1. 引言
中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)是我国重要的淡水经济养殖品种，广泛分布于湖泊、水库，味道鲜美，营养价值高，深受广大消费者喜爱。近年来，随着市场需求量的不断扩大，其增养殖模式在不断发展，养殖规模也在逐步扩大。2020年《中国渔业统计年鉴》显示，中华绒螯蟹在国内养殖产量达到77.5万t，产值超过400亿元 [1] 。随着产业扩大、产量提高，消费者也更加关注其质量和安全问题。通过饲喂免疫增强剂可提高甲壳动物非特异性免疫能力，从而提高其抗病能力 [2] [3] [4] [5] ，改善生长性能和健康状况。因此，合理使用免疫增强剂对开发水产养殖业具有重要意义。
研究表明，肽聚糖为细菌等原核生物细胞壁构架中基础的组成因素，是糖肽通过一系列糖苷键、肽键交联而成的一类紧密坚固的大分子物质，每个肽聚糖单体都是由两个通过β-1,4糖苷键连接的双糖单元与4个氨基酸串联的四肽尾组成，可提高甲壳动物的机体自身免疫能力 [6] [7] ，有抗菌或抗病毒作用 [8] ，是一种新型、安全的水产动物免疫增强剂。目前，已被应用于多种水产养殖动物。嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)细胞壁中含有肽聚糖，灭活后常被用于激活动物机体的免疫系统。刘永贵等 [9] 发现用含嗜水气单胞菌海藻酸钠微胶囊冻干疫苗的饲料饲养中华绒螯蟹可显著提高其SOD、PO和LZM等酶的活性，并且其对嗜水气单胞菌的抵抗力也明显增强，促进中华绒鳌蟹的生长。沈锦玉等 [10] 也发现，灭活嗜水气单胞菌可提高SOD、PO和LZM等酶的活性，其中注射免疫较口服免疫对蟹的免疫保护率更高，达75%。Zhigang Yang等 [11] 研究发现口服嗜水气单胞菌灭活疫苗可诱导中华绒鳌蟹细胞免疫和抗原特异性抗体应答，有效保护中华绒鳌蟹免受气单胞菌感染，海藻酸盐微粒可作为中华绒鳌蟹口服气单胞菌疫苗的候选载体体系。Itami等 [12] 以肽聚糖投喂日本对虾(Penaeus japonicus)发现可以促进对虾生长。Kono和Sakai [13] 分析认为注射肽聚糖可以诱导牙鲆(Paralichthys olivaceus)肾脏巨噬细胞激活蛋白1-α前体基因的表达，从而激活巨噬细胞的吞噬作用。朱卫卫等 [14] 发现凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)受肽聚糖免疫刺激后，肝胰腺组织中酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(ALP)活力显著提高，可增强对虾机体内免疫功能，进而增强抵抗外源病害的能力。
本研究旨在探讨饲料中添加不同水平的肽聚糖对中华绒螯蟹生长性能、血清抗氧化机能的影响，并对其进行副溶血弧菌注射感染实验，探究饲喂含肽聚糖饲料的中华绒螯蟹对外源病害的抵抗能力，为中华绒螯蟹免疫增强剂的开发和利用提供基础理论依据。
2. 材料与方法
2.1. 养殖试验系统
室外养殖系统位于天津市西青区畜牧水产养殖试验示范基地(天津，西青)。养殖用网箱为PVC材质，网箱上下底直径约1 m、高1.5 m。每个养殖单元设有独立的进水口和排水口，养殖尾水经沉淀区、增氧曝气区等环节处理后，再重新回到养殖单元使用。试验期间，每周对养殖网箱清理1次。养殖期间水质监测结果为：水温26℃ ± 3℃、溶氧8 mg/L、pH8.1~8.3、氨氮小于0.2 mg/L、亚硝酸盐小于0.005 mg/L、硫化物小于0.005 mg/L。
2.2. 试验蟹和试验饲料
试验用蟹为天津市某规模化中华绒螯蟹苗种培育场。选取初始规格为30 g左右的中华绒螯蟹幼蟹，用浓度为0.3 mg/L聚维酮碘浸泡3 min后，在室内养殖系统中集中暂养1周后进行分组。本试验设置饲料中添加62.5 mg/kg肽聚糖组、125 mg/kg肽聚糖组、250 mg/kg肽聚糖组共3个试验处理组和1个未添加肽聚糖作为对照组，每个处理组设置3个重复。在饲料制作过程中，各原料按配比定量后混合均匀，然后加入适量的水揉匀，经双螺杆挤条机(华南理工大学研制的F-Ⅲ (26)型)加工成2.5 mm × 8.0 mm的颗粒状饲料，并在40℃烘干至饲料水分含量为10%左右。实验饲料中使用的肽聚糖由BioTech公司生产。共挑选规格整齐、表观健康、游动活跃的幼蟹360只，体质量平均为(32.7 ± 1.4) g，随机放养于12个养殖网箱中，每个网箱各30只实验蟹，按体质量3%设置饲料投喂量。正式养殖试验持续42 d，其中，3个处理组分别以连续投喂7天添加特定含量肽聚糖的基础饲料和7天基础饲料为1个投喂周期，对照组在养殖期间始终投喂基础饲料；一天2次的投喂时间分别为8:00和18:00，每14 d对实验蟹进行称重、测量甲长和甲宽、调整饲料投喂量。
试验选用的中华绒螯蟹配合饲料购自天津某水产饲料公司，基础饲料基本营养组成实测值为：粗蛋白37.3%、粗脂肪10.6%、粗灰分5.6%、赖氨酸1.8%。
2.3. 采样与检测
在养殖第14 d、28 d、42 d随机采集3个处理组和1个对照组中各3只实验蟹的肝胰腺样品，按照1:9体积比加入0.85%生理盐水进行匀浆，于4℃1500 rpm离心30 min，吸取上清液于离心管中，分装后置于液氮冷冻保存，上清液用做酶活力的测定。按照南京建成酶活试剂盒说明书使用酶标仪(TECAN)进行实验蟹肝胰腺样品总蛋白含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LZM)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(ALP)酶活测定，按其标准步骤，在96孔酶标板中加样，用酶标仪进行微量测定，样品及试剂的加样量为标准步骤加样量的1/10；100 μl粗酶液在37℃与底物作用30 min产生1 mg酚定义为一个单位。用Bradford法测定粗酶液中的蛋白浓度。酶活力定义为每克蛋白所含的单位。
2.4. 免疫保护效果实验
随机选择1.2中养殖42 d实验蟹各30只于室内水族箱(88 cm × 50 cm × 73 cm)中，对实验蟹投喂不同含量肽聚糖饲料7 d后，用浓度为106 CFU/mL副溶血弧菌注射实验蟹第三步足基部，注射量0.1 mL/只，对照组注射无菌生理盐水，剂量同免疫组，饲养水温26℃~27℃，记录各组攻毒后16 d的死亡情况，计算相对免疫保护率。攻毒所用的副溶血弧菌菌株由本实验室分离保存，将菌株于28℃扩大培养后，以灭菌生理盐水洗脱，计数，然后稀释到实验所需浓度。
2.5. 指标计算
本试验相关指标计算公式如下：
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2.6. 数理统计方法
用SPSS统计软件分对所得数据进行方差分析和显著性检验，若差异显著，则进行Tukey多重比较，显著性水平为p < 0.05。
3. 结果
3.1. 生长指标
经过42 d养殖试验，中华绒螯蟹幼蟹整体随着饲料中肽聚糖添加量的提高，实验蟹甲长、甲宽、体质量、增重率(WG)、特定生长率(SGR)、存活率(SR)均呈先升后降趋势(表1)。125 mg/kg肽聚糖组中实验蟹以上6项指标达到最大；投喂未添加肽聚糖的对照组实验蟹以上指标均为最小值。
Table 1. Difference of growth indices of Eriocheir sinensis for groups
表1. 中华绒螯蟹生长指标差异
3.2. 肝胰腺组织酶活指标
使用含肽聚糖饲料喂养中华绒螯蟹42 d后，各处理组中华绒螯蟹肝胰腺组织中蛋白浓度的测定结果见图1。各处理蛋白浓度随时间呈缓慢递增趋势；与对照组相比，125 mg/kg肽聚糖组和250 mg/kg肽聚糖组的蟹蛋白浓度第42天最高(p < 0.05)，且高于250 mg/kg肽聚糖组；62.5 mg/kg肽聚糖组呈现先缓慢递增，之后无明显递增趋势。各处理组中华绒螯蟹肝胰腺组织SOD活力与对照组相比(图2)，62.5 mg/kg肽聚糖组、125 mg/kg肽聚糖组和对照组随时间呈递减趋势，第14天时达到峰值(p < 0.05)；250 mg/kg肽聚糖组呈先升后降趋势，第28天时达到峰值(p < 0.05)，且125 mg/kg肽聚糖组峰值高于其它组。各处理组中华绒螯蟹肝胰腺组织LZM活力均呈递减趋势(图3)，且125 mg/kg肽聚糖组均显著高于同时间段内其它组(p < 0.05)。各处理组中华绒螯蟹肝胰腺组织ALP活力显示(图4)，62.5 mg/kg肽聚糖组、125 mg/kg肽聚糖组和对照组呈先降后增趋势，250 mg/kg肽聚糖组呈递增趋势。各处理组中华绒螯蟹肝胰腺组织ACP活力均呈递增趋势，至第42天时达极值(图5)，且125 mg/kg肽聚糖组均显著高于同时间段内其它组(p < 0.05)。
Figure 1. Effect of peptidoglycan on protein concentration of Eriocheir sinensis
图1. 肽聚糖对中华绒螯蟹蛋白浓度的影响
Figure 2. Effect of peptidoglycan on SOD activity of Eriocheir sinensis
图2. 肽聚糖对中华绒螯蟹SOD活力的影响
Figure 3. Effect of peptidoglycan on LZM activity of Eriocheir sinensis
图3. 肽聚糖对中华绒螯蟹LZM活力的影响
Figure 4. Effect of peptidoglycan on ALP activity of Eriocheir sinensis
图4. 肽聚糖对中华绒螯蟹ALP活力的影响
Figure 5. Effect of peptidoglycan on ACP activity of Eriocheir sinensis
图5. 肽聚糖对中华绒螯蟹ACP活力的影响
3.3. 攻毒感染实验
含肽聚糖实验饲料喂养中华绒螯蟹42 d后，进行副溶血弧菌注射感染实验，感染期间各组存活率的统计结果见图6。对照组感染后，第2天即出现死亡情况，10 d内死亡率急剧增加，第11天减缓，第14天达到平稳期，16 d内的存活率仅有10%。而各实验组在第3天出现死亡，16 d内的存活率分别为22.20%、44.40%和20%。通过计算处理组相对免疫保护率，62.5 mg/kg肽聚糖组、125 mg/kg肽聚糖组、250 mg/kg肽聚糖组的相对免疫保护率分别为13.56%、38.22%、11.11%。
Figure 6. Survival rate of Eriocheir sinensis challenged with Vibrio parahaemolyticus in 16 days
图6. 副溶血弧菌感染16 d内中华绒螯蟹存活率
4. 讨论
甲壳动物作为无脊椎动物，缺乏脊椎动物所具有的特异性免疫功能，其免疫反应依赖于非特异性免疫机制。非特异性免疫能力、机体抗病能力是衡量甲壳动物非特异性免疫能力的重要指标。中华绒螯蟹具有非特异性免疫能力已经被诸多学者所证明，这为非特异性免疫制剂在中华绒螯蟹中发挥作用提供了生理基础和条件。
本实验中，饲喂不同肽聚糖含量的中华绒螯蟹生长指标均存在明显变化，投喂未添加肽聚糖饲料的中华绒螯蟹在42 d养殖周期后呈现最小的甲长、甲宽、体质量、增重率、特定生长率和存活率，而添加肽聚糖后其生长性能均有不同程度的改善，其中，肽聚糖添加量为125 mg/kg处理组中华绒螯蟹各项指标最优，说明饲料中添加适量肽聚糖可改善中华绒螯蟹的生长性能，这与张春晓等 [15] 经过8周生长实验，在饲料中适量添加肽聚糖可促进大黄鱼(Larimichthys crocea)生长、提高特定生长率、降低饲料系数的实验结果相类似。关于肽聚糖促进生长的最适添加量，不同研究者得到不同的结论，这可能与实验对象的种类、肽聚糖的纯度和来源不同有关。关于肽聚糖促生长的机理目前仍未有确切结论。有关哺乳动物研究表明，肽聚糖可以诱导体内一氧化氮产生，一氧化氮可通过调节胃黏膜血流量及促进胃粘液分泌起到黏膜保护作用，有利于溃疡愈合；同时一氧化氮能促进和调节胃酸和胃蛋白酶分泌，提高硬要物质利用率，从而达到促生长作用。但对水产动物促生长的机理是否与一氧化氮有关仍不清除，有待进一步证实。
刘春晓 [16] 研究发现用肽聚糖对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)进行肌肉注射，注射后发现SOD活力显著提高。周进等 [17] 用肽聚糖添加量3840 mg/kg的饲料投喂牙鲆(Paralichthys olivaceus)，发现牙鲆血细胞吞噬能力、血清溶菌酶活力和替代途径补体活力显著提高。张璐 [18] 等研究发现在饲料中添加500 mg/kg肽聚糖可以显著提高鲈鱼(Perca fluviatilis)白细胞的吞噬指数、血清溶菌酶活力和替代途径补体活力，并且随着鲈鱼白细胞吞噬指数、血清溶菌酶和替代途径补体活力的显著上升。陈国福等 [19] 研究发现肽聚糖不但能显著提高牙鲆(Paralichthys olivaceus)肝脏内的ACP活性，并能显著提高肾脏及心脏的ALP活性。本研究中，饲料中添加125 mg/kg肽聚糖显著提高了中华绒螯蟹肝胰腺组织中蛋白浓度、ALP活力和ACP活力，中华绒螯蟹对副溶血弧菌的抵抗能力也显著增强。中华绒螯蟹为较低等的无脊椎动物，其特异性免疫机制非常不完善，因此，非特异性免疫在蟹类的免疫防御中具有较为重要的作用。本研究结果显示，不同肽聚糖添加量下中华绒螯蟹感染副溶血弧菌后的存活率明显不同，对照组的存活率最低，饲料中添加肽聚糖对中华绒螯蟹存活率有明显的改善。研究表明饲料中添加肽聚糖可提高中华绒螯蟹非特异性免疫力，增强其对外源病害的抵抗能力。这与Boonyaratpalin等 [20] 对斑节对虾(Penaeus monodon)的研究结果相类似，该研究结果表明斑节对虾口服肽聚糖后，显著增强了斑节对虾吞噬细胞的吞噬活性，提高了斑节对虾生长速度和成活率；与谢警鸿等 [21] 等对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)研究结果相类似，该研究结果表明对饲喂含肽聚糖饲料的凡纳滨对虾注射一定浓度的溶藻弧菌，凡纳滨对虾可抵抗溶藻弧菌感染，并认为机体免疫力高低与肽聚糖添加量在一定范围内呈正比关系。
本研究条件下，饲料中添加适量的肽聚糖可以提高中华绒螯蟹幼蟹的生长性能，提高机体非特异性免疫能力、抗菌能力。综合饲料中肽聚糖含量对中华绒螯蟹幼蟹生长及免疫的影响，中华绒螯蟹幼蟹饲料中肽聚糖建议添加量为125 mg/kg。说明肽聚糖是一种有效的免疫增强剂，随着不断深入的研究，免疫增强剂有望得到进一步的开发和应用，降低了中华绒鳌蟹等淡水养殖品种的发病率，实现养殖产业的可持续发展。
基金项目
本研究受天津市科技计划项目(22YFZCSN00200)资助。
NOTES
*第一作者。
#通讯作者。