新型冠状病毒诊断方法的研究进展

The Research Progress on Diagnostic Methods for COVID-19

摘要: COVID-19快速准确的诊断方法已经成为了解全球病例的确切数量并采取相应的医疗措施的先决条件。SARS-CoV-2 (以前称2019-nCoV)感染于2019年12月在武汉首次报道，截止2020年7月，已有1400万人感染，约582,000人死亡。目前可用的诊断方法为 ① 病毒基因检测，② 人类抗体检测，③ 病毒抗原检测，其中RT-PCR检测病毒基因已被认为是最可靠的方法。在本报告中，讨论了目前的SARS-CoV-2检测试剂盒，让人们了解测试方法背后的科学原理。

Abstract: Rapid and accurate diagnostics of COVID-19 have become a prerequisite for understanding the ex-act number of cases worldwide and taking appropriate medical measures. SARS-CoV-2 (formerly known as 2019-nCoV) infection was first reported in Wuhan in December 2019, and as of July 2020, 14 million people had been infected and about 582,000 people had died. At present, the available diagnostic methods are: 1. virus gene detection, 2. human antibody testing, 3. viral antigen detec-tion, of which RT-PCR detection of viral genes has been considered the most reliable method. In this report, the current SARS-CoV-2 assay kit is discussed to give people an idea of the science behind the test method.

1. 背景

急性严重呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2，以前的2019-nCoV)是一种有包膜的正链单链RNA病毒(+ssRNA)。SARS-CoV-2在人类中具有传染性，并通过密切的人际互动或感染者的呼吸物质(咳嗽、打喷嚏)传播。随着全球感染人群的增加，世界卫生组织总干事于2020年3月12日宣布COVID-19疫情为“大流行病” [1]。SARS-Cov-2在分类学上属于冠状病毒科和Sarbecovirus亚属，SARS-CoV-2是继229E、NL63、OC43、HKU1、MERS-CoV和之前的SARS-CoV之后第7种报告的感染人类的冠状病毒 [2] [3] [4]。据报道，SARS-CoV-2全基因组约30 kb，5'的三分之二含有编码orf1ab的orf1ab多蛋白，而3'的三分之一由编码结构蛋白的基因组成，目前称为表面糖蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣壳(N)蛋白 [5]。此外，基因组比较研究揭示了116个突变，其中ORF1ab基因中的8782C > T，ORF8基因中的28144T > C和N基因中的29095C > T被认为最常见的突变，这些突变可能会影响SARS-CoV-2感染的严重程度和范围。Walls等人证明了SARS-CoV-2 S和SARS-CoV S糖蛋白之间的显著序列相似性 [6]。该团队还完成了一项全面的低温电子显微镜(cryo-EM)研究，揭示了SARS-CoV-2 S糖蛋白亚基的结构。两种SARS病毒的S蛋白与人类血管紧张素转换酶2 (ACE2)的结合亲和力是病毒用于进入细胞的宿主表面受体。由SARS-CoV S衍生的鼠多克隆抗体进行的初步实验表明，可以有效地中和SARS-CoV-2细胞的进入 [7]。一种针对S蛋白的新型抗体47D11最近还开发了SARS-CoV-2，其中人源化47D11抗体有效中和了SARS-CoV和SARS-CoV-2 [8]。另一个团队通过模拟预测，SARS-CoV-2 S糖蛋白通过Leu455、Phe486、Gln493、Asn501和Tyr505氨基酸残基与ACE2受体蛋白结合，其中只有少数与SARS-CoVS蛋白相同 [9]。所有这些研究都提供了大量关于SARS-Cov-2基因组和结构的信息，我们相信这些信息为进一步的诊断、治疗和疫苗研究奠定了基础。目前，许多SARS-CoV-2检测试剂盒已获得FDA的紧急使用授权(EUA)，核酸扩增技术(Real-时间逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和等温核酸扩增)，免疫系统响应病毒感染产生的抗体(血清学/免疫球蛋白M (IgM)/免疫球蛋白G (IgG)测试)和通过侧流测定法进行的抗原测试，都必须由受过培训的人员在指定的实验室中在指定的实验和生物安全水平(BSL)条件下操作。作为一个例外，LabCorp开发的“通过COVID-19 RTPCR测试在家收集样本”于2020年4月下旬获得FDA颁发的EUA，只需被检者在家中自行收集 [10]。目前，该样本采集工具包每件售价119美元，由于样本采集材料有限，该公司根据CDC指南优先为医护人员和急救人员购买 [11]。该试剂盒仅用于样本采集，采集的样本必须送回授权实验室进行核酸检测，这仍然是COVID-19检测的金标准。

2. RT-PCR法检测病毒基因

RT-PCR是检测RNA一种PCR法。RT-PCR是一种足够可靠且快速的技术，可在数小时内以高通量方式得出结果。RT-PCR技术基于两个连续反应：① 通过逆转录酶将RNA转化为互补DNA (cDNA)；② 使用基因特异性引物和荧光标记的水解探针通过聚合酶链式反应扩增cDNA样品。第一步产生用于第二步的DNA模板，其中DNA的拷贝数在重复的热循环中增加。基因特异性引物指导第二个反应，仅扩增基因组上的选定区域，而探针在每次成功扩增基因区域时产生荧光信号，从而形成可量化的反应系统 [12]。RT-PCR方法的发现为检测基因转录物铺平了道路，该技术已广泛用于全球传染病检测 [13]。RT-PCR目前是SARS-Cov-2检测的金标准，因为它能够直接测量病毒基因组部分，而不是抗原或抗体等二级生物标志物。马来西亚医学研究所(IMR)在中国的科学家发布了该病毒的全基因组序列的基础上于2020年1月11日公布了SARS-CoV-2特异性RTPCR引物和探针 [14]。其他几个国家，如英国、德国、韩国、土耳其、俄罗斯、美国和中国，后来宣布他们的临床级RT-PCR试剂盒用于SARS-CoV-2检测。

截至2020年6月6日，在EUA发布的88个商用SARS-Cov-2检测试剂盒中，有72个基于RT-PCR原理。2020年3月31日，FDA得出结论，各实验室开发的其他一些基于分子检测的测试可以被授权在开发该测试的单个实验室中使用，并且根据“临床实验室改进修正案(CLIA)”得到批准。截至2020年5月上旬，FDA已为该类别下的另外23个试剂盒颁发了EUA，供单一/已确定的实验室使用。RT-PCR试剂盒已用于身体各个感染部位的样本，包括鼻咽、口咽或鼻拭子、上下呼吸道抽吸物、支气管肺泡灌洗液和痰液。由于病毒在感染的第一周后开始向呼吸系统的下部移动，因此从喉咙样本中提取的分泌物可能会导致误导性结果。因此，必须尽可能从呼吸系统的较深部分仔细收集样本。有报告称，十名受感染的儿童中有八名在直肠拭子样本中连续检测呈阳性 [15]。然而，他们的鼻咽拭子样本检测结果为阴性，表明直肠样本有可能用于评估治疗效果以及患者的隔离期。

用于SARS-CoV-2检测的RT-PCR试剂盒主要包括逆转录和扩增酶，用于扩增特定病毒基因组的两到三组引物和探针，阴性、阳性和内控试剂。对照样本以与临床患者样本相同的方式处理，所有对照样品必须提供每个试剂盒用户指南中指定的预期结果。表1列出了迄今为止用于SARS-CoV-2检测的RT-PCR试剂盒中的靶基因、相应引物和探针序列。世卫组织还提供了一份文件 [16]，用于基于RT-PCR的SARS-CoV-2检测，总结了全球知名机构的方法，包括中国CDC(中国)、巴斯德研究所(法国)、美国CDC (美国)、Charité (德国)、National传染病研究所(日本)、香港大学(香港)和国立卫生研究院(泰国)。

Table 1. List of target gene regions, primers, and probe sequences in different RT-PCR settings for SARS-CoV-2 detection

表1. 用于SARS-CoV-2检测的不同RT-PCR设置中的靶基因区域、引物和探针序列列表

尽管RT-PCR仍然是迄今为止检测SARS-CoV-2最可靠的方法，但操作过程的繁琐及严格的实验条件导致每天只能完成一定数量的标本。这种方法的灵敏度通常取决于每个样品中的RNA量，根据RT-PCR的结果，患者可分为SARS-CoV-2阳性(活动病例)或SARS-CoV-2阴性。然而，这种技术并没有为已经康复的患者提供信息，因为病毒载量在康复后会被清除出体外。同样，由于拭子上的病毒量不足，处于病毒感染最初几天的患者可能不会对该测试做出“阳性”反应。因此，可能需要来自身体不同部位的拭子样本进行确认测试。开发不依赖于专业人员、先进的设备齐全的实验室的更快检测试剂盒非常重要。针对病毒生物标志物(如刺突蛋白、包膜蛋白或核衣壳蛋白)的抗原检测可能有助于支持当前基于RT-PCR的系统并加快全球检测速度。另一方面，抗体或血清学测试对于查看有多少人已经感染了病毒并产生了保护性抗体同样重要，这些抗体以后可能会被用作数据库，调查潜在的血浆供体以进行疾病治疗。

3. 抗体检测方法

抗体是免疫系统响应抗原而产生的蛋白质。每种抗体的位点只能结合一种特定类型的抗原以将其从体内清除。这种特异性通过抗原决定簇(CDR)决定的。抗体也称为免疫球蛋白(Ig)。存在五类抗体：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，由C末端区域区分。IgM是感染期间产生的第一种抗体，而IgG是血清中最常见和最丰富的抗体。抗体在黏膜和血液中分泌，它们通过结合和灭活抗原来中和病原体。因此，抗体中和可防止病毒感染细胞 [17]。抗体测试可以测量血液/血清/血浆样本中IgG和IgM水平的存在和浓度，以确定身体是否正在与病原体作斗争，例如传染性病毒。可以在实验室中生产模拟病毒的“重组”抗原，使用这些人工病原体可以生产具有特定靶标结合亲和力的抗体 [18]。侧向流动免疫色谱技术(LFA)和酶联免疫吸附型测定(ELISA)是最常见的抗体检测方法。

在LFA中，试剂盒由一个盒子组成，其中包含一条聚合物膜，通常包含两条线：一条控制线和一条测试线。在抗体LFA测试中，感兴趣的分子是患者血液样本中存在的特异性抗体。样品通过端口沉积到样品垫上，并通过毛细作用移动通过条带。当它遇到第一行时，用金纳米粒子标记的抗体与样品中的目标分子结合。然后随着样品继续移动，金标记的抗体被线中的捕获抗体结合。过量的金标记抗体然后沿着条带进一步移动并在控制线上被捕获。即使在样品溶液中不存在目标分子的情况下，金标记的抗体也必须在控制线处被捕获。根据测试是针对IgG类抗体还是IgM类抗体，或两者，显示窗口应显示一条、两条或三条条纹。如果测试仅针对一类抗体并且为阴性，则应显示一条条纹，仅在对照线处。如果测试为阳性，则应在对照线和测试线处显示两条条纹。如果两者均为阳性，将显示三个条纹：一个在控制线，一个在IgG测试线，一个在IgM测试线。

在ELISA测试中，重组病毒抗原作为靶分子包被在塑料孔的表面。将样品(即患者的血清)添加到孔中。如果样品中存在针对靶抗原的抗体(IgG或IgM)，则发生结合。将多余的样品冲洗几次以确保去除所有未结合的底物。然后，加入含有标记的二级抗人抗体的第二种溶液并使其结合；如果样品中不存在目标抗体，则不会发生结合。通过洗涤再次去除多余的抗体，并通过酶依赖性(通常是辣根过氧化物酶)变色反应确认目标抗体的结合。光谱仪读取颜色变化，可以确定目标抗体的浓度。在化学发光免疫测定法(CLIA，也称为改良ELISA)中，二抗的结合由单独的化学发光底物决定 [19]。

LFA优于ELISA测试的好处是该检测无需培训即可在家中使用，例如在家中进行妊娠测试。ELISA是一种诊断技术，只能在获得授权的实验室中进行，并且需要熟练的人员和特定的仪器。这些限制增加了对即时快速检测的需求。因此，SARS-Cov-2研究的重点是提高LFA的敏感性和特异性。为了提高准确性、灵敏度和检测通量，正在开发新的方法，例如信号放大和多重检测。尤其是在资源匮乏的地区，由于缺乏早期诊断，导致病毒传播失控。通过减少试剂、周转时间和劳动力成本，多重LFA已成为同时测试多个生物标志物的必要条件 [20]。

但是这两种方法都有缺点，关于血清学测试的最大问题是交叉反应。通常是由于分子之间的相似性，当抗体与不同于靶抗原的抗原结合时会发生交叉反应，例如SARS-CoV-2的刺突(S)蛋白与SARS-CoV和MERSCoV的S蛋白 [21]。这种交叉反应的最大问题是导致假阳性，以前感染过SARS-CoV的患者可能检测出SARS-CoV-2阳性。此外，由于抗体是在感染过程中产生的，抗体测试的阴性结果可能无法确认患者未感染。大多数患者在感染SARS-CoV-2大约14天后会产生抗体。而最近的一项研究发现，有患者在5天后检测到IgG和IgM抗体 [22]，这种普遍的迟发反应可能导致假阴性，患者被感染但尚未产生可检测水平的抗体。因此，必须确定测试的敏感性和特异性，以了解假阳性和假阴性的可能性。敏感性是所有阳性结果中真阳性的百分比，以及所有阴性结果中真阴性的百分比。另一方面，由于抗体检测较晚，血清学研究可能对疫苗研究、流行病学研究和晚期并发症具有追溯意义 [23]。

4. 抗原检测方法

抗原是可以触发免疫系统并诱导抗体产生以杀死病原体的颗粒/片段/分子，从而保护身体。与PCR的方法不同，抗原检测无需热扩增步骤即可直接检测病毒成分(即S糖蛋白、M蛋白或释放的N蛋白)或病毒 [24]。因为抗原先于抗体并且是特异性的，所以它们可能比抗体测试更可靠。抗原测试可以在LFA条上进行快速检测或以ELISA格式进行，以获得更好的灵敏度和高通量用途(同时测量96个样品)。有人开发了一种荧光免疫色谱LFA检测方法，用于检测SARS-CoV-2的核衣壳(N)蛋白 [25]。该测定利用抗N小鼠抗体和山羊抗兔IgG抗体分别用于测试线和控制线。与传统的金纳米粒子不同，它使用标有羧酸盐改性的聚苯乙烯铕(III)螯合物微粒的抗N兔IgG作为信号粒子，鼻咽拭子和尿液用作样本。与核酸检测相比，该检测方法的灵敏度为68%，特异性为100%。然而，这些研究处于早期研究状态，即使它们具有较高的灵敏度和特异性，也可能需要数年时间才能用于市场。

尽管ELISA和LFA技术成熟，并且迫切需要抗原检测，但美国市场上只有一种EUA发布的用于检测SARS-COV-2的抗原检测，即“Sofia 2 SARS抗原检测试剂盒”。Sofia 2快速抗原检测试剂盒基于夹心式免疫荧光技术，与仪器一起检测SARS-CoV和SARS-CoV-2的N蛋白，这意味着该试剂盒无法区分这两种密切相关的病毒物种。此外，该试剂盒使用鼻腔和鼻咽拭子样本，仅供医疗专业人员操作。在47个阳性和96个阴性临床样本中，该试剂盒的临床敏感性为80%，而特异性为100% [26]。在多个抗原试剂盒失败后，WHO和FDA警告科学界和医学界不要使用快速商业测试来检测SARS-CoV-2。世卫组织的原话如下：“由于目前可用的数据有限，世卫组织目前不建议在患者护理中使用抗原检测快速诊断测试，尽管强烈鼓励对其性能和潜在诊断效用进行研究” [27]。

5. 其他方法

随着病毒继续传播，急需一种对SARS-CoV-2的迅速检测方法。基于快速抗体和抗原测试的方法在全球范围内的准确性和特异性仍然存在争议，因此如果开发出一种精确和快速的测试方法，这将极大地帮助全球对抗病毒。全球的研究人员一直在努力开发一种可以提供快速准确结果的测试，同时不会影响灵敏度和特异性。在本小节中，阐述了文献中提出的用于SARS-CoV-2检测的一些新的研究阶段方法。到目前为止，许多已发表的方法都依赖于场效应晶体管(FET)和表面等离子体共振(SPR)原理，这些原理已知可传递快速和灵敏的信号。SPR原理是基于给定贵金属表面上电子的集体振荡，通常用于监测蛋白质–蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA、抗原–抗体、酶–底物样品之间的分子相互作用。实时、高灵敏度 [26]。有人发表了另一项基于等离子体光热效应(PPT)和局部表面等离子体共振(LSPR)的SPR研究，金纳米粒子用与金纳米粒子互补的寡核苷酸装饰选定的病毒基因区域 [28]。双功能系统成功检测出RdRp基因、E基因、ORF1a基因区域，具有皮摩尔级灵敏度。SPR系统现在在实验室中广泛使用，尤其是那些具有自动处理系统可以在没有人为干扰的情况下分析多个样品，因此，SPR可以作为实验室抗原和抗体试剂盒的替代检测方法，以更快地检测临床样本。

6. 结论

COVID-19的大流行急需一种快速诊断方法，病毒基因组区域的检测依赖于RT-PCR，大规模免疫筛查肯定需要快速抗体(血清学)测试，但它们不能确认病毒的存在，抗原测试目前正在开发中，由于病毒正在不受控制地变异，因此需要时间才能开发出非常准确的测试。目前为止，仍然只有一小部分世界人口接受了检测。因此，全面封锁、使用口罩和保持社交距离已成为防止疾病传播和大流行最有效的做法。在我们开发出效果明显的疫苗且经过临床验证的治疗方法之前，全球与COVID-19的斗争可能是一场漫长的斗争。在那之前，医学专家和抗原/抗体制造商必须专注于自我检测试剂盒的开发，以便能够看到全球疾病的真实程度和进展并采取相应的行动。

参考文献