ > M₁ + M₂ > CK，分别为：7.7167、5.7133、5.5467、4.7733 mg NH+ 4-N∙g⁻¹∙d⁻¹；脲酶活性提高率为：16%~62%。过氧化氢酶的活性：M₂ > M₁ > M₁ + M₂ > CK，分别为：0.9304、0.6838、0.4986、0.3337 mg H₂O₂ g⁻¹；M₂比对照提高了178.85%，其他接种处理提高率为：49%~104%。

蔗糖酶的活性：M₂ > M₁ > M₁ + M₂ > CK，分别为：6.4523、4.537、4.2412、3.6965 mg葡萄糖∙24 h，接种处理提高率为：74.55%、22.74%和14.74%。碱性磷酸酶的活性为：M₂ > M₁ > M₁ + M₂ > CK，分别为5.3269、4.1137、3.4087、2.5832 mg/g。接种处理提高率为：106.2%、59.24%和31.95%。

4. 讨论

排土场的植被恢复受到多方面因素的制约。排土场的建设彻底改变了矿区的土壤结构，土壤养分和土壤酶活性极低，不利于复垦植物的生长。

接种牛肝菌-99、褐环乳牛肝菌提高了排土场土壤中油松幼苗的存活率、生物量，促进幼苗的生长，增加植物体内干物质的积累，这与韩桂云等(2002)、王艺(2013)、张文泉等(2013)的研究结果相似。其中，褐环乳牛肝菌的促生作用较为明显，油松幼苗对其具的菌根依赖性较高。

接菌处理显著提高了油松幼苗的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素的含量，增加了幼苗叶片中的光合色素含量。同时，两种外生菌根真菌还提高了幼苗的叶面积、净光合速率、气孔导度和蒸腾速率，有利于植物进行光合作用。这与高悦等(2010) [21]、Choi DS (2005) [22] 和宋薇(2011) [23] 的的研究结果基本一致。

土壤酶活性常被用来表征土壤养分状况、微生物代谢活动等。退化土壤中土壤酶活性的变化可以反映土壤的熟化程度。本研究发现幼苗根际的土壤酶活性在接菌组中显著提高，其中过氧化氢酶活性提高率最高，为49%~104%，其次为碱性磷酸酶、蔗糖酶和脲酶。M₂接种效果最好，对土壤酶活性的提高最显著。排土场土壤中生长的油松幼苗根际的土壤酶活性的提高，可以说明这两种外生菌根真菌有助于改善排土场土壤环境，促进土壤熟化。

5. 结论

本研究发现接种褐环乳牛肝菌后，较对照比较，油松幼苗的存活率提高了30%~48%、生物量提高了30.92 mg~160.56 mg；幼苗的叶绿素含量提高了41%、50%、43%；净光合速率明显升高了86.35、75.03、47.72 μmol CO₂ m⁻²∙s⁻¹；蒸腾速率分别提高了0.21~0.29 mmol H₂O m⁻²∙s⁻¹；根际土壤酶活性显著提高，脲酶活性提高率为16%~62%。过氧化氢酶的活性提高了49%~178.85%。蔗糖酶的活性提高了14.74%~74.55%。碱性磷酸酶的活性提高了31.95%~106.2%。说明接种外生菌根真菌有助于排土场土壤中油松幼苗的生长，可以促进排土场植被恢复的进程。

基金项目

国家重点研发计划课题：深部煤矿安全绿色开采理论与技术(2016YFC0600708)；国家能源集团科技创新项目：“煤炭开采水资源保护与利用”国家重点实验室—神东矿区采动破坏岩土的自修复及其环境效应(GJNY-18-77)；神东科技创新项目：神东采煤沉陷区生态系统稳定性研究(201691548939)。

NOTES

^*通讯作者。