1. 引言
蝉花是一种传统名贵的药食同源中药材之一，系由蝉棒束孢寄生于山蝉幼虫形成的复合体 [1]。尽管蝉花在中医药中有着悠久的历史，其很多药理活性缺乏明确的证据。据推测，其活性功能包括：治疗疟疾、减轻心悸、增强凝血、抗肿瘤以及改善健康等 [2]，此类状况均与免疫反应有关 [3]。据报道，野生蝉花提取物能明显增强小鼠的体液免疫功能，并能显著提高巨噬细胞的吞噬作用 [4]。由于天然野生蝉花资源较为短缺，其人工培养受到越来越多的关注。本文拟考察固体培养的蝉花子实体纯粉对小鼠体液免疫功能的影响，以期为人工培养蝉花的应用提供理论支持。
2. 材料与方法
2.1. 材料
2.1.1. 供试材料
样品：蝉花子实体纯粉由浙江泛亚生命科学研究院提供。
实验动物：雄性SPF级ICR小鼠(实验动物生产许可证号为SCXK(沪)2017-0005，合格证号：20170005023759，初始体重18~22 g)购买自上海斯莱克实验动物有限责任公司。40只ICR小鼠随机分为4组：高、中、低剂量组及对照组，每组10只。
2.1.2. 仪器与试剂
主要实验仪器：恒温水浴锅(DK-S22，上海精宏)、离心机(5804R，Eppendorf，德国)、二氧化碳培养箱(150i，Thermo，美国)。
主要试剂及耗材：绵羊红细胞(SRBC) (索莱宝，北京索莱宝科技有限公司)、补体(豚鼠血清)(索莱宝，北京索莱宝科技有限公司)、Hank’s平衡盐溶液液(索莱宝，北京索莱宝科技有限公司)、RPMI1640细胞培养液(索莱宝，北京索莱宝科技有限公司)、SA缓冲液(AMEKO，上海联硕生物科技有限公司)、琼脂糖(Thermo Fisher，美国)、羧甲基纤维素钠(Sigma-Aldrich，美国)及无菌生理盐水(索莱宝，北京索莱宝科技有限公司)、200目滤网、微量血凝实验板(索莱宝，北京索莱宝科技有限公司)。
2.2. 方法
按照《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)的规定检测指标，并参照白巍、吴小丽等的方法进行 [5] [6]。
2.2.1. 剂量选择、受试样品给药方式和时间
蝉花子实体纯粉的人体推荐摄入剂量为0.9 g/d，按人体平均60 kg计，剂量为0.015 g/kg。参考《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)的规定及相关文献，以人体推荐量的5倍设为低剂量组(0.075 g/kg)，10倍设为中剂量组(0.15 g/kg)，30倍设为高剂量组(0.45 g/kg)，蒸馏水作为阴性对照组。分别取样品1.5、3.0及9.0 g以1%羧甲基纤维素钠溶液定容至200 mL，灌胃给药，灌胃体积为0.10 mL/10g。每天1次，连续30天。
2.2.2. 抗体生成细胞检测
将0.5 g琼脂糖加去离子水至100 mL，加热溶解后在清洁玻片上刷一薄层备用。向每只ICR小鼠腹腔注射0.2 mL压积SRBC细胞悬液(2% (v/v)，以生理盐水为溶剂)，4~5天后将小鼠脱臼处死，分离脾脏后以Hank’s 液清洗并用RPMI1640 培养基制成悬液，将细胞计数后调整其浓度为5 × 106个/mL。1 g琼脂糖加去离子水100 mL加热溶解后45℃水浴保温，并与等体积2×的Hank’s液混匀后分装于小试管中，每管体积0.5 mL。分别向每只小试管内加入50 μL 10% SRBC及20 μL脾细胞悬液，迅速混匀后倒于上述预处理的玻片上，每组三个平行样品。琼脂糖凝固后将玻片水平扣于玻片架上，CO2培养箱中孵育1 h，然后加入稀释后的补体(以SA 缓冲液1:8稀释)至玻片架凹槽，继续于CO2培养箱中孵育1 h后计算溶血空斑数。
2.2.3. 血清溶血素的测定实验(血凝法)
以2.2.2中方法免疫小鼠，4天后眼眶取血，静置1 h后2000 r/min离心10 min，取上层血清备用。将血清以生理盐水按不同倍比稀释后转移至96 孔微量血凝实验板内，加样体积为每孔100 μL，并加入等体积的SRBC 的悬液(0.5% (v/v))，小心混匀后于CO2培养箱中加盖孵育3 h，观察血球凝集程度，按下面公式计算小鼠抗体积数。
式中1、2、3…n代表对倍稀释的指数，S代表凝集程度的级别，抗体积数越大，表示血清抗体越高。
0级红细胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圆点状，四周液体清晰。
I级红细胞大部分沉集在孔底成园点状，四周有少量凝集的红细胞。
II级凝集的红细胞在孔底形成薄层，中心可以明显见到一个疏松的红点。
III级凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，中心隐约可见一个小红点。
IV级凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，凝块有时成卷折状。
2.2.4. 数据统计分析
实验数据以均值±标准差表示，采用SPSS统计软件(版本19.0，IBM，美国)进行方差齐性检验和单因素方差分析。P < 0.05认为具有统计学上显著差异，P < 0.01表示具有统计学上极显著差异。
2.2.5. 动物伦理
本动物实验获得上海睿太莫斯生物科技有限公司实验动物福利与伦理委员会批准。
3. 结果与分析
3.1. 蝉花子实体纯粉对小鼠脏器/体重比值的影响作用
如表1所示，与阴性对照组比较，蝉花子实体纯粉各剂量组对小鼠脏器/体重比值的影响不具有显著差异(P > 0.05)。
Table 1. Effect of pure powder of Cordyceps cicadae fruit body on organ/weight ratio of mice (mean ± SD, n = 10)
表1. 蝉花子实体纯粉对小鼠脏器/体重比值的影响(均值±标准差，n = 10)
3.2. 蝉花子实体纯粉的体液免疫功能研究
3.2.1. 蝉花子实体纯粉对小鼠抗体生成细胞的影响
与阴性对照组比较，蝉花子实体纯粉低、中、高剂量组均能显著提高小鼠的溶血空斑数，差异具有极显著性意义(P < 0.01)，结果见表2。
Table 2. Effect of pure powder of Cordyceps cicadae fruit body on the number of hemolytic plaque in mice
表2. 蝉花子实体纯粉对小鼠溶血空斑数的影响
注：与阴性对照组比较，**P < 0.01。
3.2.2. 蝉花子实体纯粉对小鼠血清溶血素(抗体积数)的影响
与阴性对照组比较，蝉花子实体纯粉中剂量组及高剂量组可以显著提高抗体积数，差异有显著性意义(P < 0.01)，结果见表3。而低剂量蝉花子实体纯粉摄入则未对小鼠的抗体积数产生显著影响。
Table 3. Effect of cicada flower fruiting body on antibody product in mice
表3. 蝉花子实体对小鼠抗体积数的影响
注：与阴性对照组比较，**P < 0.01。
4. 结论与讨论
免疫力是机体自身的一种防御机制，能协助机体识别并清除外来异物及自身衰老或受损细胞，受饮食、睡眠、运动及压力等多种因素影响。其中，饮食对免疫力影响较为显著，有些食物或药物组分能对其产生显著影响。通常认为蝉花中的多糖成分具有免疫调节功能。Weng等发现水–甲醇(50%)提取的蝉花部分CC-1-2能增强植物凝集素激活的人单核细胞的增殖，而其100%甲醇提取部分CC-2-1所发挥作用正与之相反，可能通过增强或抑制IL-2及IFN-γ的生成发挥作用 [7]。何晓波等发现蝉花多糖能有效促进细胞免疫及体液免疫 [8]。蝉花多糖能促进树突状细胞向成熟期转化，从而提高免疫力 [9]。宋佳敏等证明蝉花多糖能显著提高小鼠的脾脏、胸腺以及肝脏指数 [10]。而本研究中固体培养的蝉花子实体纯粉低、中、高剂量灌胃对小鼠的胸腺和脾脏指数则未产生显著影响，可能的原因是本实验的受试物为子实体纯粉而非分离纯化后的蝉花多糖或其他具有免疫调节功能的活性组分，活性成分浓度相对较低所致。然而，该子实体纯粉能显著提高小鼠的体液免疫功能，说明人工固体培养的蝉花子实体纯粉在增强免疫力方面具有广阔的应用前景。
本实验以固体培养的蝉花子实体纯粉0.075 g/kg (低剂量)、0.15 g/kg (中剂量)及0.45 g/kg (高剂量)三个剂量经口灌胃小鼠一个月，考察其对小鼠体液免疫功能的影响。结果表明，固体培养的蝉花子实体纯粉能显著影响小鼠的抗体生成细胞及抗体积数，说明固体培养的蝉花子实体纯粉具有增强体液免疫功能，能有效增强机体免疫力。而具体发挥免疫调节作用的活性成分及其作用机理则需进一步深入研究。
基金项目
国家自然科学基金资助项目(81873245)；上海市高级中西医结合人才计划(NO. ZY(2018-2020)-RCPY-2002)。
NOTES
*通讯作者。