阴道保健潜力的乳酸菌的分离、鉴定与筛选

Isolation, Identification and Screening of Lactic Acid Bacteria with Potential Vaginal Health Care

摘要: 本研究旨在分离和筛选具有潜在女性私密护理作用的乳酸菌(LAB)。收集女性一次性卫生用品上的残留物作为标本，通过革兰氏染色确认阴道菌群正常。用LAB选择性培养基MRS培养从标本中分离出单个LAB菌落，并通过16s DNA鉴定物种。进一步对这些分离物进行了多项功能筛选试验，包括抗菌能力、H₂O₂产生试验和宫颈细胞粘附试验。结果表明L. gasseri GKA2对致病菌大肠杆菌(E. coli)和肺炎克雷伯菌(K. pneumonia)具有抑制作用。L. gasseri GKA2和L. crispatus GKJ6都具有产生H₂O₂的能力。在宫颈细胞粘附试验中，菌株GKA2和GKJ6的粘附能力分别为92.21%和92.46%。综上所述，乳酸杆菌GKA2和GKJ6具有阴道保健的潜力。未来可对这两种菌株进行体内试验验证，作为贴身保健品的应用进一步验证定量生产的可行性。

Abstract: This study was to isolate and screen the lactic acid bacteria (LAB) with potential female intimate care. The residues on the women’s disposal sanitary were collected as specimens and confirmed the normal vaginal bacteria flora by Gram staining. Single LAB colonies were isolated from the specimens by culturing with LAB selective medium MRS and identified the species by 16s DNA. Several functional screening tests for these isolations were further carried out, including antibacterial ability, H₂O₂ production test, and cervical cell adhesion test. Results showed that L. gasseri GKA2 could inhibit pathogenic bacteria E. coli and K. pneumonia. Both L. gasseri GKA2 and L. crispatus GKJ6 had abilities to produce H₂O₂. In the cervical cell adhesion test, strains GKA2 and GKJ6 had 92.21% and 92.46% adhesion ability, respectively. To summarize, Lactobacillus GKA2 and GKJ6 have the potential for vaginal health care. In the future, these two strains can be tested in vivo for verification, and the feasibility of quantitative production can be further tested as the application of intimate health care products.

1. 引言

阴道炎(vaginitis)是常见的妇科病症，约有50%的女性在一生中会感染阴道炎，其中以细菌性阴道炎(bacterial vaginosis, BV)尤为常见，占所有阴道炎的40%~50% [1]。其他阴道炎，例如念珠菌阴道炎(vulvovaginal candidiasis)占20%~25%、滴虫感染阴道炎(trichomonas vaginitis)占15%~20% [2]。细菌性阴道炎是由于女性阴道内菌相改变，使阴道内酸碱值提升，导致嗜碱性病菌滋长，BV主要由阴道加德纳菌(Gardnerella vaginalis)导致，此为一种革兰氏阳性杆菌，若G. vaginalis含量高出正常一千倍则会引起非特定性阴道炎(nonspecific vaginosis)，以怀孕期妇女最易感染，感染机率为10%~30% [3]。临床上指出若阴道分泌物量多、颜色呈牛乳状、且发出鱼腥味，阴部可能伴有搔痒症状则为感染病征，如合并发痒可能还并发白色念珠菌 [4]。在阴道中G. vaginalis、Mycoplasma hominis及乳酸菌等皆为正常菌丛 [5]。但若体内H₂O₂缺乏，使得G. vaginalis等厌氧菌过度繁殖，若多于乳酸菌100~1000倍，便会产生阴道发炎的症状 [6]。目前阴道炎的治疗大多为口服锭剂、阴道塞剂或药膏，临床上有许多患者看到症状改善就会自行停药，反而造成症状未根治而一再发作 [7]。

正常阴道内存在正常乳酸菌丛，它借着分解阴道内的肝糖及乳糖转变成乳酸，使pH值维持在3.8至4.2的弱酸性环境，再结合阴道本身的分泌物形成弱酸性保护环境 [8]。乳酸菌代谢同时也会产生与双氧水成分相同的H₂O₂及其他的抗菌物质，抑制致病菌的生长，形成天然防护屏障可以预防致病菌的感染，维持阴道菌相(vaginal flora)平衡，防止阴道发炎、老化、干燥等问题发生 [9] [10]。

根据妇产科医师指出，减少阴道感染方法有维保持通风、不过度清洁私密处、生活习惯维持正常并维持阴道菌相平衡等 [7]。然而以现代人工作压力大、作息容易日夜颠倒，若能补充具私密处保健的乳酸菌以维持女性健康是一不错的方法。目前市面上有相关的益生菌保健产品，像是Now Foods女性专用益生菌素食胶囊(Lactobacillus acidophilus La-14)、U-Relax优芮珂丝益生菌胶囊(L. rhamnosus GR-1、L. reuteri RC-14)、和Jarrow Formulas Probiotic Women’s Yeast Support (L. crispatus LbV88)等 [11] [12] [13]。然而，这些保健品的菌种皆来自欧美国家，菌种的差异亦会影响其功效，故开发出对于亚洲女性的益生菌私密处保健品有其必要性。因此，本实验自台湾女性卫生棉分离乳酸菌，并进行具阴道保健潜力之乳酸菌菌种特性的筛选试验。

2. 材料与方法

2.1. 菌株来源

由台湾女性使用过之卫生棉取得检体。将检体抹于玻片上各别进行革兰氏染色，染色方法如下：

1) 阴道检体涂抹于干净无菌玻片上，以酒精灯将检体抹片大致烤干，经结晶紫(crystal violet)染色1分钟后，纯水洗涤。

2) 碘液固定1分钟后，纯水洗涤。

3) 脱色剂脱30秒后，纯水洗涤。

4) 最后以番红(safranin)染30秒后，纯水洗涤。

5) 样品盖上盖玻片后滴上油镜油，以1000×视野下，确认其菌相组成。

镜检下，革兰氏阴性菌(G−)为粉色，革兰氏阳性菌(G+)为蓝紫色。根据Nugent等人(1991)研究，计算Nugent score (表1)，分数低于3者判定为正常阴道菌相，后续进行分菌作业 [14]。

Table 1. Nugent’s criteria

表1. Nugent’s criteria

2.2. 菌株分离

挑选之检体进行序列稀释后涂抹于MRSA平板上(BD Difco, NJ, US)，以37℃厌氧培养2天后，挑选单一菌落，活化至MRS broth内，37℃厌氧量化1天。培养完成后以接菌环沾取菌液，四区划线于MRSA平板，再以37℃厌氧培养2天，供后续鉴定使用。剩余菌液以20%甘油保存于−80℃，以利后续实验备用。

2.3. 菌株鉴定

自四区划线的平板挑选单一菌落95℃破菌5分钟后，加入16s RNA共享引子BSF (表2)作为鉴定区间以及其他反应溶剂进行PCR (表3)。取PCR产物进行电泳(electrophresis)确认亮带(band)后，委托基龙米克斯生物科技公司(Genomics, Taiwan)进行定序(sequencing)，并以NCBI网站的BLAST数据库做序列比对，确认该菌种。

Table 2. BSF primers

表2. 共享引子BSF

Table 3. PCR solvent and reaction condition

表3. PCR反应溶剂与条件

2.4. 抗菌实验

将实验用菌株活化至MRS broth 37℃厌氧培养1天，将活化好之菌液取2 µL滴至MRSA平板表面上，待菌液自然风干，放置37℃厌氧培养2天。将病原菌以TSA broth (BD Difco, NJ, US)或MRS broth活化，以序列稀释方式取得10×、100×、1000×菌液。将各稀释倍数菌液吸取1 mL至9 mL适用之培养agar内，混合均匀后倒至先前备好的乳酸菌平板上，凝固后放37℃培养1天，培养完观察抑菌圈大小(mm)。

2.5. 产H₂O₂实验

将活化好之菌液取2 µL滴至MRSA平板表面上，待菌液自然风干，准备100 mL MRS培养基含0.025 g的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine, TMB, Sigma-Aldrich, MA, US)、1 μL辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP, Sigma-Aldrich, MA, US)、以及1.5%琼脂，倒成平板备用。乳酸菌于MRS液态培养基活化一天后，接菌环沾取菌液，以四区划线法将菌液画于上述平板上，培养于37℃厌氧环境下48小时。观察培养基菌落呈蓝色之变色情形，越蓝表示产二氧化氢能力越强。

2.6. 产酸实验

取活化之乳酸菌菌液100 μL至20 mL MRS broth中，37℃厌氧环境下培养48小时后，记录其pH值。以0.1 N的NaOH滴定至pH值7.0，并纪录所使用的NaOH量。酸度公式计算如下：

$酸度=\left[\left(0.\text{1NaOH}用量\times 力价\times 0.00\text{9}\right)/\text{2}0\text{ml}\right]\times \text{1}00\%$

2.7. 子宫颈细胞贴附能力试验

将乳酸菌于MRS Broth活化1天后，以12,000 rpm离心5分钟收取乳酸菌菌体，并使用PBS清洗一次后回溶，将乳酸菌液进行序列稀释100倍后以平板计数法计数菌数作为起始菌数后备用。将子宫颈细胞(He La cell, BCRC, Taiwan)接种于24孔盘中以EGM-2液态培养基(Sigma-Aldrich, MA, US)培养于37℃下，并供给5%二氧化碳培养1天，使细胞贴附于孔洞平面。每一孔盘计数，含有一单层约1 × 10⁶的子宫颈细胞贴附于上。使用PBS润洗培养子宫颈细胞，加入前述制备好的100倍PBS稀释的乳杆菌菌液，静置于37℃、5% CO2下培养两小时，再使用PBS清洗，并加入0.1% Tween 20 (Sigma-Aldrich, MA, US)使子宫颈细胞分解。收集分解完之所剩液体进行乳杆菌的MRSA平板计数法，并计算乳杆菌于子宫颈细胞的贴附能力。计算公式如下：

$\begin{array}{l}乳杆菌对子宫颈细胞的贴附能力\left(\%\right)\\ =\left[\text{log}\left(起始接种乳杆菌菌数\right)/\text{log}\left(接种后之乳杆菌菌数\right)\right]\times \text{1}00\%\end{array}$

3. 结果

3.1. 菌株分离与鉴定结果

本试验共取得12份女性使用过之卫生棉。以革兰氏染色做为简易判别该检体源之有无细菌性感染。图1(a)和图1(b)检体皆可清楚观察到杆状蓝色菌体，推断为乳酸菌；且无观察到革兰氏阴性菌或球状菌体，故给予Nugent score小于3。图1(c)检体虽有部分革兰氏阳性菌，但多数为革兰氏阴性菌，故初步判断Nugent分数大于3，不采用此检体分菌。所有样品中，共有8个样品其Nugent分数小于3分，故进一步取这8组样品做乳酸菌菌株分离。采用的检体于MRS平板培养基培养后，共自平板培养基分离出19株菌落，经16s RNA鉴定后，有11株为乳酸菌，菌株分别给予编号，如表4。共分离出Lactobacillus gasseri、Limosilactobacillus fermentum、Weissella confusa、L. delbrueckii、L. jensenii、L. vaginalis以及Lacticaseibacillus rhamnosus各一株，和4株不同检体来源的L. crispatus。

3.2. 菌株抗菌能力表现

抗菌试验能评估乳酸菌对阴道常见病原菌抑制效果强弱。使用病原菌有C. candida BCRC 20519、E. coli BCRC 11634、S. aureus BCRC 12154、K. pneumonia。结果如表5所示，分离出的11株乳酸菌对C. candida均没有抑菌效果。除了GKJ6外，剩余分离之10株菌皆对E. coli有抑制的作用，其中又以GKA2、GKW3、GKB1、GKC2、GKJ3、GKJ4、和GKR9抑制效果强。在抑制S. aureus方面上，以GKR9、GKC2和GKF4效果最强。分离出的11株菌中，仅GKA2、GKF3、和GKW3具有抑制K. pneumonia的能力。

Table 4. Identification of the isolated lactic acid bacteria strain

表4. 检体分离之菌株鉴定结果

Table 5. Anti-pathogen effects of the isolated lactic acid bacteria

表5. 乳酸菌对病原菌抑菌效果

^*抑制效果强(+++)、中(++)、弱(+)、无(−)。

(a) (b) (c)

Figure 1. Specimens were Gram stained and examined under 1000× oil microscope. Gram-positive bacteria are blue, Gram-negative bacteria are pink, Gram-denatured bacteria are purple-blue, and exfoliated epi-dermal cells are pink. The Nugent score of (a) is 2; the Nugent score of (b) is 1; the Nugent score of (c) is 4

图1. 检体以革兰氏染色并于1000×油镜镜检结果。革兰氏阳性菌为蓝色，革兰氏阴性菌为粉色，革兰氏变性菌为紫蓝色，脱落的表皮细胞为粉色。(a) 之Nugent score为2；(b) 之Nugent score为1；(c) 之Nugent score为4

3.3. 产H₂O₂能力比较

图2(a)可观察到GKJ6菌落呈现明显深蓝色，判断产H₂O₂能力为强(+++)。图2(b)的GKV9有部分菌落并没有蓝色形成，判断产H₂O₂能力为中(++)。图2(c)的GKW3大部分菌落没有蓝色形成，少部分菌落有蓝色反应但颜色并不深，判断产H₂O₂能力为弱(+)。图2(d)的GKA2完全没有产生蓝色反应，判断为不具产H₂O₂能力(−)。分离之11株乳酸菌，其产H₂O₂能力整理如表6。菌株以GKJ6和GKJ3产H₂O₂能力最强，次之为GKB1、GKV9、以及GKJ5。

(a) GKJ6 (J6, +++) (b) GKV9 (C11B, ++) (c) GKW3 (V03A, +) (d) GKA2 (C11E, −)

Figure 2. H₂O₂ production capacity identification. (a) Strong ability to produce H₂O₂ (+++); (b) Medium (++) in H₂O₂ production capacity; (c) Weak ability to produce H₂O₂ (+); (d) Not capable of producing H₂O₂ (−)

图2. 产H₂O₂能力辨识。(a) 产H₂O₂能力强(+++)；(b) 产H₂O₂能力中(++)；(c) 产H₂O₂能力弱(+)；(d) 不具产H₂O₂能力(−)

Table 6. Ability of H2O2 production from isolated strains

表6. 检体分离之菌株产H₂O₂能力总表

3.4. 菌株产酸之酸度分析

乳酸菌具产乳酸能力，可抑制杂菌生长。由图3可观察到GKJ5产酸能力为1.61%，是11株乳酸菌中最强的。其次为GKA2、GKR9、GKB1分别产酸能力为1.39%、1.31%、以及1.28%。GKC2则为0.53%，产酸能力最低。

Figure 3. Ability of the lactic acid production from 11 isolated strains

图3. 筛选出11株乳酸菌酸度分析

3.5. 菌株于子宫细胞的贴附能力

分析乳酸菌于子宫颈细胞贴附能力可推估该乳酸菌是否能够长期定植于女性私密处。若贴附能力愈强，表示能够长期定植的机率愈大。由图4可看出11株乳酸菌对子宫颈细胞贴附效果均佳，皆可高达60%以上。其中以GKJ4对于子宫颈细胞贴附力达97.34%最高。GKJ6、GKA2亦分别有92.46%与92.21%的贴附能力。

Figure 4. Ability of cervical cell adhesion test for 11 strains probiotics

图4. 11株乳酸菌于子宫颈细胞贴附能力试验

4. 讨论

一般女性阴道菌相多为乳杆菌属的细菌，以L. crispatus、L. inners、L gasseri、以及L. jensenii为常见 [15]。根据Ravel等人研究，其将女性阴道菌群做基本分类后发现，西班牙裔和黑人女性之阴道菌相主要以L. inners为主，其他不特定菌相为其次；而白人和亚洲女性阴道菌相则以L. crispatus和L. inners为主 [16]。因本次分离方法所使用的培养基MRS较不适合L. inners生长，故无分离出L. inners [17]。除外，上述菌种皆可生长于MRS而被分离出来，本次分离以L. crispatus菌种次数最多，可初步推测台湾女性阴道内主要菌种与文献指出相近(表4)。

多数乳酸菌具有抑制病原菌的效果，其抑菌机制可能为乳酸菌本身产生的酸性物质、H₂O₂或抑菌物质达到抑菌效果等 [18]。以菌株GKF4和GKW3的抑制病原菌现象为例，其两者皆具有抑制阴道常见病原菌E. coli、S. aureus、以及K. pneumonia (表5)；然而进一步比较，发现菌株GKW3有产生H₂O₂的能力，而菌株GKF4并没有(表6)。此说明GKF4的抑菌效果并非来自H₂O₂的产生，而有其他机制作用，像是乳酸的产生等(图3)。

另一个阴道乳酸菌的特性为良好的子宫细胞贴附能力 [19]。乳酸菌贴附力高者，能竞争掉子宫表面面积，阻挡其他病原菌的贴附或定植生长，也能使乳酸菌本身在阴道内壁存留更久，让乳酸菌能成为优势菌 [20]。本试验分离的11株菌株中，可发现不同株但同菌种L. crispatus的贴附能力皆为80%以上，可推论此类菌种可能多以竞争空间的方式防止病原菌入侵，且成为阴道菌群中常见的种类之一(图4)。

本研究分离出11株乳酸菌，其中以菌株GKA2具有抗病原菌E. coli和K. pneumoniae的能力，且具有高吸附率及高产酸能力。而菌株GKJ6具有高吸附率、高产酸能力及高H₂O₂产生的能力。综观上述特性分析实验，此两株菌株具有相当阴道保健的潜力，后续可针对L. gasseri GKA2和L. crispatus GKJ6这两株菌株进行安全性评估、量化生产、以及动物的功效性确认，以利发展有阴道保健应用的生物制剂。

5. 结论

分离株L. gasseri GKA2可抑制病原菌S. aureus、E. coli及K. pneumonia。分离株L. crispatus GKJ6则具强的H₂O₂产生能力。在子宫细胞贴附力上，菌株GKA2与GKJ6分别具92.21%和92.46%的贴附能力。因此，本试验初步筛选出乳酸菌菌株GKA2和GKJ6，可作为后续开发私密处保健的益生菌。

NOTES

^*通讯作者。