摘要: 目的：运用网络药理学及分子对接技术探究地骨皮–葛根药对治疗高血压的作用机制。方法：利用TCMSP数据库及Uniprot数据库筛选地骨皮–葛根的有效成分和作用靶点，通过GeneCards、OMIM、TTD及DrugBank疾病数据库搜索高血压相关靶点。运用Venny数据库构建地骨皮–葛根药对和高血压靶点韦恩图，获得交集靶点；将获得的交集靶点上传至STRING数据库进行蛋白质–蛋白质相互作用(PPI)网络预测。利用Metascape数据库进行GO和KEGG富集分析。应用Cytoscape3.9.0软件制作“药物–成分–靶点”、蛋白质–蛋白质相互作用(PPI)、“成分–靶点–通路”网络图。最后采用AutoDockTools软件对主要活性成分和核心靶点进行分子对接验证。结果：筛选出地骨皮–葛根有效化合物21个，对应作用靶点169个，药物与疾病共同作用靶点98个；蛋白互作网络中核心基因为STAT3、AKT1、CAV1、ESR1、TP53；KEGG分析显示主要通路有神经活性配体–受体相互作用、脂质与动脉粥样硬化、cGMP-PKG信号通路等。分子对接结果显示，地骨皮–葛根药对的主要活性成分与关键靶点具有较强的结合能力。结论：地骨皮–葛根药对治疗高血压具有多成分、多靶点、多通路的特点，为该药对的临床应用和高血压的治疗提供了基础。
Abstract:
Objective: To study the mechanism of lycii cortex-Puerariae lobatae radix herb pair in the treatment of hypertension based on network pharmacology and molecular docking technique. Methods: The effective components and targets of lycii cortex-Puerariae lobatae radix were screened by TCMSP database and Uniprot database, and the hypertension-related targets were searched by GeneCards, OMIM, TTD and DrugBank disease database. The Venn diagram of lycii cortex-Puerariae lobatae radix herb pair and hypertension target was constructed by Venny database, and the intersection target was obtained, and the intersection target was uploaded to STRING database for protein-protein interaction (PPI) network prediction. GO and KEGG enrichment analysis was carried out by using Metascape database. The network diagrams of “drug-component-target”, protein-protein interaction (PPI) and “component-target-pathway” were made by Cytoscape3.9.0 software. Finally, the AutoDockTools software was used to verify the molecular docking of the main active components and core targets. Results: A total of 21 effective compounds and 169 corresponding targets were selected from the lycii cortex-Puerariae lobatae radix herb pair, of which 98 were common targets of drugs and diseases. The key genes are STAT3, AKT1, CAV1, ESR1 and TP53 in PPI; KEGG showed that the main pathways were neuroactive ligand-receptor interaction, lipid and atherosclerosis, cGMP-PKG signal pathway and so on. The results of molecular docking showed that the main active components and key targets of lycii cortex-Puerariae lobatae radix had strong binding ability. Conclusion: Lycii cortex-Puerariae lobatae radix has the characteristics of multi-component, multi-target and multi-pathway in the treatment of hypertension, which pro-vides a basis for its clinical application and the treatment of hypertension.
1. 引言
高血压(Hypertension)是指以体循环动脉压升高为主要表现的慢性心血管疾病，分为原发性高血压和继发性高血压两大类，其中以原发性高血压最为常见，可累及心、脑、肾等靶器官，同时也是人们患有脑卒中、冠心病、动脉粥样硬化的首要危险因素。据2012年至2015年高血压抽样调查数据显示，我国高血压患者的知晓率约51.6%，控制率仅16.8%，且人群高血压患病率仍呈升高趋势 [1] 。按照高血压的临床特征，归属于中医学“头痛”“眩晕”范畴，将其分为肝阳上亢、痰饮内停、肾阴亏虚等证型 [2] 。中医以辨证论治、整体观念为原则，强调从整体上抓病机，因人制宜，以恢复病人自身阴阳平衡，其副作用较少，因此中医治疗高血压有很大优势。
地骨皮性寒，味甘，归肝、肾、肺经，具有凉血止血、清肺降火、除骨蒸的功效。现代研究表明，地骨皮的煎剂、水浸剂对麻醉后的犬、猫、兔均有降压作用 [3] 。实验研究表明地骨皮水提取液低、中、高剂量组均能降低大鼠收缩压和舒张压 [4] 。葛根性凉，味甘、辛，归肺、脾、胃经，具有退热解表、生津液、升阳止泻的功效。葛根素是葛根中的重要成分，现代研究证明葛根素可通过改善主动脉内皮舒张功能和内皮细胞增值迁移能力而降压 [5] 。本研究运用网络药理学及分子对接技术，探讨地骨皮–葛根配伍对高血压的治疗机制。
2. 材料与方法
2.1. 地骨皮、葛根化学成分筛选及作用靶点获取
利用TCMSP数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)检索地骨皮、葛根的化学成分，以口服利用度(OB) ≥ 30%，药物相似性(DL) ≥ 0.18作为条件筛选。另外，通过文献查阅获得葛根的一些化学成分信息，因其OB值或DL值不满足筛选条件而被系统删除，考虑其潜在有效性，故将其纳入。利用Uniprot数据库(http://www/uniprot.org/)将靶点转换为对应基因。
2.2. 构建“药物–成分–靶点”网络
通过Cytoscape3.9.0软件制作地骨皮–葛根药对的“药物–成分–靶点”网络图，药物有效成分及靶点以节点图标表示，线条连接表示相互间关联。节点大小反映活性成分与靶点间的相关性，节点越大，相关性越高。
2.3. 高血压相关基因获取
将“Hypertension”作为关键词，在GeneGards数据库(http://www.genecards.org/)、OMIM数据库(http://omim.org/)、TTD数据库(http://db.idrblab.net/ttd/)、DrugBank数据库(http://www.drugbank.ca/)中进行疾病靶点的检索并剔除重复基因。
2.4. 构建药物与疾病交集基因的蛋白相互作用(PPI)网络分析
将药物的预测靶点与疾病相关靶点输入到Venny2.1(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，获得的交集靶点作为地骨皮–葛根药对治疗高血压的作用靶点。随后将作用靶点上传到STRING数据库(http://string-db.org/)，限定物种为“Homo sapiens”，设置“最低交互分数 > 0.9”，并隐藏不存在任何互作的蛋白，得到可信度较强的蛋白互作网络。通过Cytoscape3.8.0软件调整网络整体布局，进行拓扑分析。
2.5. GO生物过程与KEGG通路富集分析
为深入了解作用靶点基因功能和地骨皮、葛根治疗高血压的主要通路，运用Metascape数据库(http://metascape.org/)进行GO和KEGG富集分析，同时选定物种为“H. sapiens”，设置P < 0.01，并利用微生信网站(http://www.bioinformatics.com.cn/)进行可视化分析，最后构建“成分–靶点–通路”网络图。
2.6. 分子对接
将PPI网络图中获得的核心靶点与主要活性成分进行分子对接。通过TCMSP获得主要活性成份信息，于PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)中下载主要活性成份的3D结构，通过Uniprot获得靶基因蛋白名称，从PDB数据库(http://www.rcsb.org)中检索关键靶点的3D结构，通过PyMOL2.5软件去除关键靶点中的水及配体，将处理后的主要活性成份及关键靶点3D结构利用AutoDock Tools软件进行加氢处理，分别运行AutoGrid、AutoDocking，得出结果后分析数据，记录最低结合能及其结构文件，将获得文件导入PyMOL进行分子对接可视化处理。
3. 结果
3.1. 地骨皮、葛根有效化合物及作用靶点获取结果
通过TCSMP数据库检索地骨皮、葛根，最初共获得地骨皮化学成分37种，葛根化学成分18种。现剔除掉未查到相关作用靶点的化学成分，再以OB ≥ 30%、DL ≥ 0.18为条件筛选，并补充上文献查阅的化学成分，共计得到地骨皮、葛根活性成分21种(地骨皮12种，葛根10种，重复1种，见表1)，得到有效化合物靶点393个，剔除重复值共得到靶点169个，再通过Uniprot数据库获得各靶点基因名。
3.2. 构建“药物–成分–靶点”网络结果
将所得的地骨皮–葛根药对有效成分和靶点整理成文件，再将文件导入Cytoscape3.8.0，得到192个节点、413条连线的网络(见图1)。红色六边形代表地骨皮有效成分；绿色六边形代表葛根有效成分；浅蓝色六边形代表地骨皮、葛根共有成分；深蓝色菱形代表靶点。在网络中，度值(Degree)代表与该节点相连的边的条数，节点大小与度值呈正相关，节点越大表示该成分起到越关键的作用。化合物GG08 (大豆苷元，daidzein)、GG05 (葛根素，puerarin)、A01 (β-谷甾醇，beta-sitosterol)、GG01 (芒柄花黄素，formononetin)、DGP10 (豆甾醇，Stigmasterol)、DGP01 (莨菪碱，OIN)等可能是地骨皮–葛根药对治疗高血压的关键有效成分。在作用靶点方面，PTGS2、PTGS1、ADRB2、NCOA2、CHRM1、CHRM3、ADRA1B、RXRA、AR、ESR1、PPARG与较多化合物相连。根据表1度值可见，21个化合物中有17个化合物都与≥3个作用靶点相连，说明地骨皮与葛根药对具有多成分、多靶点的复杂性。
3.3. 高血压相关基因获取结果
利用GeneCards数据库检索，共得到高血压相关靶点9408个，以“Relevance score”大于或等于中位数为条件进行连续三次筛选，三次中位数分别为0.51、1.04、2.48，最终以Relevance score ≥ 2.48的靶点作为疾病潜在靶点。同时收录OMIM、TTD、DrugBank数据库查到的靶点，剔除重复数据后获得1538个高血压相关靶点。
Table 1. Active components of lycii cortex-Puerariae lobatae radix herb pair
表1. 地骨皮–葛根药对活性成分
3.4. 构建药物与疾病交集基因的蛋白相互作用(PPI)网络分析结果
利用Venny2.1取得药物靶点和疾病靶点的交集，共获得98个交集靶点(见图2)。将得到的交集靶点上传STRING数据库(最低交互分数 ≥ 0.9)，得到可信度较强的PPI网络图。利用Cytoscape3.9.0软件调整网络整体布局，得到67个节点、163条连线的蛋白互作网络(见图3)。按度值排序，前10位分别为STAT3、AKT1、CAV1、ESR1、TP53、MAPK14、STAT1、TNF、FOS、IL-6，这些靶蛋白对应成分为金合欢素、芒柄花黄素、3'-甲氧基大豆苷元、葛根素、7,8,4'-三羟基异黄酮、大豆苷、大豆苷元、芒柄花苷。
Figure 1. Drug-component-target network diagram
图1. 药物–成分–靶点网络图
Figure 2. Venn diagram of drug targets and disease targets
图2. 药物靶点与疾病靶点韦恩图
3.5. GO生物过程与KEGG通路富集分析结果
在Metascape数据库进行GO分析后，利用在线平台对结果进行可视化呈现(图4)。其中，参与的生物过程主要包括血液循环、细胞对有机氮化合物的反应、对激素的反应、对低氧水平的反应、对异物刺激的正向调节、对营养水平的正调节和蛋白质磷酸化的正调节等；分子功能包括G蛋白偶联受体活性、神经递质受体活性、蛋白质二聚化、氧化还原酶活性、蛋白质异二聚活性和核受体活性等；细胞组分主要包括膜筏、突触前膜整体、受体复合体、囊腔和胞内囊泡等方面。
Figure 4. GO enrichment analysis of core targets
图4. 核心靶点GO富集分析
KEGG通路分析结果显示(见图5)，地骨皮–葛根药对治疗高血压靶点涉及靠前的通路主要有癌症中的通路、神经活性配体–受体相互作用、脂质与动脉粥样硬化、乙型肝炎、cGMP-PKG信号通路、前列腺癌和内分泌耐药等。将筛选出的20条与高血压相关的通路构建“成分–靶点–通路”多维网络(见图6)。其节点大小与它们在网络中的度值有关。红色八边形代表成分；绿色菱形代表靶点；蓝色箭头代表通路。共涉及17个活性成分，包括大豆苷元、葛根素、β-谷甾醇、豆甾醇、芒柄花黄素、金合欢素等。
Figure 5. KEGG enrichment analysis of core targets
图5. 核心靶点KEGG富集分析
3.6. 分子对接结果
分子对接结果显示，4个主要活性成分(大豆苷元、葛根素、β-谷甾醇–金合欢素)与5个关键靶点(STAT3、AKT1、CAV1、ESR1、TP53)均具有良好的结合能力，结合能力均 ≤ −5.0 KJ∙mol−1。结合能越低，表示分子对接效果越好(见表2，见图7)。
Figure 6. Component-target-pathway network diagram
图6. 成分–靶点–通路网络图
Table 2. Binding energy of main active ingredients and key targets (unit: KJ∙mol−1)
表2. 主要活性成分与关键靶点的结合能(单位：KJ∙mol−1)
Figure 7. Molecular docking diagram of main active ingredients and key targets
图7. 主要活性成分与关键靶点分子对接图
4. 讨论
中药治疗原发性高血压具有一定特色，在一些方面能起到补充治疗的作用。本研究以地骨皮–葛根药对入手探究其治疗高血压的潜在机制，整理得到了抗高血压作用的21个活性成分，98个作用靶点。通过对地骨皮–葛根药对分析，其主要降压成分为大豆苷元、葛根素、β-谷甾醇、豆甾醇、芒柄花黄素、金合欢素等。葛根素、芒柄花黄素和大豆苷元同属于异黄酮类物质，现有研究表明异黄酮具有保护血管内皮功能的作用 [6] 。葛根素和芒柄花黄素均具有血管松弛活性 [7] [8] 。相关实验在研究葛根素降压作用中，对自发性高血压大鼠给与葛根素治疗9周后，大鼠收缩压和舒张压均下降，进一步研究发现大剂量葛根素可使大鼠体内NO和cGMP水平升高，增加eNOS蛋白的磷化水平，降低AT1和Cav1的水平，推测其降压机制中的关键为eNOS [9] ；β-谷甾醇和豆甾醇同属于植物甾醇类物质，其中β-谷甾醇是地骨皮与葛根的共同成分，具有抗氧化、抗炎作用 [10] [11] 。豆甾醇能够抗低密度脂蛋白氧化和抗血小板聚集 [12] ；内皮细胞线粒体功能障碍是心血管疾病的危险因素之一，金合欢素通过激活AKT/eNOS途径，并通过靶向mPTP和DRP1/OPA1依赖的动力学来调节线粒体功能，从而抑制高血压患者的内皮功能障碍 [13] 。金合欢素还具有减轻炎症因子释放，从而保护心血管活性的功能 [14] 。综上地骨皮–葛根药对通过抗炎、抗氧化、保护血管内皮及血管松弛活性等方面发挥降压作用。
从PPI网络图得到核心靶点STAT3、AKT1、CAV1、ESR1、TP53。现代研究发现，肾氨酸酶可通过调节交感神经张力控制血压，而STAT3是调节肾氨酸酶基因表达的关键调控因子 [15] ；AKT1蛋白在高血压模型大鼠电容动脉的血管平滑肌细胞中高度表达，并且血管紧张素II会在AKT1基因的诱导下促进血管平滑肌细胞肥大，这表明AKT1蛋白与高血压发生发展密切关联 [16] ；醛固酮引起水钠潴留与高血压发病机制相关，研究发现CAV1基因会影响患者体内醛固酮含量 [17] ；雌激素可防止动脉粥样硬化，ESR1序列变异会干扰雌激素对血管内皮保护作用，这表明ESR1与冠状动脉疾病的严重程度相关 [18] ；TP53是mir-31a-5P的靶基因，mir-31a-5P可抑制动脉平滑肌细胞的凋亡而参与高血压的发病机制 [19] 。
GO富集分析结果显示，地骨皮–葛根的核心靶点通过影响血液循环、炎症反应、血管内皮功能及氧化应激等生物过程对高血压病进行调控。在KEGG分析中，筛选出20条信号通路与高血压相关，包括神经活性配体–受体相互作用、脂质与动脉粥样硬化、cGMP-PKG信号通路等。神经活性配体–受体相互作用通路通过受体与配体在质膜上结合，从而参与细胞外向细胞内的信号传递，包括钙信号通路。钙通道阻滞剂可作用于动脉血管平滑肌细胞，阻滞细胞外钙离子内流，使平滑肌细胞松弛而降压 [20] 。通过cGMP-PKG信号通路促使心房肌细胞生成多肽–心钠素(ANPs)，该物质可促使肾脏排水、排钠，同时使血管平滑肌细胞松弛。一项关于ANPs参与高血压合并糖尿病的充血性心力衰竭的研究中，研究者认为肾基底膜ANP受体与心力衰竭的进展有关 [21] 。
综上可见，地骨皮–葛根药对的不同有效成分可调节原发性高血压的多个不同靶点，同一靶点也可作用于不同的通路过程发挥各自效应。中药治疗高血压的作用机制复杂，网络药理学可在基因、分子、通路等理论方面提供依据，但后续仍需动物或细胞实验加以验证，为该药对在临床应用中提供更多参考价值。