1. 前言
土壤是现代农业生产的基础和基地，然而随着时代的快速发展，农田中的重金属含量急剧上升。《全国土壤污染状况调查公报》于2014年公布，其中重金属镉(Cd)污染点位超标率高达7.0%，居调查污染物之首，污染程度高达0.5% [1] 。2013年湖南“镉大米”事件，在国内造成了极坏的影响，甚至在一定程度上引发了居民恐慌 [2] 。水稻生长在受Cd污染的土壤中，若吸附Cd元素过量会导致毒害症状，影响根系生长和吸收水分、营养物质，最终导致粮食减产 [3] [4] 。因此，Cd污染水稻等粮食作物是不可轻视的食品安全问题。
纳米材料是粒径1 nm~100 nm的纳米结构材料。TiO2-NPs具有优异的光催化活性、稳定性高、无毒等特点。这些优点使其被广泛运用在污水处理、涂料等领域 [5] [6] 。但TiO2-NPs是一把双刃剑，它们在发挥其优点的同时，也可能对周围环境和人类健康产生负面影响。TiO2-NPs 在大气、水体和土壤环境中易迁移和传递，可能会破坏或损伤生态系统中的个体、群体甚至整个生态系统 [7] 。薛永来等发现，纳米二氧化钛可以促进水稻幼苗根系产生活性氧(ROS)，并通过干扰抗氧化体系过度生成ROS，造成氧化损害，从而影响水稻的生长发育 [8] 。王一翔通过对三角褐指藻TiO2-NPs的毒性实验，发现TiO2-NPs能明显地抑制其生长 [9] 。
前人的研究大多是关注纳米材料、重金属对生物体的单一毒性效应。近年来，TiO2-NPs与Cd联合作用的研究逐渐被大家所关注。TiO2-NPs可以减少Cd对水稻、小麦和玉米的毒害，增加叶绿素含量、促进生长与光合作用以及提高植物生物量 [10] [11] [12] 。也有研究表明，TiO2-NPs与镉、铜、铅等重金属共同作用增强了毒性。目前对纳米材料与重金属的研究，主要集中在两者共同作用产生的环境效应，很少有研究深入到不同粒径、不同浓度方面。本研究通过分析不同粒径、不同浓度的TiO2-NPs对Cd胁迫下农作物(水稻)光合特性及镉、钛富集的影响，探寻TiO2-NPs与Cd的单一及联合效应。
2. 材料和方法
2.1. 试验材料
试验用土采自天津市宁河区某稻田土壤(0~20 cm)，土壤pH 8.28，阳离子交换量65.6 cmol∙kg−1，有机质含量20.14 g∙kg−1，Cd含量0.08 mg∙kg−1。土样自然风干后去除杂物，过筛备用。供试水稻品种为“津原89”(由天津市宁河良种场提供)，不同粒径金红石型纳米二氧化钛均购自上海阿拉丁公司。
2.2. 试验方法
将自然风干土壤用密封的摇匀机将尿素(75 g)、磷酸二氢钾(55 g)与50 kg过筛后的稻田土壤混合均匀，装于1.2 m ´ 0.5 m的塑料种植箱。不同粒径、浓度金红石型纳米二氧化钛的试验设置见表1，外加一个空白组以及单一Cd胁迫(30 mg/kg)处理，共计20个处理组。
Table 1. Test settings of rutile nano-titanium dioxide with different particle size and concentration
表1. 不同粒径、浓度金红石型纳米二氧化钛试验设置
采用逐级放大法将金红石型纳米二氧化钛引入土壤中，混合均匀1小时后，Cd胁迫组慢慢滴入CdCl2溶液，继续机械搅拌使其混合均匀后浓度为30 mg/kg。空白对照组按相同的方法加入等量水进行搅拌。
处理完的土壤转移至种植箱内平衡1个月后进行水稻幼苗移栽。选择大小、生长一致的三叶一心幼苗移栽，每箱种植40株，每隔2 d浇一次水，保持水面没过土壤3 cm左右。在处理40 d时，测定其叶绿素含量和光合特性；并采集水稻样品，分别对水稻样品不同器官(根、叶)进行烘干、研磨，保存于密封塑料袋中备用。
2.3. 指标测定
本研究利用SPAD 502叶绿素仪测叶绿素含量(SPAD值)，利用LI-6800光合仪测定水稻净光合速率、蒸腾速率、胞间CO2浓度和气孔导度。
采用微波消解法对水稻样品进行前处理，利用岛津ICPMS-2030测定水稻根和叶的镉、钛含量。精确称取水稻样品0.5 g (精确至0.001 g)于微波消解仪中，加入6.0 mL浓硝酸，浸泡4小时，再加2.0 mL浓盐酸，在微波消解仪中消解15分钟，消解结束后在通风厨中打开盖子，并放入赶酸仪中进行赶酸至无烟气冒出，取出冷却，用蒸馏水定容至50 mL，过滤，备用。按同样消解方法做空白试验。用镉标准溶液、钛标准溶液配制标准系列。根据岛津ICPMS-2030的操作程序，测定空白溶液、样品溶液、镉标准曲线和钛标准曲线。
2.4. 数据处理
运用WPSExcel整理数据，使用SPSS 26.0对相关数据进行单因素方差分析，用Duncan检验进行平均数间差异显著性比较(显著水平0.05)。
镉迁移率(%) = 水稻叶中镉含量/水稻根中镉含量 × 100%
钛迁移率(%) = 水稻叶中钛含量/水稻根中钛含量 × 100%
3. 结果分析与讨论
3.1. 不同粒径、不同浓度金红石型纳米二氧化钛对镉胁迫下水稻叶绿素的影响
3.1.1. 不同粒径金红石型纳米二氧化钛对镉胁迫下水稻叶绿素的影响
不同粒径的金红石型TiO2-NPs对水稻叶绿素含量的影响见图1。如图1(A)所示，当金红石型TiO2-NPs浓度20 ppm时，金红石型TiO2-NPs单一处理条件下，粒径25 nm、粒径40 nm与CK组没有显著性差异。但粒径100 nm与CK组有显著性差异。单一Cd处理组与CK组也没有显著性差异。Cd与金红石型TiO2-NPs联合作用，均与CK组有显著性差异，且SPAD值显著降低，对叶绿素含量影响较大。
如图1(B)所示，当金红石型TiO2-NPs浓度50 ppm时，呈现出Cd与金红石型TiO2-NPs联合作用时，与CK组有显著性差异。两者联合毒性增强，对水稻叶绿素含量影响较大。如图1(C)所示，当金红石型TiO2-NPs浓度100 ppm时，粒径25 nm、粒径40 nm金红石型TiO2-NPs单一处理组，依然与CK组没有显著性差异，但粒径100 nm处理组与CK有显著性差异，其SPAD值显著降低。Cd胁迫下粒径25 nm、粒径40 nm、粒径100 nm处理组与CK组均存在显著性差异，且叶绿素含量显著降低。
不同粒径金红石型纳米二氧化钛对水稻叶绿素的影响呈现：不同粒径金红石型TiO2-NPs单一处理、Cd单一处理对水稻叶绿素影响较小；Cd与金红石型TiO2-NPs联合作用对水稻叶绿素影响较大。浓度20 ppm时，随着粒径的增加，Cd与金红石型TiO2-NPs联合毒性增强。浓度100 ppm时，随着粒径的增加，Cd与金红石型TiO2-NPs联合毒性降低。
注：CK：空白组，Cd：Cd单一处理组，S25、S40、S100：粒径分别为25 nm、40 nm、100 nm的金红石型TiO2-NPs单一处理组，S25C、S40C、S100C：粒径分别为25 nm、40 nm、100 nm的金红石型TiO2-NPs与Cd联合处理组。
Figure 1. Effect of rutile type nano-titanium dioxide with different particle sizes on chlorophyll content of rice (A: 20 ppm, B: 50 ppm, C: 100 ppm)
图1. 不同粒径的金红石型纳米二氧化钛对水稻叶绿素含量的影响(A: 20 ppm, B: 50 ppm, C: 100 ppm)
3.1.2. 不同浓度金红石型纳米二氧化钛对镉胁迫下水稻叶绿素的影响
不同浓度的金红石型TiO2-NPs对水稻叶绿素含量的影响见图2。如图2(A)、图2(B)所示，当金红石型TiO2-NPs粒径25 nm、40 nm时，浓度20 ppm、50 ppm、100 ppm的金红石型TiO2-NPs单一处理处理组与CK组均没有显著性差异；但三个浓度金红石型TiO2-NPs与Cd联合处理组与CK组均有显著性差异，SPAD值也显著降低，加强对水稻叶绿素的毒害作用。如图2(C)所示，当金红石型TiO2-NPs粒径100 nm时，仅浓度50 ppm的金红石型TiO2-NPs单一处理组与CK组没有显著性差异，浓度20 ppm、100 ppm单一处理组均与CK组有显著性差异，且叶绿素含量显著降低。Cd与金红石型TiO2-NPs联合作用下，三个处理组均与CK组有显著性差异，且SPAD值显著降低。
不同浓度的金红石型TiO2-NPs对水稻叶绿素的影响呈现：不同浓度金红石型TiO2-NPs、Cd的单独施用对水稻叶绿素影响较小；Cd与金红石型TiO2-NPs联合作用对水稻叶绿素影响较大。粒径25 nm、40 nm时，随着浓度的增加，Cd与金红石型TiO2-NPs联合毒性增强。粒径100 nm时，随着浓度的增加，Cd与金红石型TiO2-NPs联合毒性减弱。
注：CK：空白组，Cd：Cd单一处理组，RT20、RT50、RT100：浓度分别为20 ppm、50 ppm、100 ppm的金红石型TiO2-NPs单一处理组，RT20C、RT50C、RT100C：浓度分别为20 ppm、50 ppm、100 ppm的金红石型TiO2-NPs与Cd联合处理组。
Figure 2. Effect of different concentration of rutile type titanium dioxide on chlorophyll content of rice (A: 25 nm, B: 40 nm, C: 100 nm)
图2. 不同浓度的金红石型纳米二氧化钛对水稻叶绿素含量的影响(A: 25 nm, B: 40 nm, C: 100 nm)
叶绿素是植物光合作用的物质基础，其含量高低决定作物光合作用水平的高低，叶绿素破坏与降解可直接导致光合作用效率的降低，进而影响光合同化物的合成使植物长势减弱，生长量和产量降低 [13] 。在研究不同粒径对叶绿素影响时，对于金红石型TiO2-NPs单一处理，3个浓度下粒径25 nm、40 nm对水稻叶绿素含量影响是较小的，甚至还可以促进水稻叶绿素的含量，如浓度50 ppm、粒径40 nm处理组。但粒径100 nm对水稻叶绿素含量影响较大，尤其是浓度100 ppm、粒径100 nm的处理组SPAD降至28.9。说明随着金红石型TiO2-NPs粒径浓度的升高，对水稻叶绿素逐渐影响增大。单一Cd处理下水稻的叶绿素增加。范铭 [14] 等人研究发现，Cd2+处理对洋甘菊幼苗叶绿素含量有促进作用。Cd与金红石型TiO2-NPs的联合作用，对水稻叶绿素毒性增强，其中影响最大的是浓度100 ppm、粒径25 nm的处理组，SPAD值低至20.8。不同浓度对水稻叶绿素的影响与不同粒径的很相似，金红石型TiO2-NPs、Cd的单独施用对水稻叶绿素影响较小；Cd与金红石型TiO2-NPs联合作用对水稻叶绿素影响较大。粒径25 nm、40 nm时，随着浓度的增加，Cd与金红石型TiO2-NPs联合毒性增强。粒径100 nm时，随着浓度的增加，Cd与金红石型TiO2-NPs联合毒性减弱。
不同粒径、不同浓度对水稻叶绿素的影响都呈现：高浓度，小粒径的Cd与金红石型TiO2-NPs联合作用毒性增强，对水稻叶绿素的影响较大。刘爽等人研究表明 [15] ，二氧化钛颗粒大小越小，越容易穿过细胞壁进入细胞，同时由于物理上的阻碍，导致细胞壁的孔隙缩小，从而影响细胞的正常生理机能，从而抑制其生长。
3.2. 不同粒径、不同浓度金红石型纳米二氧化钛对镉胁迫下水稻光合特征的影响
3.2.1. 不同粒径金红石型纳米二氧化钛对镉胁迫下水稻光合特征的影响
表2显示的是不同粒径是否Cd胁迫下的金红石型TiO2-NPs (RT)对水稻胞间CO2浓度、蒸腾速率、气孔导度、净光合速率的影响。与CK相比，3个浓度所有不同粒径处理组的蒸腾速率、气孔导度有所升高，但与CK差异不显著；3个浓度所有不同粒径处理组的胞间CO2浓度，除Cd胁迫下浓度50 ppm、粒径100 nm的RT处理与CK差异显著外，其他处理组与CK均没有显著差异，但均低于CK。
单一Cd处理的净光合速率高于CK。RT浓度20 ppm时，CK组与粒径40 nm是否加Cd两个处理组均有显著性差异。两个处理组的净光合速率显著降低，其中金红石型TiO2-NPs单一处理对净光合速率影响较大。RT浓度为50 ppm时，仅粒径25 nm金红石型TiO2-NPs单一处理组与CK组有显著性差异。RT浓度为100 ppm时，CK组与粒径40 nm是否加Cd两个处理组均有显著性差异，粒径40 nm金红石型TiO2-NPs单一处理组的净光合速率显著降低。
综上，不同粒径下无论是单一Cd处理、金红石型TiO2-NPs的单一处理及两者联合处理均对水稻蒸腾速率、气孔导度有促进作用。对于水稻净光合速率、胞间CO2浓度有抑制作用，其中金红石型TiO2-NPs单一处理对水稻净光合速率影响最大，低浓度20 ppm、粒径40 nm处理组对净光合速率抑制作用最显著。
Table 2. Effects of different particle sizes of rutile type titanium dioxide on photosynthetic indices of rice
表2. 不同粒径的金红石型纳米二氧化钛对水稻光合指标的影响
注：不同字母表示不同处理平均数间差异显著，下同。
3.2.2. 不同浓度金红石型纳米二氧化钛对镉胁迫下水稻光合特征的影响
表3显示的是不同浓度是否Cd胁迫下的金红石型TiO2-NPs对水稻胞间CO2浓度、蒸腾速率、气孔导度、净光合速率的影响。与CK组对照，3个粒径不同浓度所有处理组蒸腾速率、气孔导度提高，但与CK组均没有显著性差异；3个粒径不同浓度所有处理组胞间CO2浓度值比CK组低，但与CK组没有显著性差异。
相比其他三个指标与CK组的没有显著性差异，净光合速率在3个粒径不同浓度下与CK组表现出不一样的显著性。粒径25 nm时，CK组与单一 Cd处理组、Cd胁迫下浓度50 ppm处理组没有显著性差异，但浓度50 ppm金红石型TiO2-NPs单一处理与CK组有显著性差异。粒径40 nm时，与浓度20 ppm、50 ppm、100 ppm金红石型TiO2-NPs单一处理三个处理组与CK组均有显著性差异，且这些组的净光合速率显著降低。粒径100 nm，CK组也与浓度50 ppm金红石型TiO2-NPs单一处理有显著差异。综上，不同浓度无论是单一Cd处理、金红石型TiO2-NPs的单一处理与两者联合处理均对水稻蒸腾速率、气孔导度有促进作用。但对于水稻净光合速率、胞间CO2浓度有抑制作用，金红石型TiO2-NPs单一处理对水稻净光合速率的抑制作用最明显，其中粒径40 nm、浓度20 ppm处理组对净光合速率抑制作用最大。
Table 3. Effects of different concentrations of rutile type titanium dioxide on photosynthetic indices of rice
表3. 不同浓度的金红石型纳米二氧化钛对水稻光合指标的影响
生理指标是反映植物吸收光能的最全面的指标 [11] ，本研究中不同粒径、不同浓度的条件下，水稻蒸腾速率、气孔导度逐步提高；但净光合速率、胞间CO2浓度显著降低的。李博等 [16] 用TiO2-NPs处理髯毛箬竹，发现TiO2-NPs能显著提高气孔导度和蒸腾速率，缓解光合“午休”现象。本研究结论与上述研究一致，即单一金红石型TiO2-NPs处理，改善水稻的光合作用。本试验条件下单一Cd胁迫提高了水稻净光合速率，这与本研究使用的镉浓度(30 mg/kg)较低有关。有研究表明，低浓度的镉对于耐性强的品种的生长有促进作用。金红石型TiO2-NPs与Cd共同作用对水稻净光合速率影响较小。影响胞间CO2浓度变化的因素很多，林兵等人 [17] 研究发现胡杨的胞间CO2浓度与气孔导度、净光合速率和蒸腾速率呈负相关。本研究也发现，胞间CO2浓度随气孔导度、蒸腾速率增加而降低，但净光合速率与胞间CO2不呈负相关。
3.3. 不同处理条件下水稻中镉、钛富集情况
3.3.1. 不同处理条件下水稻中镉的富集情况
浓度50 ppm不同粒径金红石型TiO2-NPs处理下水稻不同部位镉和钛含量见表4。由表4可知，与CK组相比，单加金红石型TiO2-NPs处理，粒径25 nm、40 nm、100 nm均使水稻根部的Cd含量降低，叶部的Cd含量也同样低于CK组的Cd含量。说明单加金红石型TiO2-NPs处理水稻样品，可以降低不同部位的Cd含量。当金红石型TiO2-NPs与Cd两者联合处理时，水稻中的根、叶部Cd含量均高于CK组与Cd单一处理组。说明金红石型TiO2-NPs与Cd两者联合毒性增强。但随着粒径增大，水稻根、叶部Cd含量逐渐降低。说明金红石型TiO2-NPs与Cd两者联合处理条件下，粒径越小，更容易进入水稻内部。
不同粒径金红石型TiO2-NPs处理对水稻镉迁移率的影响见图3。由图3可以看出，与CK组对比，单加金红石型TiO2-NPs处理的3个处理组，粒径25 nm、40 nm的迁移率低于CK组，粒径100 nm的迁移率高于CK组。说明金红石型TiO2-NPs单一处理，更有利于Cd从根部向叶部的迁移，且粒径100 nm时Cd迁移率最高。单加Cd、Cd与金红石型TiO2-NPs联合处理四个处理组的Cd迁移率很低，说明不利于Cd向水稻叶部的迁移，Cd普遍在根部富集。
Table 4. Cadmium and titanium contents in different parts of rice treated with rutile TiO2-NPs of different particle sizes (mg/kg)
表4. 不同粒径金红石型TiO2-NPs处理下水稻不同部位的镉、钛含量(mg/kg)
Figure 3. Cadmium mobility of rice treated with rutile TiO2-NPs of different particle sizes
图3. 不同粒径金红石型TiO2-NPs处理水稻镉迁移率
3.3.2. 不同处理条件下水稻中钛的富集情况
由表4可知，与CK组相比，单加金红石型TiO2-NPs处理，粒径25 nm、40 nm、100 nm均使水稻根部的Ti含量增加，叶部的Ti含量也同样高于CK组的Ti含量。说明单加金红石型TiO2-NPs处理水稻样品，可以增加不同部位的Ti含量。当金红石型TiO2-NPs与Cd两者联合处理时，粒径25 nm处理组根、叶的Ti含量都高于CK组的Ti含量。粒径40 nm、粒径100 nm处理组叶部Ti含量均高于CK组，但根部的Ti含量低于CK组，其中粒径40 nm根部含量最低，但叶部含量最高。说明粒径的大小会影响金红石型TiO2-NPs进入水稻根部。
不同粒径金红石型TiO2-NPs处理对水稻钛迁移率的影响见图4。由图4可以看出，与CK组相比，Cd单一处理、金红石型TiO2-NPs单一处理、Cd与金红石型TiO2-NPs联合处理所有处理组的Ti迁移率均大于CK组Ti迁移率。金红石型TiO2-NPs单一处理的3个处理组中粒径40 nm的Ti迁移率最高。Cd与金红石型TiO2-NPs联合处理中的3个处理组中也是粒径40 nm的Ti迁移率最高。说明粒径40 nm有利于Ti由根部向叶部的迁移。
Figure 4. Titanium mobility of rice treated with rutile TiO2-NPs of different particle sizes
图4. 不同粒径金红石型TiO2-NPs处理水稻钛迁移率
金红石型TiO2-NPs单一处理均使水稻根部镉含量降低，有研究表明，TiO2-NPs使环境中污染物浓度降低，达到“消减”的效果。Cd与金红石型TiO2-NPs共同作用，相比单一Cd处理，水稻根部镉含量增加。两种联合后毒性增强，水稻根部的镉含量显著提高。水稻根部Cd积累远远高于叶片部分，这是因为土壤中Cd离子可以通过水稻根部的表皮细胞空隙以及根表皮细胞膜上的运输蛋白进入植株体内，而根是最容易吸收和积累Cd的器官 [18] 。Cd与金红石型TiO2-NPs联合作用下，Cd的迁移率低于金红石型TiO2-NPs单一处理，可能与Cd和Ti离子之间存在竞争作用，从而降低了Cd从根部到叶部的迁移，迁移率也相应降低。
目前尚缺乏有关钛的定性问题，没有任何资料证明钛是植物生长必需的养分，也没有关于钛对生物有害的证据。当钛为有益元素时，对植物生长代谢过程起着重要作用。钛可以提高叶片对光能吸收和叶片中叶绿素含量、增强植物抗性、促进种子萌发等作用 [19] 。而本研究中金红石型TiO2-NPs对水稻的叶绿素、净光合速率、胞间CO2浓度产生了抑制作用。不同处理条件下，金红石型TiO2-NPs在根部的富集显著大于叶部，这可能与钛铁氧化物胶膜粘附在水稻根系有关。金红石型TiO2-NPs单一处理的Ti迁移率均小于Cd与金红石型TiO2-NPs联合处理的Ti迁移率，说明两者联合处理有利于Ti从根部向叶部的迁移。
4. 结论
本试验不同浓度、不同粒径金红石型纳米二氧化钛对镉胁迫下水稻光合特征及镉、钛富集的影响，对比分析不同浓度、不同粒径金红石型纳米二氧化钛对镉胁迫下水稻叶绿素、光合指标的变化及镉、钛富集情况，得出以下结论：
1) 不同粒径、不同浓度的金红石型TiO2-NPs对水稻叶绿素含量影响非常相似。金红石型TiO2-NPs单一处理下对水稻叶绿素含量影响较小，随着金红石型TiO2-NPs浓度的升高，对水稻叶绿素影响增大。单一Cd处理，促进水稻叶绿素含量，SPAD值升高。高浓度、小粒径金红石型TiO2-NPs与Cd联合作用对水稻叶绿素影响较大。
2) 不同粒径、不同浓度金红石型TiO2-NPs单一处理、单一Cd处理、两者联合处理下，水稻叶片蒸腾速率、气孔导度升高；净光合速率、胞间CO2浓度显著降低。
3) 水稻中根部镉含量远大于叶片镉含量，说明镉主要在根部富集。Cd与金红石型TiO2-NPs联合作用会降低Cd的迁移率。水稻中根部钛含量远大于叶片，Cd与金红石型TiO2-NPs联合处理可以提高Ti的迁移率。
项目基金
国家重点研发计划(2022YFD1901500/2022YFD1901505)。
NOTES
*通讯作者。