circRNA在胰腺癌中的研究进展

Research Progress of circRNA in Pancreatic Cancer

摘要: 胰腺癌是一种高度致死的癌症类型，目前各种针对胰腺癌的治疗手段效果十分有限，其预后通常很差，因此，寻找新的治疗策略为改善胰腺癌患者的总体生存期至关重要。近年来，circRNA作为一类相对较新的RNA分子，其具有稳定性和广泛表达、功能多样等特点，众多研究显示circRNA在肿瘤与正常组织之间存在异常表达，并通过调控基因表达以及多种信号通路等作用机制，在肿瘤细胞的增殖、转移、耐药、免疫等生物学过程中扮演了重要的角色，成为肿瘤领域的研究热点之一。在胰腺癌的研究中，关于circRNA相关的研究也取得了一些进展，许多研究结果揭示了在胰腺癌的发生和发展中circRNA发挥了重要的调控作用。本综述对circRNA在胰腺癌领域近几年来的研究进展进行总结归纳，为胰腺癌的诊断与治疗提供新的见解。

Abstract: Pancreatic cancer is a highly lethal malignant tumor, and the current therapeutic approaches for pancreatic cancer have very limited effects, and its prognosis is usually poor, therefore, it is crucial to find new therapeutic strategies to improve the overall survival of pancreatic cancer patients. In recent years, circRNA, as a relatively new class of RNA molecules, has the characteristics of stability and wide expression, and diverse functions. Numerous studies have shown that circRNA is aber-rantly expressed between tumors and normal tissues, and plays an important role in the biological processes of tumor cell proliferation, metastasis, drug resistance, and immunity by regulating gene expression and various signaling pathways. It has become one of the hotspots of research in the field of oncology. In the study of pancreatic cancer, some progress has been made on circR-NA-related studies, and many findings have revealed that circRNA plays an important regulatory role in the development and progression of pancreatic cancer. This review summarizes the research progress of circRNA in the field of pancreatic cancer in recent years and provides new insights for the diagnosis and treatment of pancreatic cancer.

1. 引言

胰腺癌是一种在全球范围内发病率和致死率都相对较高的恶性肿瘤，其发病率在不同国家有明显的差异，尤其是在发达国家，胰腺癌的发病率普遍高于发展中国家 [1] 。据全球癌症数据统计显示，2020年胰腺癌在全球范围内新诊断病例数约为49万，在所有恶性肿瘤新诊断病例中占比约2.6%，因胰腺癌死亡的人数约46万，在所有因恶性肿瘤死亡病例数中占比4.7%，胰腺癌发病率在全球恶性肿瘤发病率中排行在第12位，但其死亡率高居于全球恶性肿瘤死亡率的第7位 [2] 。胰腺癌的发病率逐年以0.5%~1%的速度逐渐增加，预计到2030年，胰腺癌将成为美国癌症相关死亡的第二大原因 [3] 。在中国，每年胰腺癌的发病率和致死率也在逐年增长，2016年我国新发胰腺癌病例数在我国常见癌症发病率中排第11位，死亡率早常见癌症中排名第7位 [4] 。胰腺癌的高死亡率给全世界国家带来了巨大的社会和经济负担。由于胰腺癌的早期症状隐匿，临床中还没有能用于胰腺癌早期筛查和诊断的方法 [5] ，早期常常可能被忽视或误诊，大部分患者在出现临床症状后被确诊时，疾病已处于晚期阶段，常伴随着淋巴结、血管、神经、远处器官的转移 [6] ，因而失去手术时机。然而，手术切除目前仍是胰腺癌主要治疗方法 [7] ，虽然，随着医学的发展开发了很多新的辅助治疗方法，其预后仍没有明显改善，总体5年存活率仍然只有8%左右 [8] 。因此，胰腺癌的早期诊断和有效治疗是提高胰腺癌生存率的关键，也是一直以来困扰众多研究人员和临床医生的世界难题。

近年来，随着分子生物学技术的发展，开发出很多高新技术，如高通量测序和大数据分析技术，越来越多的研究开始关注基因组学方面的作用。近10年来，有大量的研究揭示了基因与各种疾病之间的关系以及它们之间相互作用，尤其是在肿瘤领域方面 [9] ，随着RNA测序技术和生物信息学的进步，各类非编码RNA逐渐出现在各个领域中发挥了各种作用，特别在肿瘤领域中，异常表达的非编码RNA参与肿瘤发生、发展等生物学过程中的各种重要信号通路的调节，被认为是潜在的癌症驱动因子和肿瘤抑制因子，具有成为癌症新的诊断标志物和治疗靶点的潜能 [10] ，引起了众多研究人员的注意，成为生物医学领域的热门话题之一。非编码RNA的种类繁多，微小RNA (miRNA)、长链RNA (lncRNA)、转运RNA (tRNA)、环状RNA (circRNA)、与PIWI 相互作用RNA (piRNA)、假基因等 [11] 。最近几年，大量的研究发现circRNA在各类肿瘤中异常表达，并通过不同的分子机制和调节各种信号通路来影响肿瘤的生物学过程，如肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭以及血管生成等 [12] 。多项研究结果也表明了circRNA在胰腺癌中产生重要影响，其通过不同的分子机制与多种信号通路的调节参与胰腺癌细胞增殖、细胞凋亡、肿瘤侵袭、化疗耐药性和免疫逃逸等生物学过程 [13] 。circRNA多样且强大的功能受到广泛关注，是研究胰腺癌分子机制的热点之一。本文将对circRNA及其在胰腺癌领域的研究进展进行简要综述。

2. circRNA的概述

环状RNA (circRNA)是一类较晚出现及被认识的非编码RNA分子。是它们的5’端和3’端通过共价键连接，形成环状分子结构而不是常见的线性结构 [14] ，由于这种独特的结构，不易被核酸内切酶降解，使circRNA具有高度的稳定性和相对较长的半衰期 [15] 。最开始于在20世纪70年代初在研究植物病毒时被作为类病毒报道 [16] ，最初被认为是错误剪切过程中产生的无功能产物 [17] ，后来随着RNA研究技术提升，大量的circRNA在各种生物体内被发现 [18] ，包括在哺乳动物、植物、原核生物、病毒等体内广泛存在。大多数circRNA是来源于前体mRNA (pre-mRNA)通过反向剪切而形成 [19] ，circRNA的形成机制尚未完全清楚，现有的研究揭示了三种主要成环机制：1) 外显子跳跃或套索驱动的环化、2) 直接反向剪接或内含子配对驱动的环化、3) RNA结合蛋白(RBP)介导的环化 [20] [21] [22] 。根据来源及组成不同主要分为3种：外显子circRNA (exonic circRNA, ecircRNA)、内含子circRNA (circular intronic RNA, ciRNA)和外显子–内含子circRNA (EIciRNA) [14] 。circRNA的功能多样，目前对它的了解还处于探索阶段，先有的研究揭示了它的主要的功能有：1) 作为miRNA的“海绵”，充当竞争性内源性RNA (ceRNA)来调节miRNA [23] ，这是最为经典且被多数研究所证实的一种功能。有很多circRNA存在不同类型和数量的miRNA反应元件(MREs)，通过MREs与miRNA特异性结合，从而降低miRNA的生物活性，从而解除miRNA对下游靶基因的抑制，使靶基因表达上调 [24] 。例如：Hansen等 [24] ，观察到的circRNACDR1as含有miR-7的多个结合位点，通过影响miR-7的活性来发挥作用。2) 调控基因转录，有一些circRNA可以直接或间接的参与转录过程的调节，如外显子–内含子来源得circRNA (EIciPAIP2和EIciEIF3J)，可与U1小核糖核蛋白(snRNP)结合，然后进一步与RNA聚合酶II (RNA pol II)相互作用来影响亲本基因的转录 [25] 。3) 与蛋白质相关作用，circRNA与RNA结合蛋白(PBP)结合而发挥作用，如cir-Foxo3可以与P21、CDK2结合形成circ-Foxo3-p21-CDK2三元复合物诱导细胞周期停滞 [26] 。有多项研究发现 circRNA对蛋白质具有多种不同调节的作用，如改变蛋白质与蛋白质之间作用，招募蛋白质到染色质中、约束和隔离蛋白质等 [18] 。3) 在早前，通常认为circRNA缺乏5’端帽和polyA尾结构是一种没有翻译功能的非编码RNA，但最近有研究证据表明，circRNA可以不依赖帽结构进行蛋白质或多肽的翻译 [27] ，可通过内部核糖体进入位点(IRES)、m6内部核糖体进入位点(MIRES)或通过滚环扩增(RCA)等机制进行启动翻译 [28] 。总之，circRNA的功能丰富多样，尽管有部分circRNA及其生物学功能被揭示，但仍有大量的circRNA及其复杂多样作用仍然未知。目前的很多研究已揭示了circRNA在各种疾病中产生了重要的影响，特别在肿瘤方面，包括胰腺癌在内，circRNA影响肿瘤增殖、侵袭、凋亡以及化疗耐药性等各种生物学过程 [29] ，在胰腺癌的诊断和治疗以及预后评估等方面也有很大的潜能。

3. circRNA在胰腺癌中的研究

3.1. circRNA在胰腺癌细胞中的表达

有很多研究通过先进的RNA测序技术证实了circRNA在胰腺癌和正常组织中存在的显著的差异表达，且通过各种分子机制影响胰腺癌细胞的各种生物学过程。最早在2016年时，Li [30] 研究团队通过RNA微阵列技术分析了6例胰腺癌及癌旁组织样本，发现了在胰腺癌中差异表达的351个circRNA，其中209个circRNA表达上调，142个circRNA表达下调，并通过实时荧光定量聚合酶链反应技术(qRT-PCR)随机验证了7个circRNA，结果与微阵列芯片数据分析结果一致。微阵列芯片表达谱数据已上传登记在Gene Expression Omnibus (GEO)数据库中(GEO编号：GSE69362)。随后，Guo [31] 利用Arraystar Human circRNA阵列分析了20例胰腺癌组织和相应的癌旁组织，结果显示有128个上调的circRNA和161个下调的circRNA，其中有部分circRNA与Li的研究所得到的结果相同。芯片结果也提交到了GEO数据中，编号为GSE79634。在最近的研究中，Wong等 [32] 通过高通量技术对非肿瘤人胰腺导管上皮细胞(HPDE)、PADC细胞PANC-1和SW1990进行circRNA测序得到了它们之间差异表达的circRNA，在胰腺癌细胞和肿瘤之间有169个差异表达的circRNA，测序结果也保存于GEO数据库中，编号(GSE135731)。此外，该研究团队还通过进一步的实验探究了circFOXK2在胰腺癌中的作用，他们发现circRNA通过RNA结合蛋白和吸附miR-942共同作用来促进胰腺癌的进展 [32] ，为胰腺癌的发生、发展的分子机制提供了新的见解。circRNA在胰腺癌中的见解。这些研究结果表明了大量的circRNA存在于胰腺癌细胞中，并发挥了重要的作用。

3.2. circRNA促进胰腺细胞的增殖

circRNA主要通过结合miRNA可以间接或直接影响下游靶基因或通过其他调控机制在胰腺癌中发挥作用。多数研究主要通过该经典机制进行了研究。Meng团队 [33] 对97例胰腺癌和相对应的癌旁组织进行测序circSTX6 (hsa_circ_0007905)在胰腺癌组织中表达显著上调，circSTX6是来源于STX6基因外显子的circRNA，该团队通过进一步细胞及动物实验进行探究，结果表明上调的circSTX6通过结合miR-449b-5p影响下游肌球蛋白或非肌肉肌球蛋白重链9 (MYH9)的表达，促进的胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。同时在研究中发现circSTX6与RNA结合蛋白CUL2结合调控HIF1A，从而调节MYH9的转录，进而影响癌细胞的增殖。在胰腺癌细胞中circRNA ciRS-7的上调，导致miR-7活性下降，导致下游EGFR基因和STAT3信号通路的激活进而促进胰腺癌增殖 [34] 。Guo团队 [35] 在研究中发现了一种来源于BFAR外显子基因2的circBFAR，并通过实验证实了其在胰腺癌细胞中过度表达，并吸附miR-34b-5p从而上调间充质上皮转化因子(MET)的表达，进一步激活了PI3K/Akt通路从而促进了胰腺癌的进展。Su等 [36] 通过体外细胞和动物实验证实了上调的circSFMBT1 (hsa_circ_0066147)通过抑制miR-330-5p的表达水平，继而使PAK1通路激活促进胰腺癌细胞增殖和侵袭能力。此外还有大量的研究表明多种circRNA通过不同的作用机制来调控胰腺癌细胞的生长。

3.3. circRNA作为胰腺癌的新型诊断标志物

circRNA相比较线性RNA，具有较好的稳定性、组织特异性且高度保守等特点 [37] ，由于这些特性，circRNA可能成为新的胰腺癌生物的标志物。例如 circ-LDLRAD3 (hsa_circ_000698)在胰腺癌组织和血浆中显著增高，其表达水平与胰腺癌的静脉浸润、淋巴转移显著相关，若联合CA19-9可以提高诊断的特异性和敏感性 [38] ，具有作为胰腺癌早期诊断以及反映肿瘤侵袭力的新型生物标志物的潜力。在一项研究中，研究者通过RNA测序对大量的胰腺癌组织样本进行测序和分析，新发现了一个来源于12号染色体的circRNA，命名为circPDAC，通过实验发现，circPDAC在胰腺癌患者组织细胞和血清中表达上调，在正常细胞和血清中几乎不表达 [39] 。circ_0030235在胰腺癌细胞株和胰腺癌组织中明显上调，且与临床分期、淋巴结转移相关，通过Kaplan-Meier法对circ_0030235高表达组和低表达组的胰腺癌病例进行生存分析，发现circ_0030235表达越高的胰腺癌患者总体生存时间越短，通过多变量COX回归分析后结果表明circ_0030235可作为评估患者总体生存期不佳的独立预后指标 [40] 。最近的一个纳入了48篇关于circRNA与胰腺癌相关文献的mata分析，这项研究的目的在于探究有哪些circRNA在胰腺癌中具有临床意义，如预后相关、诊断标记等，通过分析发现，一组由6个上调的circRNA的组合对胰腺癌预后评估有较大的价值，在这些上调circRNA的胰腺癌病例中预后较差，且这些circRNA的表达水平与临床特征相关，如：肿瘤分化差、神经、血管侵犯，淋巴结转移、TMN分期较晚等 [41] 。

3.4. circRNA影响胰腺癌细胞化疗耐药性

一直以来，吉西他滨药物(GEM)是胰腺癌的一线化疗药物，但由于耐药率高，使胰腺癌的治疗效果受到很大的限制。有多项研究表明，有多种circRNA与胰腺癌对滨耐药性有着密切的联系。有研究通过分析GEM耐药细胞株和GEM敏感性细胞株中得circRNA微阵列表达谱，分别有26个上调的circRNA和55个下调的circRNA，进一步分析发现这些circRNA可能与MAPK和mTOR信号通路相关 [42] 。在Liu [43] 等人通过研究发现 CircHIPK3 (hsa_circ_0000284)在GEM耐药的胰腺癌组织和2两种GEM耐药细胞株中显著表达，上调的CircHIPK3通过抑制mir-330-5p调节靶基因RASSF1的上调影响了胰腺癌细胞对GEM的耐药性。另外一项研究中 [44] ，研究者联合了来自临床样本的测序数据和GEO数据进行交叉分析后筛选到了一种未报道的circRNA (hsa_circ_0078297)，并命名为circMTHFD1L，通过进一步实验研究，发现circMTHFD1L作为海绵吸附miR-615-3p，上调RPN6的表达，从而增强DNA损伤修复机制导致胰腺癌细胞对GEM的耐药性增加。此外，在该研究还观察到若下调circMTHFD1L，联合GEM和奥拉帕尼(olaparib)两种化学药物，可以使肿瘤细胞对药物的敏感性增加。最近的研究中，Hu等 [45] 研究了一种来源于癌症相关成纤维细胞(CAF)中的circFARP1 (hsa_circ_0002557)，发现过表达的circFARP1通过结合CAV1和吸附miR-660-3p两种分子途径共同上调了白血病抑制因子(LIF)的表达从而增强胰腺癌细胞的耐药性，也是首次发现circRNA通过协同作用影响LIF的生物学现象。

3.5. circRNA在胰腺癌治疗中的研究

目前circRNA作为RNA分子被应用于胰腺癌治疗的研究尚处于空白，但有多项研究结果表明circRNA可能是胰腺癌潜在的治疗靶点，在治疗方面有着巨大的潜力。Shi等 [46] 通过胰腺癌细胞和动物模型实验研究发现circANAPC7是一种新的肿瘤抑制因子，circANAPC7可以通过结合miR-373上调下游靶基因PHLPP2，PHLPP2可以介导AKT去磷酸化而被激活，然后下调细胞周期蛋白D1 (CyclinD1)的表达，可以抑制胰腺癌细胞的增殖。CyclinD1是调控细胞周期中重要的因子，可以促进细胞的增殖，在各种类型的肿瘤中常常过度表达，促进肿瘤的进展 [47] 。该研究的成果为开发胰腺癌新的治疗方法提供了新靶点和思路。此外，circNFIB1 (hsa_circ_0086375)在胰腺癌癌组织中表达降低，在正常组织中高表达，circNFIB1作为吸附miR-486-5p海绵，使PIK3R1上调，从而限制了PI3K/Akt通路的激活进而导致VEGF-C的表达降低，最终抑制胰腺癌的淋巴转移 [48] ，总而言之，circNFIB1上调可以抑制胰腺癌的淋巴结转移。此前已有研究证实了Circ-MBOAT2 (has_circ_0007334)在胰腺癌组织和细胞中表达上调 [49] ，Zhou等 [50] 进一步研究了Circ-MBOAT2在胰腺癌中的作用，通过他们的细胞实验发现若下调Circ-MBOAT2可以让与它结合的靶miR-433-3p上调(miR-433-3p是一种可以抑制多种癌细胞的生长的抗癌基因 [51] )进而阻碍谷氨酸–草酰乙酸转氨酶1 (GOT1)的活性，进而抑制胰腺癌细胞的增殖、侵袭和谷氨酰胺的代谢。总之，这些研究证据表明circRNA在胰腺癌的发生和发展中有着重要的影响，通过调控circRNA分子的表达水平，可以在一定程度上影响胰腺癌的发生和发展，circRNA可能成为胰腺癌治疗的新靶点。

4. 总结与展望

circRNA的功能十分广泛，其中最重要的功能之一是作为miRNA的海绵吸附miRNA调控下游靶基因的表达，从而影响细胞增殖和凋亡，调节细胞迁移和侵袭等生物学过程。circRNA在胰腺癌中的研究已经取得了一些进展，有些研究结果揭示了circRNA在胰腺癌中的作用机制，大多数上调circRNA通过各种调控机制作用促进胰腺癌细胞的增殖，导致胰腺癌的进展，如能开发出在体内靶向circRNA的方法使其改变活性，可以逆转它促进肿瘤细胞增殖或耐药等作用，从而改善胰腺癌的预后。尽管有部分circRNA 的功能和作用在研究中被证实，但circRNA的数量庞大且功能复杂多样，目前对circRNA的认识仍只是冰山一角，仍然有大量的circRNA的功能和其与疾病之间相互作用的机制还未知，因此，深入研究circRNA在胰腺癌发生和发展中的具体作用机制，可以为胰腺癌的治疗和早期诊断提供更为有效的策略和方法，具有巨大的应用价值。

基金项目

海南省卫生健康行业科研项目(编号：20A200204)。

参考文献

NOTES

^*通讯作者。