1. 引言
急性胰腺炎(Acute Pancreatitis, AP)是消化内科常见急腹症，是由多种原因引起的胰酶异常激活而出现以严重炎症和腺泡细胞死亡，以胰腺组织、胰腺周围器官、远端器官和系统的损伤为主 [1]。随着饮酒、吸烟、肥胖的增加，其发病率也逐年上升，有报道称急全球发病率为每年34/10万人 [2]。病死率总体较前下降，但人群仍有较高死亡率 [3] [4]，一项队列研究 [2] 表明AP的死亡率1.16/10万，死亡风险增加的主要因素为持续的器官衰竭和胰腺的感染性坏死。其并发症包括胰腺炎后糖尿病、外分泌胰腺功能障碍、骨质疏松症等 [5] [6] [7]。
目前胰腺炎的数据主要是由动物实验和临床试验、文献综述、队列研究构成。关于其病因病机主要涉及钙离子信号通路异常、早期NF-κB的激活、溶酶体–自噬系统的紊乱等因素引起胰蛋白酶原异常激活 [8] 为主，炎症反应机制、自噬 [9]、内质网等逐渐被人们所重视。其中重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)易导致胰腺坏死、局部及全身并发症，引起较高死亡率，病理研究提示血管内皮细胞损伤、微循环障碍是SAP进一步引起胰腺组织和其他并发症的病理因素，但具体的病理机制仍未完全明确。因此探究病理机制和诊疗在减少发病率、死亡率方面至关重要。
血必净注射液是由血府逐瘀汤化裁而成，具有活血化瘀、清热解毒的作用，由川芎、丹参、红花、当归、赤芍组成。临床研究结果表明，血必净可显著降低SAP患者ROS、MDA、IL-6和TNF-α的表达水平，提高SOD和T-AOC的水平，减轻氧化应激反应，抑制炎症因子的释放，调节SAP患者抗炎–促炎系统平衡 [10] [11] [12]，达到改善症状。基础研究表明可减轻急性胰腺炎大鼠炎症反应 [13]、延缓肠黏膜屏障功能障碍 [14]。但针对血必净注射液的详细的分子机制和潜在的作用机制，目前仍未有进一步的报道。
网络药理学基于中药成分数据库、靶点分析、疾病，将中药、中成药、中药注射液等有效中药成分通过网络数据库的分析和验证，从而得到中药多成分、多靶点、多途径的研究思路，为中医药药理研究、分子机制研究提供新的思路 [15]。
中药复方注射液是中医中药临床应用的热点，但关于复方注射液机制研究局限于临床观察研究。血必净注射液广泛应用于脓毒血症、菌血症，联合应用于重症急性胰腺炎，目前在重症急性胰腺的相关靶点、机制研究较少，本研究选定血必净注射液，利用目前网络药理学及分子对接技术，一方面阐述其多靶点治疗重症急性胰腺，另一方面结合所涉及的信号通路，预测其中一条信号通路情况，为血必净注射液应用于重症急性胰腺炎提供理论基础，为后期实验研究提供可供参考的信号通路。
2. 资料与方法
2.1. 血必净注射液有效成分的筛选
血必净注射液共有5味中药：川芎、丹参、红花、当归、赤芍。利用中药系统药理学平台数据库(http://tcmspw.com/)检索并根据药动学参数口服生物利用度(oral bioavailability, OB) ≥ 30%、类药性(drug-likeness, DL) ≥ 0.18进行筛选其有效成分。
2.2. 血必净注射液有效成分相关靶点的收集
根据TCMSP数据库的Related Targets筛选5味中药有效成分的潜在靶点，利用蛋白质数据库UniProt (http://www.uniport.org/uploadlists/)转换为统一基因名称。
2.3. 药物–成分–潜在靶点网络模型的构建及分析
为进一步说明药物有效成分潜在靶点，将2.1获取的中药及有效成分及2.2获取的相关靶点导入Cytoscape 3.7.0软件中进行构建“药物–有效成分–潜在靶点”网络，将其可视化。
2.4. 重症急性胰腺炎疾病相关靶点的获取
在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)上进行检索，“severe acute pancreatitis”作为关键词进行检索汇总，选取相关性分数>30的靶点，得到SAP的J疾病靶点。
2.5. 共同靶点获筛选
将2.2获取血必净注射液有效中药成分和2.3获取疾病靶点，借助Venny 2.1.0网站进行交集，获得血必净注射液治疗重症急性胰腺炎的潜在作用靶点。
2.6. 蛋白质相互作用(PPI)网络构建
为了显示靶点蛋白在网络中的作用，将2.5获取的共有靶点录入STRING (https://stringdb.org/)数据库，以物种homo sapiens, combined score > 0.4为标准进行筛选，得到潜在靶点的PPI网络。通过Excel的Vlookup函数进行映射，并将2.5所获得靶点经Cytoscape 3.7.0软件分析，根据相关度的不同调节连线的粗细，根据结合度值筛选关键靶点。
2.7. GO功能富集及KEGG通路富集分析
通过DAVID 6.8.0数据库(https://David.ncifcrf.gov/home.jsp)对血必净注射液治疗重症急性胰腺炎的潜在靶点进行GO富集及KEGG通路富集。通过微生信http://www.Bioinformatics.com.cn/)在线工具分别以条形图和气泡图的将其进行可视化。
2.8. 有效活性成分–重症急性胰腺炎靶点–通路网络构建
将血必净注射液有效活性成分、治疗重症急性胰腺炎潜在作用靶点、KEGG通路导入Cytoscape3.7.0构建活性成分–靶点–通路网络。其中，节点及节点大小代表活性成分、基因或通路以及其度值的不同，结合度值评价其相关性。推测血必净注射液治疗SAP的信号通路并构建可能的作用的信号通路。
2.9. 分子对接
RCSB数据库(http://www.rcsb.org/)中下载PPI网络中前三名靶点蛋白，蛋白丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1 (RAC-alpha serine/threonine-protein kinase, AKT1)、TP53、血管生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的晶体结构：AKT1 (PDB ID: 2uzs)、TP53 (PDB ID: 4ibv)、VEGF (PDB ID: 5hhd)。运用PyMOL软件对靶蛋白中的配体和非蛋白分子(如水分子)进行出理。使用AutoDockTools 1.5.6软件关键靶点与化合物的分子对接。应用PyMOL软件完成对对接结果可视化，分子对接结合自由能的大小评判受体与配体支架的亲和力。
3. 结果
3.1. 血必净注射液药物活性成分收集
筛选后整理得到血必净注射液123个成分(表1)，其中川芎7个、丹参65个、红花22个、当归2个、赤芍27个，其中丹参、红花、赤芍重复1个，当归、红花、赤芍重复2个，丹参、红花重复2个，红花、赤芍重复1个，川芎、赤芍重复1个。
Table 1. Ingredients of Xuebijing Injection
表1. 血必净注射液化学成分
3.2. 血必净注射液有效成分相关靶点收集
血必净注射液药物靶点：川芎42个，丹参932个、红花449、当归69个、赤芍149个，去除无对应相关靶点后共249个，并利用蛋白质数据库转换为统一基因名称。
3.3. 药物–成分–潜在靶点网络模型的构建
将血必净注射液药物、有效成分、潜在靶点输入Cytoscape 3.7.1软件中进行构建“药物–有效成分–潜在靶点”网络，将其可视化(图1)。其中紫色菱形代表靶点，荧光绿八边形为活性成分，绿色八边形代表药物。
Figure 1. “Drug-component-potential target” network of Xuebijing Injection in the treatment of severe acute pancreatitis
图1. 血必净注射液治疗重症急性胰腺炎的“药物–成分–潜在靶点网络”
3.4. 重症急性胰腺炎疾病相关靶点
在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)上进行检索，“severe acute pancreatitis”作为关键词进行检索共8778个，选取相关性分数>20的靶点，得到相关靶点408个。
3.5. 药物与疾病共同靶点
借助Venny 2.1网站将血必净注射液与SAP靶点取交集，得到共同靶点74个，并制作韦恩图(图2)。结果显示，血必净注射液治疗SAP是多靶点协作。
3.6. 蛋白质相互作用(PPI)网络构建
进一步说明靶点蛋白的相互作用，将74个共同靶点输入到STRING数据库，隐藏游离靶点后，得到PPI网络，共有74个节点，1498条边，平均节点度值40.5。导入Cytoscape 3.7.0软件，根据度值调节筛选靶点(图3)，并认为这些靶点对血必净注射液治疗SAP起到关键作用。按照degree排列，排名前10的靶点为AKT1、TP53、VEGFA、TNF、IL6、MMP9、JUN、STAT3、CASP3、IL1B可认为是治疗的核心靶点。
Figure 2. Venn diagram of active component targets of Xuebijing Injection and severe acute pancreatitis targets
图2. 血必净注射液活性成分靶点与重症急性胰腺炎靶点的韦恩图
3.7. 富集分析
将血必净注射液74个潜在靶点录入DAVID数据库中(P < 0.05)，共得到GO富集条647个，其中包括530个生物过程(biological processes, BP)、45个细胞组分(cell composition, CC)和72个分子功能(molecular function, MF)。根据P值选取前10的条目输入微生信在线作图工具绘制柱状图(图4)。靶点通过RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、凋亡过程的负调控、药物应答、细胞增殖的正调控、转录的正调控、基因表达的正调控蛋白质磷酸化的正调控等生物过程，作用于细胞核、细胞外部空间、胞浆、胞外区等细胞组分，参与蛋白质结合、酶结合、蛋白质异二聚体活性、细胞因子活性等。
Figure 4. GO enrichment analysis of common targets
图4. 共有靶点GO富集分析
结合P值，筛选KEGG通路富集97条信号通路前20条，绘制气泡图(图5)，提示血必净注射液可作用于相关通路HIF-1 signaling pathway (缺氧诱导因子-1信号通路)、PI3K-Akt signaling pathway、TNF signaling pathway (肿瘤坏死因子信号通路)、癌症中的蛋白多糖(Proteoglycans in cancer)、FoxO signaling pathway (FoxO信号通路) HTLV-I infection (HTLV-I感染)以及癌症、乙型肝炎、胰腺癌等多种疾病通路上。
3.8. 有效活性成分–靶点–通路网络构建
将81个活性成分、74个共同靶点、富集排名前10的KEGG通路导入Cytoscape 3.7.0软件构建血必净治疗重症急性胰腺炎的活性成分–靶点–通路网络图(图6)。其中蓝色菱形代表靶点，紫色三角为通路，橙红色八边形为活性成分。
Figure 5. KEGG pathway analysis of common targets
图5. 共有靶点KEGG通路分析
Figure 6. The active compound-target-pathway network of Xuebijing Injection in the treatment of severe acute pancreatitis
图6. 血必净注射液治疗重症急性胰腺炎的相关活性成分–靶点–通路网络图
3.9. 分子对接
分子对接技术选取度值较高的成分和靶点进行对接，有效成分选取槲皮素(quercetin)，木犀草素(luteolin)，β-谷甾醇(beta-sitosterol)，根据靶点度值选择靶蛋白AKT1、TP53、VEGFA (表2)。
Table 2. Binding energy of active components and target proteins
表2. 活性成分与靶点蛋白结合能
部分对接结果见图7，其中绿色为蛋白受体，粉色为小分子配体，黄色虚线为氢键。结果提示大部分化合物与蛋白对接的结合能小于−5 kcal·mol−1，关键成分与关键靶点结合较好。其中AKT1与quercetin、TP53与luteolin、VEGFA与beta-sitosterol亲和力较高，这些靶点可能在血必净注射液干预SAP中起着较为重要的作用。
Figure 7. Docking patterns of main compounds of Xuebijing Injection to key target molecules
图7. 血必净注射液主要化合物与关键靶点分子对接模式图
4. 讨论
4.1. 血必净注射液干预重症急性胰腺炎的药效成分分析
本研究基于网络药理学对血必净注射液治疗SAP进行分子层面的探讨，共筛选81个成分，主要为槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、黄芩素、山奈酚、β-胡萝卜素、丹参酮II A、豆甾醇、鞣花酸、隐丹参酮等。
槲皮素(quercetin)是通过调节某些因子从而调节抗氧化信号通路，发挥抗氧化作用；通过调节活性氧的产生发挥抗炎过程；通过调节抗氧化剂水平和自由基清除作用，抑制氧化应激，防止氧化损伤 [16]。槲皮素通过减轻胰腺炎大鼠的腺泡炎性浸润、胰腺腺泡坏死，减轻胰腺损伤，可通过调节中性粒细胞的细胞凋亡从而减轻SAP大鼠的肺损伤 [17] [18]。
木犀草素(luteolin)具有消炎、抗菌、抗病毒、抗癌作用，因此在感染性疾病、肿瘤疾病中应用广泛。在SAP中可能通过抑制NF-κB通路，激活p38MAPK通路，减少炎症因子的释放，降低炎症反应和氧化应激，保护胰腺 [19]。
β-谷甾醇(beta-sitosterol)是具有抗炎、抗氧化、抗菌作用的活性物质。通过抑制NLRP3的激活及CAS1的产生及MAPK信号通路的活化，减少炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)释放，发挥抗炎作用 [20]。
黄芩素(baicalein)通过抑制促炎因子的表达，减轻胰腺损伤 [21]。丹参酮IIA可能通过降低ROS释放、增加NRF2和血红素氧酶1的表达，或者阻断氧化应激，减少胰腺损伤 [22]，鞣花酸(Ellagic acid, EA)是具有抗氧化、抗炎及抗癌等作用的多酚二内酯 [23]，可能通过抑制TXNIP/NLRP3信号通路，起到抑制胰腺炎症的作用 [24]。
血必净注射液有效成分可能通过抗炎、减轻氧化应激、减少炎症因子的释放，减轻胰腺损伤，达到辅助治疗的作用。
4.2. 血必净注射液干预重症急性胰腺炎的关键靶点分析
根据网络药理学分析，发现TP53、AKT1、VEGFA、TNF、IL6、MMP9、JUN、STAT3、CASP3、IL1B等靶点是血必净注射液干预重症急性胰腺炎的关键靶点。TP53是常见的抑癌基因，相关研究表明药物通过降低TP53的表达，减少AR42J细胞炎症因子，从而降低炎症反应 [25]。蛋白激酶B1 (protein kinase B1, AKT1)主要参与细胞增殖、生长、凋亡，结合KEGG富集分析发现血必净注射液可能通过PI3K/AKT途径的激活发挥作用。VEGF是血管生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)，主要参与参与血管内皮功能调节，相关研究主要集中于制肿瘤诱导的血管生成，控制肿瘤生长和转移。相关研究表明VEGFA免疫组织化学表达的增加，在跟踪急性胰腺炎的演化和病理方面发挥重要作用 [26]。肿瘤坏死因子(TNF)主要参与细胞凋亡。肿瘤坏死因子-α (Tumor necrosis factor, TNF-α)、IL6、基质金属蛋白酶9 (Matrix metalloprotein-9, MMP-9)在重症急性胰腺炎诊断、疗效、预后中已得到临床广泛应用 [27]。
4.3. 血必净注射液干预重症急性胰腺炎作用机制分析
血必净注射液治疗SAP的作用靶点富集于血管、免疫验证及癌症等相关通路，既往研究表明HIF1-alpha通过胰腺内凝血促进的AP的进展。HIF-1信号通路可以改善微循环障碍 [28]。SAP病理提示在疾病过程中出现血管细胞损伤、血容量降低、微血栓形成、血管阻力增加等一系列微循环障碍的情况 [29]。临床研究证实血必净注射液可通过减少血栓素的水平改善微循环障碍，减轻患者症状。血必净注射液可通过调控PI3K-Akt信号通路(图8)、TNF信号通路等炎症相关通路，通过调控NOS3、IL6、BCL2、AKT1、TP53、TNF-α、CCL2等，进而调控炎症因子的释放等，临床研究表明血必净注射液可以通过减少TNF-α、IL-6、C反应蛋白(C reactive protein, CRP)等炎性因子水平，减轻炎症反应。
Figure 8. The effect of Xuebijing in PI3K-Akt signaling pathway
图8. 推测的血必净注射液在PI3K-Akt信号通路的作用
本研究揭示血必净注射液可以通过多成分、多靶点、多种信号通路治疗SAP，其治疗作用可能与调节炎症反应、调节免疫功能、干预细胞凋亡、影响微循环功能有关，该研究为了解其治疗机制、临床用药提供了依据。
基金项目
国家自然科学基金项目(编号：8216150526)；广西自然科学基金面上项目(2020GXNSFAA297062)；广西中医药管理局立项项目(GZZC2020235)。
NOTES
*通讯作者。