连接蛋白43与乳腺癌发生发展关系的研究进展

Research Progress in the Relationship between Connexin 43 and the Occurrence and Development of Breast Cancer

摘要: 乳腺癌在女性恶性肿瘤发生中占据首位，连接蛋白43在乳腺癌中存在异常表达，在乳腺癌的发生、发展过程中起着作用。本文主要讨论连接蛋白43在乳腺癌中的研究进展，探讨其在正常乳腺组织、乳腺癌原发灶及远处转移灶中的表达情况，为乳腺癌的治疗提供新的思路。

Abstract: Breast cancer occupies the first place in the occurrence of female malignant tumors. Connexin 43 (Cx43) has abnormal expression in breast cancer, and plays a role in the occurrence and development of breast cancer. This article mainly discusses the research progress of Cx43 in breast cancer, and discusses its expression in normal breast tissue, primary breast cancer and distant metastasis, so as to provide new ideas for the treatment of breast cancer.

1. 引言

乳腺癌已成为女性发病率最高的恶性肿瘤，2020年全世界有220万新增病例 [1]。其发病率逐年增长，并且具有年轻化的趋势 [2]。全球约有11%的乳腺癌发生在中国，对女性的健康有着严重的影响 [3]。近几年有学者研究称细胞缝隙连接蛋白43 (connexin 43, Cx43)在人类多种肿瘤的产生、生长及预后中发挥不可缺少的作用 [4]。国内外都有相关研究报道Cx43表达和乳腺癌的临床特征存在着某种关联，但得到的结论却不一致 [5] [6] [7] [8]。本文将对Cx43的表达情况与乳腺癌关系的研究进展作一综述。

2. Cx43概述

连接蛋白是一个跨膜蛋白家族，在细胞间形成缝隙连接的细胞间通道，直接连接相邻细胞的细胞质，在细胞通讯中起着传播作用 [9] [10] [11]。每个缝隙连接由两个相邻细胞的细胞膜上六边形排列的半通道组成，细胞膜上的半通道由两个六聚体连接蛋白寡聚体组成 [12]。其中连接蛋白43 (Cx43)是表达最高和研究最广泛的连接蛋白之一，已被发现在多种肿瘤中存在异常表达，包括肝脏、前列腺和乳腺 [13] [14] [15] [16]。Cx43在乳腺癌的发生、发展、肿瘤细胞转移过程中起着一定作用，对细胞间的粘附、肿瘤细胞与细胞微环境的相互作用以及转移潜能都存在影响 [17]。

3. Cx43在正常乳腺组织的表达情况

Cx43是乳腺组织中的主要连接蛋白之一，于1992年首次在人类乳腺组织中被检测到 [18]，并且主要表达于乳腺导管的肌上皮细胞 [19] [20] [21]。Wilgenbus等人 [18] 首次发现Cx43在人正常乳腺和乳腺浸润性导管癌的结缔组织中表达。Monaghan等人 [22] 的一项后续研究，利用从乳房缩小术中获得的人类乳房，证实了Cx43在人类乳房中的表达。在Monaghan等人 [22] 的研究中，还通过逆转录酶定量聚合酶链反应(reverse transcriptase PCR,RT-PCR)对正常乳腺样本进行Cx43的评估，证实了Cx43 mRNA的存在。随后，Pozzi等人 [23] 的一项研究通过免疫组化和RT-PCR对人类乳腺样本中的Cx43进行了评估，检测到Cx43的表达局限于肌上皮细胞。Kanczuga Koda等人 [20] 和Jamieson等人 [21] 都证实了Cx43在正常、非恶性乳腺的肌上皮细胞中的表达。此外，学者们一致认为Cx43主要定位于肌上皮细胞外侧的质膜，推测其在肌上皮细胞之间形成缝隙连接 [21] [22] [24] [25]。Cx43除了在乳腺肌上皮细胞上表达外，还在乳腺成纤维细胞有所表达，Tomasetto等人 [26] 在体外培养的人乳腺成纤维细胞中发现了Cx43蛋白，染料转移实验显示成纤维细胞和上皮细胞之间存在异质细胞缝隙连接通讯(gap junction intercellular communication, GJIC)。并且正常乳腺组织的基质通常不表达Cx43 [21]。

一些研究表明Cx43与乳腺发育有关 [27] [28] [29] [30]，在乳腺及其发育和分化过程中均存在表达 [22] [25] [31]。研究表明，在细胞可塑性最强的乳腺发育阶段，包括青春期、妊娠早期和退化早期，Cx43的表达较高，在调节乳腺腺体增殖中起作用 [32]。Lambe及Talhouk等人 [33] [34] 发现Cx43的表达在乳腺发育过程中受到了调控。Northern分析和PCR显示，Cx43在妊娠中期下调，在哺乳期几乎消失，但在退化后重新表达。有趣的是，Talhouk等人 [34] 还发现在妊娠的最后几天和哺乳期开始时，Cx43蛋白明显地出现高度磷酸化转变，这一现象也在大鼠乳腺中观察到 [35]。总的来说，Cx43在整个乳腺发育过程中都有表达，在肌上皮细胞的生长和分化中发挥作用；它甚至可能是哺乳期肌上皮功能发挥作用的必需因素。

4. Cx43在乳腺癌中的表达情况

4.1. Cx43在原发灶中的表达情况

4.1.1. Cx43在原发灶中的表达部位及作用

Cx43在正常人乳腺肌上皮细胞中的表达相对丰富，因此研究Cx43在乳腺癌中的表达相对于正常组织是否增加或减少与肿瘤预后的关系尤为重要。Jamieson等人 [21] 评估了Cx43在乳腺癌组织与正常乳腺组织中的表达情况。研究观察到浸润性乳腺癌间质中含有Cx43阳性细胞，这与正常乳腺组织的间质不同，正常乳腺组织的基质通常不表达Cx43。这些发现与Wilgenbus等人的早期研究一致，Wilgenbus等人 [18] 也观察到浸润性导管癌样本中Cx43的间质染色。总之，这些研究表明，浸润性乳腺癌间质中Cx43蛋白表达增加。

在Jamieson等人 [21] 之前的研究发现，在12例恶性程度较低的肿瘤中，Cx43在其中4例肿瘤中的定位显示主要是细胞质染色，表明Cx43定位于远离缝隙连接的部位。在恶性程度较高肿瘤中也进行了类似的观察，并且其中15个样本中有10个显示Cx43主要为细胞质染色。Laird等人 [36] 的研究确定Cx43表达丢失，报告乳腺肿瘤中没有Cx43表达，因此没有Cx43阳性缝隙连接。在Kanczuga-Koda等人的早期研究 [20] 中，免疫组化分析显示Cx43主要在细胞质中表达，但在11例导管内癌中仅3例表达。其余8个样本的Cx43呈阴性，大多数浸润性癌样本(26/29)中主要表现为Cx43的弥漫性细胞质染色。Kanczuga-Koda等人后来的一项研究 [24] 在更大的样本子集中也证实了Cx43在细胞质中的表达。该研究在71例浸润性导管乳腺癌样本中观察到55例细胞质Cx43染色。在剩下的16个样本中，6个样本显示癌细胞质膜中的Cx43点状染色，可能代表缝隙连接部位，余10个样本Cx43呈阴性。其他研究中也报道了这种现象 [20] [21]。

Cx43表达的细胞膜定位与细胞间缝隙连接通讯有关，而细胞质定位与细胞内稳态(如控制细胞增殖和凋亡)相关。Maria Chasampalioti等人 [37] 最近一项研究分析了细胞膜和细胞质Cx43的表达。他们发现大多数肿瘤的细胞膜Cx43表达较低(87%)，提示大多数肿瘤的细胞膜表达缺失，并发现尽管Cx43在细胞质中被检测到，但在大多数肿瘤中(73%)是低水平的。在他们研究中，Cx43在细胞质和细胞膜中均有高表达的患者的生存结果好于那些仅在细胞浆中呈阳性的患者，Cx43不表达是预后最差的。这可能表明，随着肿瘤的发展，Cx43首先失调表达到细胞质，然后失去细胞膜上的表达，最后完全不表达。

Teleki等人最近的一项研究类似地暗示了这样一种观点，即在增殖水平较高的肿瘤中，Cx43变得更具细胞质性，这表明其具有更具侵袭性的表型 [25]。这些发现可能表明，随着肿瘤向侵袭性表型发展，Cx43表达上调，或者肿瘤内表达细胞质Cx43的主导细胞类型构成了侵袭性肿瘤的大部分。Cx43的细胞质定位表明，在浸润性乳腺癌中缝隙连接缺失。总之，这些研究证实了乳腺癌中Cx43主要是细胞质的观察结果，这可能与Cx43 GJIC的缺失与侵袭性有关。

有趣的是，Jamieson等人 [21] 在研究中检测显示大多数癌细胞中Cx43水平上调。作者认为，Cx43蛋白表达水平的显著增加与GJIC抑制肿瘤形成的假设背道而驰。然而，如果Cx43蛋白在缝隙连接部位上调，但没有具体定位或功能，那么这可能表明Cx43缝隙连接并不是依赖功能而存在的，或者癌细胞上调Cx43蛋白作为一种代偿机制。值得注意的是，该研究中12例低恶性程度肿瘤中有4例和15例高恶性程度肿瘤中有10例显示癌细胞为Cx43阳性，观察到的染色主要为弥漫性和胞质性。作者推测，正常人乳腺导管上皮细胞表达Cx43以外的连接蛋白，癌细胞对Cx43的上调可能改变增生或恶性细胞与正常非癌细胞之间的GJIC [21]。与之相反，Laird等人 [36] 的一项研究表明，与正常乳腺组织相比，乳腺肿瘤中的Cx43蛋白表达减少或丢失。作者没有观察到基质中Cx43染色增加。另外，一项Meta分析 [38] 也支持了Laird等人的观点，该研究汇总了9个原始研究，对Cx43在乳腺癌组织与正常乳腺组织阳性表达率的进行比较，发现乳腺癌Cx43阳性表达率为40.51% (256/632)，正常乳腺组织阳性表达率为92.50% (222/240)，乳腺癌组织中Cx43阳性表达率明显低于正常组织。

4.1.2. Cx43表达情况与病理类型的关系

Cx43在不同病理类型上的表达也不尽相同。Kanczuga Koda等人 [20] 后来的一项研究评估了一组样本，这些样本分别来自正常乳腺(n=25)、发育不良乳腺组织样本(n = 40)和乳腺癌样本(n = 29包括导管内癌和浸润性癌)。与早期的观察结果一致，大多数导管内癌与Cx43抗体几乎没有免疫反应，表明Cx43表达在恶变期间缺失或降低 [21] [36]。然而在多数浸润性乳腺癌中，观察到弥漫性胞浆染色，表明存在明显数量的Cx43蛋白。他们的发现与Jamieson等人的研究一致，Jamieson等人也观察到浸润性癌中Cx43染色增加 [21]。然而，应该注意的是，在Jamieson等人的研究中，Cx43染色的增加与肿瘤间质中Cx43的增加有关 [21]。这一区别是否显著，仍有待确定。在Laird等人 [36] 的研究中，对32例未接受术前新辅助化疗或放疗的乳腺癌患者的手术标本进行了评估，并将其与相应患者样本的邻近正常组织进行了比较。部分结果与Jamieson等人 [21] 的观察结果类似，非恶性乳腺组织样本显示出中度至高度的Cx43染色。但Laird等人 [36] 评估了包括导管原位癌、浸润性小叶癌和浸润性导管癌的32个恶性样本后发现，不同组织学类型之间均未观察到Cx43表达的差异，几乎所有样本的Cx43染色均为阴性。

4.2. Cx43在转移灶中的表达情况

4.2.1. 淋巴结转移

乳腺癌转移与许多种因素息息相关，Cx43 表达改变是否提示乳腺癌出现转移，现目前研究所得出的结论尚且存在着争议。部分研究者发现Cx43在已建立的乳腺癌转移病灶中被发现上调，提示该蛋白可能在晚期转移步骤中起作用，包括外渗和组织定植 [39] [40] [41] [42]。在Kanczuga-Koda等人 [39] 的研究中，首次证明了Cx43在乳腺癌的淋巴转移中的表达高于癌旁组织，Cx43在转移性乳腺癌细胞中表达增强。与原发灶相比，Cx43在淋巴结转移灶中表达增加。这些发现提示缝隙连接蛋白可能有助于乳腺癌向淋巴结的有效转移。有意思的是，他们还在发现在原发灶Cx43阴性的患者出现了Cx43阳性的淋巴结转移灶，这一结果与Kamibayashi等人 [43] 的结果一致，Kamibayashi等人用免疫组织化学方法分析了Cx43在小鼠皮肤癌变的不同阶段。他们发现，尽管所研究的连接蛋白在小鼠皮肤癌变和早期侵袭的早期阶段表达减少，但Cx43在转移到淋巴结的细胞的质膜上出现表达。作者认为，连接蛋白可能通过在肿瘤细胞和淋巴结血管内皮细胞之间形成缝隙连接而在癌细胞外渗到淋巴组织中发挥重要作用。与之相反，张光谋、张立英及高一菁等 [44] [45] [46] [47] 则认为Cx43表达的下降与乳腺癌细胞的转移有关。更有FU、涂永久等 [48] [49] 学者认为Cx43表达与乳腺癌有无淋巴结转移无差异。一项Meta分析 [38] 结果显示，Cx43在乳腺癌组织中有没有淋巴结转移情况下阳性表达率没有关系。

4.2.2. 远处脏器转移

Cx43也被发现在乳腺癌的远处转移灶中出现表达以及发挥了一定的作用。最新一项基础研究 [50] 证明了Cx43由脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cell, BMEC)和乳腺癌细胞(breast cancer cell, BCC)表达，并在相互作用时经历亚细胞再分配，这表明该蛋白可能在两个细胞群之间的相互作用中发挥作用。在BCC接触区域观察到Cx43表达的增加，特别是在较晚的时间点在已建立的4T1簇中，这表明BCC间通讯对于簇形成和维持的重要性。该团队在乳腺癌脑转移的体内模型中也观察到了这种细胞间通讯 [51]，其中Cx43显示位于BCC-BCC和BCC-BMEC接触点。这些观察结果表明Cx43在整个血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)的恶性细胞跨内皮迁移中起作用。Bellahcene等人 [52] 的研究中，发现表达模式类似于成骨细胞的分化的骨转移变异体B02细胞中，Cx43mRNA在B02细胞中的表达几乎高出五倍，当B02细胞被注射到小鼠体内并形成转移时，在骨骼中发现的细胞表达高水平的Cx43，但肝转移灶中未检测到的Cx43水平。其他使用小鼠模型的实验 [53] 证据表明，当与Her2过表达的小鼠杂交时，Cx43失活突变的小鼠表现出可触及的乳腺肿瘤的延迟发病，同时表现出增加的肺转移。

5. Cx43与乳腺癌基因型的关系

虽然许多研究表明Cx43是激素反应性的 [54] [55]，但目前关于Cx43与乳腺癌各基因型的关系尚不明确。最近Maria Chasampalioti等人 [37] 的一项研究，Cx43与ER、PR状态呈正相关，与Ki-67呈负相关。这些发现与Conkil等人 [56] 的研究结果一致，这可能表明Cx43的缺失导致细胞增殖增加，他们还发现低Cx43与ER、PR、HER2阴性和三阴性肿瘤相关。Teleki等人 [57] 之前的一项研究评估了新辅助化疗前后乳腺癌患者样本中Cx43的表达情况。结果表明，原发性乳腺癌化疗前后，Cx43表达与激素受体水平呈正相关，和Her2水平之间呈负相关。这些结果可能意味着Cx43在原发性乳腺癌中的潜在肿瘤抑制功能。后续Teleki等人 [25] 又进行了一项研究显示，Cx43蛋白水平与ER阳性呈正相关，与肿瘤分级呈负相关，在ER阳性的原发乳腺癌中，Cx43mRNA的表达与肿瘤抑制有关，而在ER阴性的病例中，Cx43的表达与肿瘤保护有关。Cx43对肿瘤生长的控制可能有助于ER阳性肿瘤的更好分化以及患者生存。他们认为在ER阴性的乳腺癌中，其他通路主导Cx43的表达，可能涉及Wnt-1和/或Ras-Raf-MAPK激活 [58]，这也可能是促进有丝分裂信号的一部分，导致分化较低和预后较差 [59]。然而Laird等人 [36] 评估了ER、PR和Her2与Cx43表达的关系，未观察明显的相关性。

6. Cx43与乳腺癌的预后

Cx43在乳腺癌中的作用存在争议。学者们对Cx43在乳腺癌发生、发展中的作用观点并不一致，一些人将其描述为肿瘤抑制因子，另一些人则认为其是肿瘤发生中的关键分子。

Teleki等人 [57] 之前的一项研究评估了新辅助化疗前后乳腺癌患者样本中Cx43的表达情况。结果表明，Cx43的表达不会因化疗而改变。他们还发现，化疗前和化疗后样本中均存在Cx43阳性的乳腺癌细胞。这一观察结果与KanczugaKoda等人 [20] 的研究一致，该研究报告了浸润性乳腺癌样本中Cx43的显著染色水平。几乎所有评估Cx43表达的研究都着眼于免疫组化的蛋白质表达检测上。因此，Teleki等人后来又进行了一项研究 [25]，利用mRNA平台评估连接蛋白基因的表达。作者对来自Affymetrix和Illumina平台的数据分别进行了mRNA分析，但两种分析得出了相似的结果。Affymetrix分析显示，高Cx43mRNA表达与ER阴性患者的无复发生存率(relapse-free survival, RFS)和总生存率(overall survival, OS)降低有关。Stoletov等人 [60] 的一项研究通过对Oncomine数据库的分析证实了这一观察结果。Stoletov等人的分析表明，较高的Cx43表达与患者死亡和复发增加相关。

然而，在Teleki等人 [25] 的研究中，当评估无远处转移生存率(distant metastasis-free Survival, DMFS)时，情况正好相反：在淋巴结阴性患者和ER阳性患者中，Cx43升高与较长的DMFS相关。与这些发现类似，基于Illumina的分析显示，在接受内分泌治疗的全体患者队列、ER阳性组、luminal a组和ER阳性队列中，Cx43升高与OS之间存在显著的正相关。Maria Chasampalioti等人 [37] 最近一项研究也认为Cx43是肿瘤抑制因子，他们分析了超过1000个原始组织样本以及患者的临床数据，认为低表达的Cx43与患者预后不良有关，Cx43可以作为乳腺癌生存率和无远处转移生存率的独立预测因子。在他们研究中，高表达Cx43的肿瘤患者的生存率明显高于低表达Cx43的患者，肿瘤内Cx43的高表达有着18个月的生存优势。Cx43表达缺失与预后不良的标志物相关，即大肿瘤大小、高分级、高增殖状态、高多形性、高有丝分裂、不良诺丁汉预后指数和三阴性肿瘤。但也有部分学者，如Conklin C等人 [56] 认为Cx43的表达情况与乳腺癌的预后关系不大。

7. 结语

综上所述，Cx43对乳腺癌的发生发展有一定作用。它的功能是多重的，一方面，Cx43长期以来一直被认为是一种肿瘤抑制因子，在癌细胞系的mRNA和蛋白质水平上表达不足，或者在肿瘤中发生异常定位和磷酸化。Cx43还与乳腺癌进展和转移相关过程的控制有关，如增殖、侵袭、迁移和凋亡。另一方面，许多证据表明Cx43在乳腺癌的后期参与了调节作用，介导肿瘤和内皮细胞之间的相互作用，以促进继发部位的粘附和外渗。Cx43在淋巴结转移中的表达水平也高于相应的原发肿瘤。Cx43作为肿瘤抑制或启动子的表达背景尚未阐明，因此排除了其在乳腺癌治疗中的靶向性。Cx43在乳腺癌缝隙连接处的定位和活性的功能相关性仍有待明确。

NOTES

^*通讯作者Email：[e-mail]