1. 引言
蝉花(Cordyceps chanhua)，顾名思义，其为寄生在蝉上的一种虫生真菌，是虫草科(Cordycipitaceae)、虫草属(Cordyceps) [1] 的一种中药材，在我国有上千年利用历史。其主要成分有腺苷、虫草素、虫草酸(甘露醇)、虫草多糖、麦角甾醇等，具有增强免疫力 [2]、改善睡眠 [3]、抗疲劳 [4] 等功能。人工培养的蝉花子实体在2021年获卫健委批准为新食品原料。
目前蝉花的人工培养主要为采用小麦、燕麦等谷物作为培养基进行固体培养，因此在采收完孢梗束后会有许多的菌质(固体培养残基)残留，其含有大量的未利用彻底的谷物营养成分及蝉花生长过程中产生的腺苷、麦角甾醇、甘露醇、多糖、HEA等生物活性物质和维生素、矿物质等 [5]。而随着生产工艺的改进，蝉花孢梗束的质量不断提升，菌质的质量和营养随之下降，因此，对蝉花菌质改良的研究，有利于提升菌质的营养利用水平，更好地发挥其作为饲料原料的价值。
蝉花菌质的改良选择了米曲霉和酵母这两种真菌对菌质进行发酵改良。米曲霉是一能产生蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶等多种酶的菌种。淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶能分别降解原料中的大分子蛋白、直链支链淀粉、粗纤维等，使之成为更易被人体吸收的小分子物质，起到提高原料营养价值、保健功效和消化率的作用，被广泛应用于食品、饲料、酿酒等发酵工业 [6]。酵母菌也是一种人类很早就利用的微生物，其营养价值高，含有多种蛋白质、氨基酸、维生素和生物活性物质等，且具有生长周期短、发酵能力强、容易进行大规模培养的优点，因此在食品、医药、酿酒等领域广泛应用 [7]。选定这两种菌后进行大量实验，筛选出最合适的蝉花菌质发酵方案。本文主要对改良前后菌质的营养成分进行对比分析，明确菌质改良结果，为改良菌质的开发利用提供依据。
2. 材料与方法
2.1. 材料
2.1.1. 供试材料
蝉花菌质：由培养蝉花的培养基质及蝉花的营养菌丝组成的一种营养物质，由浙江泛亚生物医药股份有限公司提供；酱油曲精(米曲霉)：购自上海佳民酿造食品有限公司酿造一厂，为蛋白酶和淀粉酶活性较高的中科3.951米曲霉的孢子；天然酵母：购自通许县瑞祥农家人副食商行。
2.1.2. 仪器与试剂
HPX-300BSH-3恒温恒湿培养箱(上海新苗医疗器械制造有限公司)；ZHJH-C1214B超净工作台(上海智城分析仪器制造有限公司)；ML304T分析天平(美国梅特勒–托利多公司)；SKD-100凯氏定氮仪(上海沛欧分析仪器有限公司)，L-8900型氨基酸自动分析仪(日本日立公司)安捷伦1260液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)等。
2.2. 方法
2.2.1. 酵母菌种分离纯化
土豆洗净去皮，称取200.0 g土豆切成小块，加水煮沸30 min，八层纱布过滤；再加20.0 g葡萄糖和20.0 g琼脂，加热溶解，补热水至1 L，分装入试管中，加塞，121℃灭菌30 min，冷却制成马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)斜面。取0.3 g天然酵母溶于50 mL无菌水中，接种环蘸取少许液体后于PDA斜面由下至上划线，28℃培养24 h，获得第一代天然酵母。随后用接种环蘸取第一代天然酵母单菌落于另一PDA斜面划线，28℃培养24 h，获得纯化的第二代天然酵母。取第二代天然酵母于批量的PDA斜面划线，28℃培养24 h，获得批量的第三代天然酵母，4℃冰箱保存。
2.2.2. 天然酵母菌液制备
取1支天然酵母PDA斜面试管，向其中加入5 mL马铃薯葡萄糖水(PDB)培养基，用接种环刮下斜面上的菌落，随后将斜面试管中的PDB培养基倒入装有995 mL PDB培养基的锥形瓶中，于25℃，180 rpm/min摇床中震荡培养24 h，得到天然酵母菌液。
2.2.3. 菌质改良
取蝉花菌质300.0 g，加入300 mL水和0.15 g米曲霉(酱油曲精)，充分混匀，得600.0 g初始发酵料，将其于30℃恒温培养48 h；培养结束后揉碎成粒径 < 2 cm的小颗粒，加入40 mL天然酵母菌液，充分混匀，于25℃恒温培养72 h，结束后再次揉碎，平铺于托盘中除湿24 h，60℃烘干6~8 h，得到干燥的可长期保存的改良菌质。
2.2.4. 营养成分检测
蛋白质检测参考GB 5009.5-2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》，
氨基酸检测参考GB 5009.124-2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》，
脂肪检测参考GB 5009.6-2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》，
脂肪酸检测参考GB 5009.168-2016《食品安全国家标准 食品中脂肪酸的测定》，
总糖检测参考GB/T 15672-2009《食用菌中总糖含量的测定》，
碳水化合物参考GB 28050-2011《食品安全国家标准 预包装食品营养标签通则》，
能量测定参考GB 29922-2013《食品安全国家标准 特殊医学用途配方食品通则》，
膳食纤维检测参考GB 5009.88-2014《食品安全国家标准 食品中膳食纤维的测定》，
钠、钾、钙、镁、磷、铁、锌、铜、铬、锰、镉、碘的测定参考GB 5009.91-2017《食品安全国家标准 食品中钾、钠的测定》、GB 5009.92-2016《食品安全国家标准 食品中钙的测定》、GB 5009.241-2017《食品安全国家标准 食品中镁的测定》、GB 5009.87-2016《食品安全国家标准 食品中磷的测定》、GB 5009.90-2016《食品安全国家标准 食品中铁的测定》、GB 5009.14-2017《食品安全国家标准 食品中锌的测定》、GB 5009.13-2017《食品安全国家标准 食品中铜的测定》、GB 5009.123-2014《食品安全国家标准 食品中铬的测定》、GB 5009.242-2017《食品安全国家标准 食品中锰的测定》、GB 5009.15-2014《食品安全国家标准 食品中镉的测定》、GB 5009.267-2020《食品安全国家标准 食品中碘的测定》，
钼的测定参考GB 5009.268-2016《食品安全国家标准 食品中多元素的测定》，
维生素E的测定参考GB 5009.82-2016《食品安全国家标准 食品中维生素A、D、E的测定》，
维生素C的测定参考GB 5413.18-2010《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维生素C的测定》，
胆固醇测定参考GB 5009.128-2016《食品安全国家标准 食品中胆固醇的测定》，
维生素B1、B2、B6的测定参考GB 5009.84-2016《食品安全国家标准 食品中维生素B1的测定》、GB 5009.85-2016《食品安全国家标准 食品中维生素B2的测定》、GB 5009.154-2016《食品安全国家标准 食品中维生素B6的测定》，
维生素K1的测定参考GB 5009.158-2016《食品安全国家标准 食品中维生素K1的测定》，
叶酸测定参考GB 5009.211-2014《食品安全国家标准 食品中叶酸的测定》。
2.2.5. 菌质蛋白质营养价值评价
其中化学评分(Chemical score, CS)按照联合国粮农组织(FAO)的方法计算 [8]；氨基酸评分(Amino acid score, AAS)，必需氨基酸指数(Essential amino acid index, EAAI)，生物价(Biological valence, BV)和营养指数(Nutritional index, NI)采用Bano Z等 [9] 的方法计算获得；氨基酸比值(Ratio of amino acid, RAA)、氨基酸比值系数(Ratio coefficient of amino acid, RCAA)和氨基酸比值系数分(Score of ratio coefficient of amino acid, SRCAA)采用彭智华等 [10] 和朱圣陶等 [11] 的方法进行计算。
具体公式如下：
氨基酸评分(AAS) = [样品蛋白质中某必需氨基酸含量(mg/g)]/[FAO/WHO评分标准模式中相应必需氨基酸含量(mg/g)] × 100；
化学评分(CS) = [样品蛋白质中某必需氨基酸含量(mg/g)] × [标准鸡蛋蛋白中必需氨基酸总含量 (mg/g)]/[样品蛋白质中必需氨基酸总含量(mg/g)]/[标准鸡蛋蛋白中相应必需氨基酸含量(mg/g)] × 100；
必需氨基酸指数(EAAI) = 样品中各必需氨基酸含量与标准鸡蛋蛋白中相应氨基酸含量比值的几何平均数 × 100；
生物价(BV) = 1.09 × EAAI-11.7；
营养指数(NI) = 必需氨基酸指数(EAAI) × 样品蛋白质含量(PP)/100；
氨基酸比值(RAA) = [样品中氨基酸含量]/[FAO/WHO模式氨基酸含量]；
氨基酸比值系数(RCAA) = 氨基酸比值/氨基酸比值之均数；
氨基酸比值系数分(SRCAA) = 100-RCAA变异系数 × 100。
3. 结果与分析
3.1. 营养成分变化
从表1的测定结果可以看出，采用米曲霉和酵母发酵后的菌质蛋白质含量达到了26.16 g/100g，比起改良前的14.60 g/100g，提高了79.18%。蛋白质是机体生长的重要营养物质，动物肌肉增长需要补充蛋白质，养殖动物适当提高饲料蛋白含量有助于其生长，并且水产动物对蛋白质的需求量更高 [12]。改良后菌质中各种矿物质如钙、镁、钾、铁、锌等也有不同程度的提升。钙、镁是动物骨骼发育的重要成分，且对动物产蛋、产奶十分重要 [13] [14]。铁是组成血红蛋白必不可少的一部分，能预防仔猪等幼崽出现腹泻 [15]，锌能增加食欲，提高采食量及消化率，增强免疫，加强代谢合成，从而促进生长 [16]。此外，表1中B族维生素的含量均有所提升。维生素B1、B2是能量代谢中不可缺少的成分，能提高机体对蛋白质的利用率，促进生长发育。并且维生素B1、B2还分别有助于维持神经系统正常生理功能、维持皮肤和粘膜健康 [17] [18]。而维生素B6参与蛋白质代谢和利用，能提高动物的生长性能 [19]。
Table 1. Changes of nutritional components after improvement of substrate
表1. 改良前后菌质营养成分的变化
注：“+”表示含量有所提高但无法计算提高率。
3.2. 氨基酸种类和含量
由表2的氨基酸测定结果来看，改良后菌质中除半胱氨酸，谷氨酸，脯氨酸含量略微下降以外，测定的其他氨基酸含量均有所上升，其中组氨酸含量提升最大，达到了10倍以上。总氨基酸从8.96%提升至15.49%。组氨酸是鸡、猪的必需氨基酸，对动物生长有所影响，能提高肌肉抗氧化能力，改善肉品质并延长保存时间。组氨酸是肌肽合成的前体物质，肌肽具有抗氧化、抗衰老、抗疲劳、维持pH稳定等特性，在治疗老年痴呆和帕金森等疾病方面也具有重要作用 [20]。
Table 2. Types and contents of amino acids before and after improvement of substrate (%)
表2. 菌质改良前后氨基酸的种类和含量(%)
3.3. 必需氨基酸组成
从表3可知，虽然改良后菌质的蛋白质含量提高较大，但是每克蛋白质中必需氨基酸的含量除赖氨酸外均有所下降，总必需氨基酸相对含量略有降低，差距不大。菌质改良前后其必需氨基酸的含量与鸡蛋模式和FAO/WHO模式相比均有较大的差距。
Table 3. Composition of essential amino acids before and after improvement of substrate
表3. 菌质改良前后必需氨基酸的组成
3.4. 蛋白质的AAS和CS
氨基酸评分AAS值越接近100，说明该氨基酸含量与FAO/WHO模式的氨基酸含量越接近。
化学评分CS越接近100，说明样品中该氨基酸的相对含量与鸡蛋中对应氨基酸的相对含量越接近。所有必需氨基酸中评分最低的氨基酸为第一限制氨基酸。其在必需氨基酸中缺乏最多，影响机体对蛋白质的利用，决定蛋白质的质量。
由表4可知，改良前菌质的AAS和CS分别为31.13和52.79，改良后菌质的AAS和CS分别为27.30和40.05。改良前菌质的第一限制氨基酸为赖氨酸，改良后菌质的第一限制氨基酸变为了含硫氨基酸(蛋氨酸和半胱氨酸)。通常，赖氨酸是谷类蛋白质的第一限制氨基酸。而含硫氨基酸则是大多数非谷类植物蛋白质的第一限制氨基酸 [23]，这一结果表明，米曲霉和酵母双重发酵将蝉花菌质氨基酸组成偏向从谷物蛋白转为非谷类蛋白。
Table 4. AAS and CS of protein before and after improvement of substrate
表4. 菌质改良前后蛋白质的AAS和CS
注：AAS氨基酸评分；CS化学评分。
3.5. 蛋白质的EAAI、BV和NI
EAAI越接近100，说明样品蛋白质的必需氨基酸组成和标准鸡蛋蛋白氨基酸组成越相似，营养价值越高。
生物价(BV)是反映食物中蛋白质被消化吸收后，被机体利用程度的指标，生物价的值越高，表明其被机体利用程度越高，即蛋白质的营养价值越高。
营养指数(NI)这一评价指标综合考虑了蛋白质含量及氨基酸组成，数值越高，说明样品营养价值越高。
表5结果显示，改良前菌质的EAAI和BV均高于改良后，而NI则低于改良后菌质，说明虽然改良前菌质的每单位蛋白质的质量较高，但是由于改良后菌质蛋白质含量的大幅提升，综合考虑，改良前菌质的营养价值低于改良后菌质。
Table 5. EAAI, BV and NI of protein before and after improvement of substrate
表5. 菌质改良前后蛋白质的EAAI、BV和NI
注：EAAI必需氨基酸指数；BV生物价；NI营养指数。
3.6. 蛋白质的RAA、RCAA、SRCAA
RAA表示样品中氨基酸含量为FAO/WHO模式氨基酸含量的倍数。
RCAA、SRCAA分别表示样品中单个或整体氨基酸组成与模式氨基酸组成的接近程度。RCAA > 1表示该氨基酸相对过剩，RCAA < 1表示该氨基酸相对不足。SRCAA越接近100，与模式氨基酸越一致，营养价值越高 [11]。
Table 6. RAA、RCAA and SRCAA of protein before and after improvement of substrate
表6. 菌质改良前后蛋白质的RAA、RCAA、SRCAA
注：RAA氨基酸比值；RCAA氨基酸比值系数；SRCAA氨基酸比值系数分。
现代营养学研究表明，不仅氨基酸不足会影响蛋白质的营养价值，而且氨基酸过剩也限制蛋白质的营养价值 [24]。化学分只考虑一种限制性氨基酸对蛋白质营养价值的影响，现代营养学则更多地强调蛋白质的氨基酸平衡。SRCAA用各种必需氨基酸偏离氨基酸模式的离散度来评价蛋白质质量，比化学分更能反映蛋白质质量 [11]。
由表6可知，改良前菌质的赖氨酸含量缺乏、改良后菌质含硫氨基酸含量缺乏，但改良后菌质的SCRAA高于改良前菌质，说明改良后菌质蛋白质的氨基酸组成的均衡性高于改良前。
4. 结论与讨论
原有的蝉花菌质经过米曲霉和酵母先后发酵48 h与72 h后，营养成分发生了明显改变，最主要是蛋白质含量和氨基酸含量得到明显提升，氨基酸含量由改良前的8.96%，提升为15.49%，提高了72.88%，蛋白质含量由原来14.60 g/100g，提高为26.16 g/100g，提升了79.18%。所测B族维生素含量均有不同程度提高，部分矿物质、微量元素含量也均有提高。
从蛋白质分析结果来看，改良后菌质的蛋白质和氨基酸含量均有所上升，但每克蛋白质的必需氨基酸含量下降。采用通用的营养评价方法进行分析，结果表明改良前菌质的氨基酸评分(AAS)、化学评分(CS)、必需氨基酸指数(EAAI)、生物学效价(BV)高于改良后，而改良后菌质的营养指数(NI)和氨基酸比值系数分(SRCAA)则较改良前有所提高。综上可得，改良后菌质的蛋白质质量有所下降，但氨基酸平衡性和营养价值均有所提高。
综合以上结果来看，改良后的菌质是一种高蛋白、低胆固醇、低钠，富含膳食纤维、维生素和矿物质的营养物质，添加入饲料后能降低鸡、鸭、猪、牛等畜禽饲养成本，增加效益，也可作为生物有机肥使用，改良土壤，增加肥力，提高作物产量，具有非常广泛的应用前景。通过米曲霉和酵母对蝉花菌质的改良，能使得蝉花培养后废料更好地进行资源再利用，这一方法能进一步推广应用于大部分食用菌培养废料的再利用上，在节约资源的同时增加效益，对环境保护有积极意义。
NOTES
*通讯作者。