1. 引言
柑桔又称为宽皮橘、松皮橘，古时称为黄甘。归类于芸香科，柑橘属，木本。原产于我国，主要种植于长江流域及江南。柑桔在我国已有4000余年的食用历史 [1]。中国是全球柑橘生产种植的大国，柑橘种植面积居世界首位，年生产总量居世界第二位 [2]。伴随着高产量的同时，桔皮所带来的浪费也不可小觑。桔皮作为新鲜食品的下脚料其用于加工的数量只占柑橘总产量的20%左右，柑桔中含有丰富的水分、纤维素和木质素，这些都是人体所必需的，另外还含有丰富的营养保健成分如：香精油、色素、果胶、橙皮甙等 [3]。
响应面法可以有效地用高效数理统计方法建立回归模型 [4]，评价多种变量，并确定最优条件，提供理想的结果 [5]，此方法成功地克服了传统方法所具有的局限性 [6]。
酵素为酶的旧称 [7]。但当今，酵素已经不仅仅用来形容酶，还形容了其及其产酶微生物和有关调节因子以及之间的相互作用 [8]。自从20世纪以来利用一种或多种水果、蔬菜、食用菌、中草药为制作酵素的原料 [9] [10]，酵素中所含的营养成分，其保健功能主要来源于原料本身所含的营养成分和提取物中所含的黄酮类、植物色素、超氧化物歧化酶(SOD)等活性成分 [11]，超氧化岐化酶(SOD)也为评价酵素质量的最重要指标 [12]。
本试验使用酵母菌作为发酵剂发酵新鲜柑桔桔皮制备桔皮酵素。根据不同发酵条件所测得的SOD活力，得到最佳配比，对桔皮酵素进行工艺优化。
2. 材料与方法
2.1. 材料与试剂
柑桔(砂糖桔)选购于大润发超市；安琪高活性干酵母粉 安琪酵母股份有限公司；柠檬 选购于大润发超市；红糖 辽宁省帝华味精食品有限公司；三羟甲基氨基甲(Tris)；HXSJ-021154乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)；盐酸；邻苯三酚(焦性没食子酸)；硝酸银；硝酸；乙酸锌；硫酸铁铵；亚铁氰化钾；硫氰酸钾；氯化钠；95%乙醇。以上等级皆为分析纯，杰辉生物科技发展有限公司。
2.2. 仪器与设备
TG16MW高速台式离心机：湖南赫西仪器装备有限公司；YXQ-30SII立式高压蒸汽灭菌器：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；紫外可见分光光度计：天津市特纳科学仪器有限公司；WZS手持式折光仪：上海仪电物理光学仪器有限公司；MIR-254恒温培养箱、HH-S水浴锅：上海精密科学仪器有限公司； XJA微型粉碎机：北京北信科仪分析仪器有限公司；FA2004B 型电子天平：上海心仪仪器科技有限公司； WTTLAB型移液枪：北京星越天成科技有限公司；PHSJ-3F酸度计：赛科环保科技有限公司；SW-CJ-2F超净工作台：深圳市惠士顿科技有限公司；486恒温烘箱：北京东方大林科技有限公司；DK电热恒温数显水浴锅：常州迈科诺仪器有限公司。
2.3. 试验方法
除了一些众所周知的英文缩写，如IP、CPU、FDA，所有的英文缩写在文中第一次出现时都应该给出其全称。文章标题中尽量避免使用生僻的英文缩写。
2.3.1. 工艺流程
红糖→干燥
↓
桔皮→破碎→成分调整→杀菌→接种酵母菌→发酵→发酵液→SOD活力测定。
2.3.2. 单因素及响应面试验
以发酵时间(3、4、5、6、7、8天)、初始pH (3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0)、酵母菌的接种量(0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%)、加糖量(12%、14%、16%、18%、20%、22%)为因素，在发酵时间4天、初始pH4、0.15%的酵母菌接种量、18%的加糖量、27℃的温度下发酵，其余条件不变，测定其SOD活性，分别进行单因素试验。
Box-Behnken响应面法优化桔皮酵素加工工艺 [13]。基于单因素试验所得的数据，根据Box-Behnken实验的设计原理，SOD活性被用作响应值，发酵时间、初始pH值、接种量和加糖度是四个因素，设计四因素三水平响应面。响应曲面实验的因素与水平见于表1，以得到最适于桔皮酵素的发酵条件，使工艺得到优化。
Table 1. Box-Behnken response surface test factors and levels
表1. Box-Behnken响应面试验因素与水平
2.3.3. SOD活力测定方法
采用改改良的Marklund法对SOD活性进行测定。使用SOD标准品作为对照可以更准确地测定SOD活性 [14]。当邻苯三酚处于碱性条件下会产生自动氧化，按照邻苯三酚自氧化被SOD抑制的能力得到SOD活性 [15]。
2.4. 产品品质测定
2.4.1. 感官评定
酵素为发酵型食品，感官要求至关重要 [16]。根据我国GB12310-GB12316对感官的要求，从酵素的外观、香气、滋味这三方面 [17]，制作感官评定评分表，见表2。
2.4.2. 表格
酒精度：依照我国《葡萄酒、果酒通用分析方法》，使用酒精计法测定酒精度。
氯化钠：按照我国GB/T 12457-2008所规定的测定方法，采用容量法测定样液的氯化钠含量。
菌落总数：依据标准GB 4789.2-2016所规范的平板计数法测定试样的菌落总数。
大肠菌群计数：采用国家标准GB 4789.3-2016所规定大肠菌群平板计数法测定大肠菌群数。
3. 结果与分析
3.1. 酵母菌发酵桔皮酵素单因素实验结果
3.1.1. 发酵时间对SOD活性的影响
桔皮酵素在pH4的初始值、0.15%的酵母菌接种量、18%的加糖量、27℃的发酵条件下，由图1可知，SOD活力波动幅度较大，当发酵时间为1~4天时，SOD活力上升较快，在4天时达到最高点1226.35 U/ml，当大于4天小于6天时，活力下降，在7天与8天时有一个小范围波动。因而，当在发酵第4天时，SOD活性最高。
Figure 1. Effect of fermentation time on SOD activity
图1. 发酵时间对SOD活性的影响
3.1.2. 初始pH值对SOD活性的影响
桔皮酵素在4天的发酵时间、0.15%的酵母菌接种量、18%的加糖量、27℃的温度下发酵，使用新鲜柠檬调节酸度，以SOD活力为评价指标，由图2可知，随着pH的逐步提升，SOD活力也随之提高，在pH4时到达最高点，为1224.63 U/ml，当初始pH大于4后SOD活性开始下降。因此可认定在此条件下最适初始pH为4。
Figure 2. Effect of initial pH on SOD activity
图2. 初始pH对SOD活性的影响
3.1.3. 接种量对SOD活性的影响
桔皮酵素在发酵时间4 d、初始pH 4、加糖量18%、27℃条件下发酵，以SOD活力为评价指标，由图3可知，随着接种酵母菌量的增多，SOD活力因此而升高，当酵母菌的接种量到达0.20%时，活性最高，达1170.26 U/ml，当接种量超过0.20%，SOD活性开始逐步迟缓下降。因而可认定在此条件下最适酵母菌接种量为0.20%。
Figure 3. Effect of inoculation amount on SOD activity
图3. 接种量对SOD活性的影响
3.1.4. 加糖量对SOD活性的影响
桔皮酵素在发酵时间4 d、酵母菌接种量0.15%、加糖量18%、27℃的温度下进行发酵，以SOD活力为评价指标，由图4可知，当加糖量为范围为12%~18%时，SOD活力随加糖量上升而上升，加糖量为18%时SOD活力为1175.63 U/ml，当加糖量大于18%时，SOD活力逐渐降低。由此实验可认定，在此条件下，最优加糖量为18%。
Figure 4. Effect of sugar content on SOD activity
图4. 加糖量对SOD活性的影响
3.2. Box-Behnken响应面试验结果及试验设计
基于单因素实验所得的结果，按照Box-Behnken的试验设计原理进行响应面试验。一般包括以下的几个步骤: 试验设计、模型的构建与检验、最佳组合条件的优化及验证等 [18]。响应值设定为SOD活性，四个因素分别为发酵时间、初始pH、接种量、加糖量，对发酵工艺进行优化，制订科学的试验设计方案，结果见表3。
Table 3. Response surface test design scheme and results
表3. 响应面试验设计方案及结果
3.2.1. 模型的构建与检验
基于此结果，运用Design-Expert 11v程序对表3实行模型构建，得到的多元二次回归方程，如下：
进行方差分析及其显著性检验用于模型的检验，结果见于表4。
基于表4方差分析所示，可知：此模型的P < 0.0001，证实为极显著，失拟项P = 0.3138 > 0.05，证实为不显著。模型方差分析中A2、B2、C2、D2的P值均 < 0.0001，证明影响极为显著。而交互的AB、
Figure 5. Interaction response surface and contour map of each fact
图5. 各因素交互响应面图及等高线图
AC、AD、BC、BD、CD的P值均>0.05，证明影响不显著。R2值为0.9083说明此模型拟合性较好。
运用Design-Expert 11v程序，对四种因素交互性影响实行数据处理，取得此回归方程的响应面图及等高线图，于图5所示。如图5所示，等高线轮廓的形态可以反映出各因素之间彼此作用的强弱情况，形状为椭圆表示这两个因素之间彼此作用强烈，圆形则相反 [19]。图中交互的AB、AC、AD、BC、BD、CD等高线形状均为圆形，相互作用不强烈，与方差分析得到的结果并无差别。
3.2.2. 表格
经由Design-Expert 11v软件的数据处理结果，所显示的最优发酵条件为：3.941天发酵时间，初始pH3.954，0.203%的酵母菌接种量，18.109%的加糖量，软件所预测的SOD活力为1219.68 U/ml。
为验证此最佳发酵条件，并操作便捷，采用的发酵条件为：发酵时间：4天，初期pH4，接种量0.2%，加糖量18%，所测得的SOD活力为1216.35 U/ml，与软件所预测SOD活力相差较小，说明，此模型合理，可为桔皮酵素的制备，生产，加工提供一定的依据与参考。
3.3. 产品品质测定结果
3.3.1. 感观指标
基于响应面所得到的最适发酵条件，制得的桔皮酵素产品，经10位经过培训的，不同性别、不同年龄对产品的感官评价，根据感官评定评分表进行打分，所得到的平均分为8.5分。对产品的普遍评价为：果香较少，色泽浅黄色透明清澈，酸甜适宜，无苦涩味。
3.3.2. 表格
按照团体标准T/CBFIA 08003-2017《食用植物酵素》所规定的要求，本产品所测得的酒精度、氯化钠含量、菌落总数、大肠菌群数均符合标准。
酒精度：0.3 g/100 g < 0.5 g/100 g
氯化钠：0.1 g/100 g < 0.2 g/100 g
菌落总数：86 CFU/ml < 102 CFU/ml
大肠菌群数：1 MPN/100 ml < 10 MPN/100 ml。
4. 结论
通过实验证明，以新鲜柑橘桔皮为原料，酵母菌为发酵剂，制得的桔皮酵素最优发酵条件为：发酵时间4天，初始pH4，酵母菌接种量0.2%，加糖量18%，可以测得的SOD活力为1216.35 U/ml。产品感官良好，既安全保健价格低廉，又可为减少桔皮的浪费起到帮助作用。此实验可为桔皮酵素的生产、制备和加工提供依据和参考。