摘要: 为探究不同溶磷解钾复合菌剂对于苜蓿和黑麦草生物学效应的影响，从青藏公路沿线富含磷钾的植物根际土壤中分离纯化溶磷菌和解钾菌，通过可溶性磷、钾的含量测定复筛选出效果最好的三种菌株，即：阿氏芽孢杆菌Bacillus aryabhattai (P09，解磷菌)；肠杆菌Enterobacter roggenkampii (K02，解钾菌)；芽孢杆菌Bacillus sp. (K04，解钾菌)。将菌种配制成不同比例的菌剂，分别为1:0:0，0:1:0，0:0:1，1:1:0，1:0:1，0:1:1，1:1:1，1:2:1，1:1:2，2:1:1。将复合菌剂施加到苜蓿和黑麦草的土壤中。通过测定植物的各项生理指标，最后确定最佳的复合菌剂的比例。施加菌肥后，所有复合菌剂对苜蓿和黑麦草均有促生作用，其中1:1:0处理比其他处理的总体促生效果更为明显，苜蓿和黑麦草植株的株高、叶片直径(宽)、组织含水量、叶绿素含量、可溶性糖含量和过氧化物酶活性较CK分别增加了15.33%、9.00%、3.35%、78.19%、40.11%、40.77%和35.55%、18.60%、2.47%、33.53%、50.00%、42.66%。实验表明1:1:0比例的菌剂对植物的促生效果最为明显。因此P09菌株和K02菌株对植物的生长有明显的促进作用，可以帮助植物吸收磷钾元素，适宜的在土壤中施加该比例菌剂，将有助于苜蓿、黑麦草和其他植物的生长，对改善青藏公路沿线生态系统有一定的帮助。
Abstract:
In order to participate in the different pictures of the phosphorus-dissolving and potassium-dissolving compound bacteria and the visual effects of black grass animals, phosphate-dissolving bacteria and gum-dissolving bacteria were analyzed from the rhizosphere line of phosphorus and potassium along the wheat-Qinghai-Tibet highway. The effects of supplementary supplements are the best types, namely: Bacillus argentii (P09, phosphate solubilizing bacteria); Enterobacter roggenkampii (K02, resolving canister bacteria); Bacillus spores (P09, solution Phosphorus bacteria) K04, canning bacteria). The strains were prepared into different proportions of bacterial agents, which were 1:0:0, 0:1:0, 0:0:1, 1:1:0, 1:0:1, 0:1:1, 1:1:1, 1:2:1, 1:1:2 and 2:1:1. The compound inoculum was applied to the soil of alfalfa and ryegrass. By measuring various physiological indicators of plants, the optimal ratio of compound microbial agents is finally determined. After the application of bacterial fertilizer, all the compound bacterial agents have a growth-promoting effect on alfalfa and ryegrass. The overall growth-promoting effect of the 1:1:0 treatment is more obvious than other treatments. The plant height and leaf diameter of alfalfa and ryegrass plants (Wide), tissue water content, chlorophyll content, soluble sugar content, and peroxidase activity increased by 15.33%, 9.00%, 3.35%, 78.19%, 40.11%, 40.77% and 35.55%, 18.60%, 2.47%, 33.53%, 50.00%, 42.66% compared with CK, respectively. Experiments show that the 1:1:0 ratio of bacterial agents has the most obvious growth-promoting effect on plants. Therefore, P09 strain and K02 strain have obvious promoting effect on the growth of plants, which can help plants absorb phosphorus and potassium. Appropriate application of this ratio of inoculants in the soil will help the growth of alfalfa, ryegrass and other plants. Improving the ecological system along the Qinghai-Tibet Highway will help.
1. 引言
苜蓿是苜蓿属(Medicago)植物的通称，俗称金花菜，是一种多年生开花植物。黑麦草(Lolium perenne L.)，多年生植物，是各地普遍引种栽培的优良牧草，生于草甸草场，路旁湿地常见。两种植物广泛分布于青藏公路两旁，但青藏公路的建设加剧了青藏高原路域土地沙化、水土流失等生态环境问题，造成了青藏公路沿线部分区域生态系统的平衡被打破，从而导致各种植物发育受阻 [1]。作为野生食草动物最广泛食物，苜蓿、黑麦草的数量逐年下降。普通的磷肥、钾肥可短期补充有效磷和钾，但会破坏土壤结构，不利于持续发展，而微生物菌剂可以有效利用土壤难溶的磷钾，具有绿色健康无污染的特点 [2]。许多研究表明其能够有效改善土壤中磷、钾等元素的利用率，提升植物的抗逆能力，促进植物生长 [3]。
2. 材料与方法
2.1. 材料
2.1.1. 材料来源
土壤样品：从青藏公路沿线取出土壤。
2.1.2. 培养基
解磷固体选择培养基(g/L)：葡萄糖10，(NH4)2SO4 0.5，MgSO4∙7H2O 0.3，NaCl 0.3，KCl 0.3，FeSO4∙7H2O 0.03，MnSO4∙7H2O 0.03，Ca3(PO4) 5，琼脂15，pH 7.0；
钾长石固体培养基(g/L)：蔗糖5，葡萄糖5，(NH4)2SO4 0.5，MgSO4∙7H2O 0.3，Na2HPO4 2，FeSO4∙7H2O 0.03，MnSO4∙7H2O 0.03，钾长石2，琼脂粉18，pH 7.0；
LB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，pH 7.0。
2.2. 试验设计与方法
2.2.1. 菌种分离与鉴定
初筛：选用无机磷固体培养基和钾长石固体培养基，从土壤样品中初步筛选菌株，通过溶磷圈和透明荚膜的相对大小初步筛选溶磷菌和解钾菌；复筛：采用钼锑抗比色法 [4] [5] 和光度比浊法 [6]，分别定量测定菌株的溶磷、解钾能力的大小；菌种鉴定：对复筛得到的菌株进行16S rDNA测序，测序结果与NCBI数据库序列同源性比对确定其种属，并将菌株甘油保藏。
2.2.2. 植物种植与复合菌剂配制
播种前，将种子催芽一天，以提高发芽率。准确数取6颗种子(苜蓿和黑麦草)均匀撒在每一格土壤表面，放入植物培养箱并定期浇水，调节植物培养箱温度至日温28℃，夜温20℃，湿度80%进行培养。
待植物发芽，加入菌液。菌液OD600统一调节至吸光度0.8，每格中加入不同配比菌液共5 mL。分别为空白实验、1:0:0、0:1:0、0:0:1、1:1:0、1:0:1、0:1:1、1:1:1、1:2:1、1:1:2、2:1:1，依次序命名，苜蓿为CK、M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8、M9、M10，黑麦草为CK、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10，每个比例平行三组，三组共90株 [7] [8] [9]。其中比例分别为P09、K02、K04菌液的体积，空白组加入等量的蒸馏水。
2.2.3. 植物生理指标测定
苜蓿生长十天，黑麦草生长七天后分别测量植物株高、植物叶片直径及宽度、植物组织含水量、植物叶片叶绿素含量、可溶性糖含量、过氧化物酶活力。植物干重测量需要在105℃下干燥4 h烘干至恒重，叶绿素a、b含量测定采用丙酮提取的分光光度法 [10] [11]，可溶性糖含量采用蒽酮比色法 [12] [13]，过氧化物酶活力采用愈创木酚分光光度法 [14]。
2.3. 数据分析
试验数据采用Excel.2010及GraphPad Prism进行统计作图，采用SPSS 19.0对数据进行统计分析，并按照Duncan’s多重比较法P < 0.05作为差异显著水平进行单因素方差分析。
3. 结果与分析
3.1. 菌株的分离与鉴定
3.1.1. 菌株的初筛
使用无机磷固体培养基分离溶磷菌，从土壤中筛选出五种能产生溶磷圈的菌株，分别命名为P07、P08、P09、P10、P11，由于溶磷圈较小，无法计算溶磷圈直径，可通过肉眼初步判断菌株的解磷能力。如图1所示：P07、P08样品菌落较小，P07样品菌落呈乳白色，P08样品菌落呈淡红色；P09、P10、P11样品菌落较大，有很小透明圈，样品皆为乳白色圆形菌落，光泽度透明度等十分相似。
Figure 1. Growth of P07, P08, p09, P10 and P11 plates from left to right
图1. 从左至右依次为P07、P08、P09、P10、P11平板生长情况
使用钾长石固体培养基分离解钾菌，从样品土壤中筛选出了六种能产生透明荚膜的菌株，分别命名为K01、K02、K03、K04、K05、K06。结果如图2所示：K02样品菌落较小，菌落呈乳白色；K01、K03、K04、K05样品菌落较大，透明荚膜不是很明显，样品皆为乳白色、近似圆形菌落，边缘不规则，表面光泽，有荚膜，特征十分相似，K06两个平板均无微生物生长。
Figure 2. Growth of K01, K02, k03, K04, K05 and K06 plates from left to right
图2. 从左至右依次为K01、K02、K03、K04、K05、K06平板生长情况
3.1.2. 菌株的复筛
1) 解磷菌的复筛 样品可溶性磷含量测定：测定培养六天后的菌液的可溶性磷含量大小。如图3、图4所示：P07、P08解磷能力较弱，P09、P10、P11解磷能力较强，其中P09解磷能力最强，予以保存并测序。
Figure 3. Trend of phosphorus content in samples
图3. 样品磷含量趋势图
Figure 4. Total phosphorus release of sample
图4. 样品总解磷量
2) 解钾菌的复筛 样品可溶性钾含量的测定：除K2外，其他样品钾含量均是达到最高值后又下降，如图5所示，可能是由于菌体繁殖，消耗了分解的K。以最高分解量可知，如图6所示。K2、K4的解钾能力较强，予以保存并测序。
Figure 5. Potassium content trend of sample
图5. 样品钾含量趋势图
3.1.3. 菌株的16s rDNA分子鉴定及系统发育分析
将菌株P09、K02、K04序列与GenBank数据库中16S rDNA基因序列进行比对并构建系统发育树。结果如图7~9，P09为阿氏芽孢杆菌Bacillus aryabhattai (或同属)；K02为肠杆菌Enterobacter roggenkampii (或同属)；K04为芽孢杆菌Bacillus sp. (in: Bacteria)。
3.2. 复合菌剂处理对植物生长指标的影响
3.2.1. 不同处理对苜蓿株高、叶直径、含水量的影响
不同处理对植物生长指标均有明显的促进作用，且各处理的指标具有显著性差异(p < 0.05)，如表1所示：其中以M2、M4处理促进效果最佳，株高、叶直径、含水量较CK分别显著增加了17.43%、14.61%、1.08%和15.33%、9.00%、3.35% [15] [16]。但M7、M8、M9、M10处理之间无显著性差异。
Figure 6. Total dissolved potassium of sample
图6. 样品总解钾量
Figure 7. Phylogenetic analysis of p09
图7. P09系统发育分析
Figure 8. Phylogenetic analysis of K02
图8. K02系统发育分析
Figure 9. Phylogenetic analysis of K04
图9. K04系统发育分析
Table 1. Effects of different treatments on plant height, leaf diameter and tissue water content
表1. 不同处理对植物株高叶直径组织含水量的影响
3.2.2. 不同处理对苜蓿叶片叶绿素总含量、可溶性糖含量、过氧化物酶活力的影响
不同的处理对植物生长指标均有明显的促进作用，且各处理的指标具有显著差异性(p < 0.05)，其中以M4处理促进效果最佳，叶绿素总含量、可溶性糖含量、过氧化物酶活力较CK分别显著增加了78.19%、40.11%、40.77%。其次为M1、M2处理组，其余处理组均有不同量的增加，如图10~12所示。
3.2.3. 不同处理对黑麦草株高、叶宽度、含水量的影响
不同的处理对植物生长指标均有明显的促进作用，且各处理的指标具有显著差异性(p < 0.05)，如表2所示：其中以H4处理促进效果最佳，株高、叶宽、含水量较CK分别显著增加了35.55%、18.60%、2.47%。
Figure 10. Effects of different treatments on total chlorophyll content of Alfalfa Leaves
图10. 不同处理对苜蓿叶片叶绿素总含量的影响
Figure 11. Effects of different treatments on soluble sugar content in Alfalfa Leaves
图11. 不同处理对苜蓿叶片可溶性糖含量的影响
Figure 12. Effects of different treatments on peroxidase activity of Alfalfa Leaves
图12. 不同处理对苜蓿叶片过氧化物酶活力的影响
Table 2. Effects of different treatments on plant height, leaf width and tissue water content
表2. 不同处理对植物株高叶宽组织含水量的影响
3.2.4. 不同处理对黑麦草叶片叶绿素总含量、可溶性糖含量、过氧化物酶活力的影响
各处理的指标均具有显著差异性(p < 0.05)，其中以H4处理促进效果最佳，叶绿素总含量、可溶性糖含量、过氧化物酶活力较CK分别显著增加了33.53%、50.00%、42.66%。其次为H2处理，叶绿素总含量、可溶性糖含量、过氧化物酶活力较CK分别增加了29.97%、51.97%、39.02%。H5、H6、H7、H8、H9、H10处理组均有不同的增加，如图13~15所示。
Figure 13. Effects of different treatments on total chlorophyll content of Ryegrass
图13. 不同处理对黑麦草叶绿素总含量的影响
Figure 14. Effects of different treatments on soluble sugar content of Ryegrass
图14. 不同处理对黑麦草可溶性糖含量的影响
Figure 15. Effects of different treatments on peroxidase activity of Ryegrass
图15. 不同处理对黑麦草过氧化物酶活力的影响
4. 讨论
磷、钾是在植物生长发育过程中所必须的营养元素，磷参与植物的光合作用、呼吸作用、能量储存和传递、细胞分裂等生命活动，磷还能促进早期根系的形成和生长，提高植物适应外界环境条件的能力；钾在植物生长发育过程中，参与60种以上酶系统的活化，包括光合作用、同化产物的运输、碳水化合物的代谢和蛋白质的合成等过程 [3]。
本次实验中，各处理组的植物生长指标相比对照组都有一定的增长，说明P09、K02、K04三个菌株可以有效溶磷解钾，并促进植物生长。M3、H3处理相对较差，各指标平均增幅只有10%~20%，这也与K04菌株解钾能力较弱有关。M4、H4处理最显著地促进了苜蓿和黑麦草的生长发育，在叶绿素总含量、过氧化物酶活力方面较CK有更显著的增长，苜蓿叶绿素总含量增加了78.19%，过氧化物酶含量增加了40.77%，黑麦草叶绿素总含量增加了33.53%，过氧化物酶含量增加了42.66%，其菌剂配比P09:K02为1:1，可见P09的溶磷能力很强，且磷对植物的光合作用、呼吸作用都用重要的影响 [17]。K02比K04有更强的解钾能力，K02也更适宜与P09共同生存，高效的分解磷钾，促进植物吸收磷元素和钾元素。M2处理在生物量的积累方面优势突出，其比例为纯K02，可见钾元素在植物的营养元素的代谢和合成方面有重要作用。其他处理组的促生效果各不相同，可能由于功能菌对植物的作用各有特点，也可能与不同植株组合在植物根系定殖能力的差异以及特定根系菌群互作有关 [18]。另外，本次实验中，处理组与对照组叶片直径和宽度方面并没有很大差异，仅有少量增加，这可能与试验周期较短或植物本身特性所决定。
5. 结论
阿氏芽孢杆菌(P09)有较强的解磷能力，肠杆菌(K02)有较强的解钾能力，P09与K02菌液施加比例为1:1时会更有效的促进苜蓿、黑麦草的生长。
基金项目
2020年大学生创新创业训练计划项目。
NOTES
*通讯作者。